miR-30a靶向Beclin1蛋白在結(jié)腸癌中的作用及其機制*

劉林，孟濤，雷程，楊新輝，王海江

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 胃腸外科，新疆 烏魯木齊 830011)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤，據(jù)統(tǒng)計每年全世界CRC發(fā)病人數(shù)約120萬，大約有60萬人因此喪命[1-2]，我國CRC人群的死亡率在十年間已經(jīng)增加了63.4%[3]，而導(dǎo)致CRC患者死亡的主要原因是癌細胞發(fā)生轉(zhuǎn)移，但其具體的調(diào)控機制尚不十分清楚[4-5]。已有研究表明，有多種功能性miRNA在CRC病理進程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。miRNA是一類單鏈內(nèi)源性非編碼小分子RNA，通過與靶基因的3′UTR特異性結(jié)合，使mRNA降解或抑制蛋白質(zhì)翻譯過程，進而調(diào)控靶基因的蛋白表達水平[6]。目前已發(fā)現(xiàn)多種miRNAs可以參與到腫瘤細胞增殖、侵襲、凋亡和自噬等生物學(xué)行為[7-8]。細胞自噬(autophagy)是生物體內(nèi)存在的一種高度保守的代謝過程，主要通過吞噬細胞內(nèi)受損、衰老或失去功能的蛋白質(zhì)、或細胞器形成自噬泡，自噬泡可被溶酶體中的酶水解為細胞生存所必需的成分[9-10]。細胞自噬與腫瘤的生成和癌癥的發(fā)展有關(guān)，有實驗表明抑制細胞自噬可以恢復(fù)治療的敏感性，增加癌細胞的死亡[11-12]。機體的自噬過程需要多個自噬調(diào)節(jié)蛋白的參與，其中Beclin1可以介導(dǎo)其它自噬相關(guān)蛋白定位于自噬泡，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后及治療等方面發(fā)揮重要功能[13]。目前，有少數(shù)關(guān)于Beclin1在結(jié)腸癌細胞的生長和轉(zhuǎn)移中的相關(guān)研究，但關(guān)于結(jié)腸癌、miRNA和自噬之間相互作用的研究較少，因此本課題以結(jié)腸癌細胞為研究對象，采用MTT、流式細胞術(shù)和侵襲遷移實驗檢測miR-30a對結(jié)腸癌細胞增殖、凋亡、侵襲能力以及化療敏感性的影響，并采用雙熒光素酶實驗和Western blot等實驗驗證miR-30a對Beclin1的調(diào)控作用，為深入研究結(jié)腸癌中miR-30a的調(diào)控機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要材料與試劑

選取人結(jié)腸癌細胞株HCT116由新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院實驗室提供，miR-30a慢病毒表達載體GV369委托上海吉凱基因公司設(shè)計合成，Luc熒光素酶質(zhì)粒購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司(編號GV306)，轉(zhuǎn)染試劑由吉凱公司內(nèi)部配制。U6、miR-30a、Beclin1-WT及Beclin1-Mut引物由上海生工有限公司合成，DMEM(高糖)培養(yǎng)基、胎牛血清、MEM培養(yǎng)基、Lipo 2000陽離子脂質(zhì)體購自Invitrogen公司，兔抗Beclin1和兔抗GAPDH抗體購自Abgent公司，BCA蛋白定量試劑盒、RIPA裂解液、HRP標記羊抗兔二抗購自南京碧云天生物公司，Trizol購自TaKaRa公司，質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生化科技有限公司，SYBR Green PCR Kit購自Qiagen公司，基底膜基質(zhì)凝膠Matrigel購自美國BD公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 人結(jié)腸癌細胞系HCT116使用含有10%小牛血清D的MEN培養(yǎng)液在37 ℃含有5% CO2的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，按照ATCC說明書建議方式操作，取指數(shù)生長期的細胞用于實驗。

1.2.2慢病毒的獲得 使用三載體系統(tǒng)生產(chǎn)病毒，轉(zhuǎn)染前先培養(yǎng)293T細胞至指數(shù)生長期，用胰蛋白酶消化后重懸至細胞密度為1×109/L，重新接種于6孔細胞培養(yǎng)皿置于細胞培養(yǎng)箱備用；按照說明書配置質(zhì)?；旌弦?20 μg GV369-miR-30a或GV369-NC、15 μg pHelper 1.0和10 μg pHelper 2.0)；加入5% Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑3 mL到293T細胞，常規(guī)培養(yǎng)12 h；棄去培養(yǎng)基，用4 ℃預(yù)冷的PBS洗2次，更換DMEM完全培養(yǎng)基，置于細胞培養(yǎng)箱；24 h后收集細胞上清，經(jīng)微孔濾膜過濾及高速離心后得到病毒濃縮液。

1.2.3細胞感染及分組 參考文獻[14]，HCT-116細胞經(jīng)胰蛋白酶消化后接種到細胞培養(yǎng)6孔板，每孔105個細胞；次日細胞增殖至20%～30%密度進行轉(zhuǎn)染，用100 mg/L的polybrene稀釋病毒，加入到HCT-116細胞進行感染，常規(guī)培養(yǎng)12 h后，用完全培養(yǎng)基更換掉原培養(yǎng)基；常規(guī)培養(yǎng)3 d，加入嘌呤霉素(終濃度為2 mg/L)進行篩選，對細胞計數(shù)，統(tǒng)計感染效率。將篩選得到的能夠穩(wěn)定轉(zhuǎn)染GV369-miR-30a和GV369-NC的HCT-116細胞分別命名為miR-30a和NC。實驗設(shè)置空白對照組CON(未經(jīng)病毒感染的HCT-116細胞)、陰性細胞組NC(轉(zhuǎn)染GV369-NC的HCT-116細胞)、陽性細胞組miR-30a(轉(zhuǎn)染GV369-miR-30a的HCT-116細胞)，每組分別用5 μmol/L奧沙利鉑注射液處理或不處理。

1.2.4細胞中目的基因檢測 HCT-116細胞在消化后，用Trizol提取細胞內(nèi)的總RNA，并對RNA的純度及濃度進行測定，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行cDNA的合成，反應(yīng)程序：37 ℃，12 min；84 ℃，6 s。應(yīng)用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)方法檢測各組細胞中目的基因的表達水平，采用2-ΔΔCt法、U6為內(nèi)參基因進行相對定量，每組實驗重復(fù)3次，引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 Primer sequences of qRT-PCR

1.2.5細胞增殖實驗 將空白對照組CON、NC組和miR-30a組細胞分別制備成懸液(密度為2×107/L)，分別取100 μL加入到96孔板的每個孔里，每孔加入5 g/L的MTT溶液10 μL，孵育4 h；細胞變成紫黑色后吸取培養(yǎng)基，PBS清洗3次后置于顯微鏡下觀察，記數(shù)。

1.2.6Transwell遷移實驗 用BD公司的Matrigel 1 ∶8稀釋制備凝膠，HCT-116細胞經(jīng)胰蛋白酶消化后，用MEM培養(yǎng)基清洗3次，再用含BSA的無血清培養(yǎng)基重懸至5×108/L；每個小室加100 μL細胞懸液，取600 μL培養(yǎng)基(含有20%FBS)加入到24孔板下室，37 ℃培養(yǎng)24 h；棄去培養(yǎng)液，用PBS(經(jīng)37 ℃預(yù)熱)清洗3次，再加入4%多聚甲醛(經(jīng)37 ℃預(yù)熱)固定30 min；PBS清洗3次，將小室晾干；每孔加入0.1%結(jié)晶紫染色20 min，用棉簽擦去小室內(nèi)未遷移的細胞，置于顯微鏡下觀察并記數(shù)。

1.2.7流式細胞術(shù) 參考文獻[14]，將處于指數(shù)生長期的HCT-116細胞用胰蛋白酶進行消化，用MEM完全培養(yǎng)液調(diào)節(jié)細胞懸液濃度為109/L，加入預(yù)冷的75%乙醇進行細胞固定，震蕩混勻后室溫靜置10 min；去除75%乙醇，用預(yù)冷的PBS溶液清洗3次，震蕩混勻后室溫靜置10 min；將HCT-116細胞重懸于binding buffer，加入Annexin-V-FITC(40 mg/L)1 μL，混勻后避光在冰上靜置15 min；加入RNA酶輕輕震蕩混勻，室溫靜置5 min后，將HCT-116細胞轉(zhuǎn)移到流式檢測管中，向其中加入的PBS 500 μL，上機前加入PI(100 mg/L)0.5 μL，注意避光操作。

1.2.8靶基因預(yù)測、載體構(gòu)建與鑒定 參考文獻[14]，從miRBase數(shù)據(jù)庫查找miR-30a序列，獲取其前體和成熟體的RNA序列；使用PicTar、TargetScan、miRanda等生物信息學(xué)軟件對miR-30a的靶基因進行預(yù)測，結(jié)合文獻獲得的信息，最終選定Beclin1開展研究。miR-30a能夠與Beclin1的基因編碼3′UTR區(qū)的位點特異性結(jié)合，為了進一步驗證上述的預(yù)測結(jié)果，委托生物公司構(gòu)建了含有野生型Beclin1(Beclin1-WT)和3′UTR區(qū)突變的Beclin1(Beclin1-Mut)的熒光素酶報告基因載體。

1.2.9雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?通過Lipo2000將psi-CHECK-Beclin1-WT、psi-CHECK-Beclin1-Mut分別和GV369-miR-30a或GV369-NC共轉(zhuǎn)染到HCT-116細胞中，置于培養(yǎng)箱6 h后換完全培養(yǎng)基；48 h后，去除培養(yǎng)基，用PBS洗滌，加入RIPA裂解液后用槍頭吹打，低溫離心后轉(zhuǎn)移上清；使用DLRTM系統(tǒng)檢測各組細胞中螢火蟲(photinus pyralis)熒光素酶和海腎(renilla reniformis)熒光素酶活性，最終以上述2種熒光素酶的熒光強度的比值來代表細胞的熒光強度。

1.2.10Western blot 各組細胞去除培養(yǎng)液后加入RIPA細胞裂解液(含有PMSF 1 μL和蛋白酶抑制劑 1 μL)裂解，分別提取總蛋白；根據(jù)BCA法測定蛋白濃度，沸水浴煮5 min后離心取上清上樣；電泳分離后，將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜，用封閉液(5%奶粉)室溫封閉2 h；加入一抗anti-Beclin(1 ∶2 000)或anti-GAPDH(1 ∶2 000)，4℃振蕩過夜；TBST洗10 min(3次)，加入HRP標記的二抗，室溫振蕩1 h，TBST洗3次后進行化學(xué)發(fā)光顯影。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1慢病毒感染結(jié)腸癌細胞的效率

觀察miR-30a組和NC組細胞，可見約80%以上的HCT-116細胞呈現(xiàn)綠色熒光，表明miR-30a慢病毒載體感染成功(圖1A)。qRT-PCR結(jié)果顯示，miR-30a組細胞的miR-30a表達水平明顯高于NC組，表達豐度是NC組的1 408倍,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001，圖1B)。

注：A為慢病毒感染的HCT-116細胞的效率檢測；B為慢病毒感染HCT-116細胞后miR-30a的表達水平；(1)與NC組比較，P<0.001。圖1 轉(zhuǎn)染后HCT116細胞中miR-30a的表達水平Fig.1 Expression level of miR-30a in HCT116 cells after transfecting

2.2miR-30a過表達抑制結(jié)腸癌細胞的增殖能力

MTT細胞增殖抑制實驗結(jié)果表明，與空白對照組和NC組相比，miR-30a組的HCT-116細胞增殖能力受到顯著抑制，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；在加入奧沙利鉑注射液后，各組細胞的增殖能力更加顯著被抑制，而與對照組相比，miR-30a過表達的細胞對奧沙利鉑注射液的敏感性增強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

注：1、2、3、4、5及6分別為空白對照組、NC組、miR-30a組、對空白對照組用奧沙利鉑處理、NC組用奧沙利鉑處理及miR-30a組奧沙利鉑處理；(1) 與NC組相比，P<0.05。圖2 miR-30a過表達對HCT-116細胞增殖能力的影響Fig.2 Effect of miR-30a over-expression on the proliferation of HCT116 cells

2.3miR-30a過表達抑制結(jié)腸癌細胞的遷移能力

細胞遷移實驗結(jié)果表明，無論是否用奧沙利鉑注射液處理，miR-30a組HCT-116細胞在血清的誘導(dǎo)下遷移通過聚碳酸酯膜的數(shù)量顯著低于空白對照組和NC組細胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而在加入奧沙利鉑注射液后，3組細胞的遷移能力進一步下降，而miR-30a組細胞的遷移能力仍低于兩個對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

2.4miR-30a過表達對HCT116細胞凋亡的作用

流式細胞術(shù)的檢測結(jié)果顯示，空白對照組HCT116細胞的凋亡比例為(1.80±0.17)%，陰性對照組為(1.82±0.05)%，二者間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；miR-30a組細胞凋亡比例為(3.86±0.09)%，與2個對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。加入奧沙利鉑注射液后，miR-30a組細胞凋亡比例顯著增加至(18.24±0.56)%，顯著高于對照組細胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖4。

2.5雙熒光素酶報告系統(tǒng)

如圖5所示，與對照組相比(Beclin1-WT + NC)，Beclin1-WT和miR-30a共表達導(dǎo)致熒光素酶的活性顯著下降，熒光活性下降(28.2%±4.1)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而當(dāng)Beclin1-Mut與miR-30a共表達并不能顯著影響熒光素酶的活性，與Beclin1-Mut + miR-30a相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

注：1、2、3、4、5及6分別為空白對照組、NC組、miR-30a組、對空白對照組用奧沙利鉑處理、NC組用奧沙利鉑處理及miR-30a組奧沙利鉑處理；(1) 與NC組相比，P<0.05。 圖3 miR-30a過表達對HCT-116細胞遷移能力的影響Fig.3 Effect of miR-30a over-expression on migration of HCT116 cells

注：1、2、3、4、5及6分別為空白對照組、NC組、miR-30a組、對空白對照組用奧沙利鉑處理、NC組用奧沙利鉑處理及miR-30a組奧沙利鉑處理；與NC組相比，(1) P<0.01。圖4 miR-30a表達對HCT116細胞凋亡的作用Fig.4 Effect of miR-30a expression on apoptosis of HCT116 cells

2.6miR-30a過表達對Beclin1 基因mRNA和蛋白表達的影響

qRT-PCR結(jié)果顯示，與空白對照組和NC相比，miR-30a組的Beclin1表達水平顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。在加入奧沙利鉑注射液后，各組細胞的Beclin1表達均出現(xiàn)增加，奧沙利鉑處理的NC組中Beclin1的表達量相較于處理前上升了(5.67±0.9)倍；奧沙利鉑處理的miR-30a組與NC組相比，Beclin1表達量下降了(34.5±6.8)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖6A。如圖6B所示，Western blot結(jié)果與RT-qPCR檢測結(jié)果一致：無論奧沙利鉑處理與否，與空白對照組和NC組相比，miR-30a組細胞中Beclin1蛋白的表達均下降；在加入奧沙利鉑注射液后，各組細胞中Beclin1蛋白表達量均出現(xiàn)增加。

注：A為Beclin1基因mRNA的相對表達水平，B為Beclin1蛋白的表達水平；1、2、3、4、5及6分別為空白對照組、NC組、miR-30a組、對空白對照組用奧沙利鉑處理、NC組用奧沙利鉑處理及miR-30a組奧沙利鉑處理；(1) 與NC組相比，P<0.01。圖6 Beclin1的mRNA和蛋白的表達水平Fig.6 Expression level of mRNA and albumen on Beclin1

3 討論

研究表明，miRNAs能夠調(diào)控多種癌細胞中特定基因的表達，也可直接作為癌基因或抑癌基因直接參與到腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，因此，miRNAs被認為是腫瘤治療的潛在靶分子[14-15]。有研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-612的膀胱癌細胞生長、增殖、侵襲能力會受到抑制，也會抑制EMT進程，進而抑制癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[16]；同樣發(fā)現(xiàn)miR-221/222也可以抑制腫瘤細胞EMT進程[17]。LncRNA NEAT1可以通過靶向miR-34a促進自噬，進而促進結(jié)腸癌細胞對5-氟尿嘧啶的抗性，而過表達miR-34a可以提高細胞的敏感性[18]。lncRNA-ROR可以通過抑制p53信號通路進而促進鼻咽癌細胞的增殖，遷移和藥物抗性[19]；也有研究表明miR-630可以抑制乳腺癌的發(fā)展[20]。

Beclin1，屬于酵母ATG6的同系物，是最早被鑒定為具有調(diào)控自噬的發(fā)生的蛋白，在惡性腫瘤中發(fā)揮了重要作用，被認為是具有抑癌功能的基因，可以誘導(dǎo)癌細胞發(fā)生自噬性死亡[21]。有研究表明miRNA可以通過靶向下調(diào)Beclin1的表達來增強癌細胞對化療的敏感性[22]，但是也有研究發(fā)現(xiàn)miRNA靶向調(diào)控Beclin1的過程與細胞增殖有關(guān)[23]。而本研究結(jié)果顯示，miR-30a的過表達可以下調(diào)Beclin1的表達水平，而奧沙利鉑則可以促進Beclin1蛋白的表達，并都可以同時抑制結(jié)腸癌細胞的增殖、侵襲及凋亡[14]，提示miR-30a/Beclin1有可能成為結(jié)腸癌治療的作用靶點。

綜上所述，本實驗表明在結(jié)腸癌細胞中過表達miR-30a，可以通過靶向下調(diào)Beclin1的表達來抑制癌細胞增殖，促進細胞凋亡，說明miR-30a有望成為結(jié)腸癌靶向治療的基因分子。