糞便菌群移植通過調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡發(fā)揮對帕金森小鼠的保護作用*

葉明, 張麗娜, 謝靜, 時鵬, 劉曉林

(蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，安徽 蚌埠 233004)

帕金森病(prkinson's disease，PD)是一種基底神經(jīng)節(jié)運動障礙性疾病[1-2]，其病因非常復雜[3-4]，通常在PD運動障礙癥狀出現(xiàn)之前PD患者腦內(nèi)黑質(zhì)致密部(substantia nigra pars compacta，SNpc)中多巴胺能神經(jīng)元就已經(jīng)丟失[5]，這一特征與其多因素病因相結合，阻礙了針對該疾病進展的適當療法的發(fā)展[6]。研究表明，Th17/Treg細胞功能的失衡可加重PD的進程[7]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，在運動障礙發(fā)生之前往往會伴隨便秘等胃腸道功能障礙[8]，提示PD的發(fā)生可能與糞便菌群失調(diào)相關。Zhou等[9]的研究證明，糞便菌群能夠通過增加PD小鼠的多巴胺(dopamine，DA)水平或功能而發(fā)揮其神經(jīng)保護作用，另有報道稱糞便菌群能調(diào)控Th17/Treg平衡[10]。因此，基于以上研究，本文擬通過采用糞便菌群移植治療PD小鼠，探討糞便菌群是否能夠通過調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡發(fā)揮對PD小鼠的神經(jīng)起保護作用，以期為臨床應用菌群移植法治療PD提供理論研究基礎和新方向。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要藥物與試劑 MPTP(阿拉丁試劑)、抗生素(美侖生物)，小鼠DA、5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)、白介素-17A(interleukin-17A，IL-17A)、白介素-22(interleukin-22，IL-22)、轉化生長因子(transforming growth factor β，TGF-β)、白介素-10(interleukin-10，IL-10)ELISA檢測試劑盒(武漢優(yōu)爾生)，Th17細胞特異性轉錄因子維甲酸相關孤兒受體(retinoid-related orphan nuclear receptor γt，RORγt)抗體(武漢博歐特)，BCA蛋白濃度測定試劑盒、全蛋白提取試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、羊抗兔IgG-HRP、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、Treg細胞特異性轉錄因子叉頭狀轉錄因子3(forkhead box protein 3，F(xiàn)oxp3)、β-actin抗體(萬類生物)，TRIpure、Super M-MLV反轉錄酶、RNase inhibitor、2×Power Taq PCR MasterMix(北京百泰克生物)，SYBR Green、抗熒光淬滅劑(北京，Solarbio)，PVDF膜(美國，Millipore)、預染蛋白分子量標準(加拿大，F(xiàn)ermentas)、脫脂奶粉(伊利實業(yè))、CD4熒光抗體(美國，NOVUS)、FOXP3熒光抗體(美國，Santa)、RORγt熒光抗體(美國，Thermo Fisher)，F(xiàn)ITC標記山羊抗小鼠IgG、FITC標記山羊抗兔及Cy3標記山羊抗大鼠IgG、DAPI(碧云天生物)。

1.1.2動物 6周齡健康雄性C57小鼠，體質(zhì)量(22±1)g(遼寧長生生物科技股份有限公司)。

1.1.3主要儀器 顯微鏡拍照系統(tǒng)(DP73，OLUMPUS)、顯微鏡(OLUMPUS，BX53)、水平搖床(WD-9405B，北京六一)、微量移液器(Proline，BIOHIT)、超純水系統(tǒng)(NW10LVF，Heal Force)、電泳儀(DYY-7C，北京六一)、轉移槽(DYCZ-40D，北京六一)、酶標儀(ELX-800，BIOTEK)、電熱恒溫培養(yǎng)箱(DH36001B，天津泰斯特)、真空干燥箱(DZF-6050，SYSBERY)、熒光定量PCR儀(Exicycler 96，BIONEER)、紫外可見分光光度計(上海佑科，型號UV752N)。

1.2方法

1.2.1實驗分組 將18只小鼠適應性喂養(yǎng)1周，晝夜各12 h，溫度(22±1)℃，濕度45%～55%，自由飲食。隨機均分為正常對照組、糞菌移植對照組、糞菌移植組，每組6只。

1.2.2制作PD模型 造模前9 d，后兩組小鼠每日予200 μL抗生素混合物(1 g/L桿菌肽+0.5 g/L慶大霉素+0.2 g/L環(huán)丙沙星+1 g/L新霉素+1 g/L青霉素+1 g/L甲硝唑+0.5 g/L頭孢他啶+0.5 g/L萬古霉素+2 g/L鏈霉素)灌胃，持續(xù)7 d后停止灌胃2 d。造模開始，將MPTP溶于無菌生理鹽水中按照每公斤體質(zhì)量20 g/10 L的劑量對糞菌移植組及移植對照組小鼠腹腔注射，每隔2 h注射1次，共4次，建立PD模型；正常對照組注射等量生理鹽水。

1.2.3糞便菌群移植 PD模型造模后第2天開始每日收集正常對照組小鼠的新鮮糞便顆粒，同天收集的所有糞便顆粒立即用無菌PBS(1個糞粒/mL)浸泡15 min，搖勻后4 ℃離心5 min，取懸浮液繼續(xù)離心洗滌，將最終的菌懸液以40 %無菌甘油稀釋至終濃度為20 %，每天取200 μL菌懸液(約含1011CFU/L)對糞菌移植組小鼠灌胃1次，共7 d。糞菌移植對照組采用等劑量PBS與甘油的混合物灌胃。

1.2.4行為學訓練 MPTP給藥后第5天，制作一個直徑為1 cm、長0.5 m并且頂端固定有一個直徑為2 cm的球形突起的桿，并且纏上紗布，桿豎直放置，小鼠頭朝下放到爬桿頂端的小球上進行爬桿訓練；將小鼠的前爪放在水平繩索上進行牽引訓練，每天1次，連續(xù)3 d。

1.2.5爬桿實驗評價各組小鼠行動能力 訓練完成后進行正式實驗，記錄小鼠從開始運動到返回桿底部的時間，對每只鼠進行3次實驗，每次間隔5 min，取平均值進行統(tǒng)計[9-11]。

1.2.6牽引實驗評價各組小鼠的肌肉力量及平衡能力 訓練完成后將小鼠的前爪放在水平繩索上觀察10 s，后肢的放置位置評分為1～4分，最低分表示最嚴重的缺陷。評分標準：動物用兩只后爪抓繩子的得4分，一只后爪抓繩子得3分，兩只前爪抓繩子得2分，一只前爪抓繩子為1分；每只小鼠進行3次實驗，每次間隔5 min，取平均值進行統(tǒng)計[9-11]。

1.2.7實驗取材 行為學實驗完成后，處死各組小鼠，收集外周血分離血清、同時取小鼠紋狀體組織及SNpc進行后續(xù)實驗。

1.2.8檢測小鼠SNpc中ROR-γt、Foxp3 mRNA的表達 采用Real-time PCR，收集各組小鼠SNpc組織樣本，提取總RNA、測定RNA濃度及純度；并反轉錄成cDNA，以cDNA為模板，β-actin為內(nèi)參，按照下述體系及條件進行相對定量檢測：體系為cDNA 1 μL，上下游引物各0.5 μL，2×Taq PCR MasterMix 10 μL，SYBR GREEN 0.3 μL，dd H2O補足至20 μL；反應條件為94 ℃ 5 min，94 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)后，于72 ℃ 2 min 30 s，40 ℃ 1 min 30 s。引物序列如表1所示。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.2.9SNpc中ROR-γt、Foxp3蛋白的表達 采用Western blot，按照全蛋白提取試劑盒說明書提取樣本總蛋白，測定蛋白濃度后，按照蛋白條帶大小配置濃縮膠與分離膠行SDS-PAGE電泳，電壓80 V，恒壓電泳2.5 h；轉膜后用脫脂奶粉封閉，然后一抗4 ℃孵育過夜，二抗37 ℃孵育45 min。行ECL底物發(fā)光后暗室曝光，之后行抗體剝脫，再次封閉后孵育內(nèi)參抗體，ECL底物發(fā)光后暗室曝光，最后將所有膠片進行掃描后分析目標條帶的光密度值。

1.2.10紋狀體中DA、5-HT及外周血與SNpc中IL-17A、IL-22、IL-10、TGF-β的表達 分別按照試劑盒說明書步驟檢測小鼠紋狀體中DA、5-HT及外周血與SNpc中IL-17A、IL-22、IL-10、TGF-β的含量。

1.2.11SNpc中Th17/Treg細胞的表達 制備SNpc組織樣本石蠟切片后行免疫熒光雙染色，將切片經(jīng)脫蠟至水進行抗原修復，采用CD4、Foxp3、RORγt熒光抗體共同4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育90 min后進行DAPI染細胞核，最后滴加抗熒光淬滅劑，蓋玻片封片。于熒光顯微鏡下觀察染色效果，于400×鏡下拍照。

1.3統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1爬桿實驗和牽引實驗結果

爬桿實驗結果顯示，糞菌移植對照組小鼠的運動能力明顯降低，較正常對照組小鼠返回到桿底部的時間明顯延長(P<0.01)；與糞菌移植對照組比較，糞菌移植組小鼠完成爬桿實驗的時間明顯縮短(P<0.01)，見圖1。牽引實驗結果表明，糞菌移植對照組小鼠較正常對照組小鼠得分明顯降低(P<0.01)；與糞菌移植對照組比較，糞菌移植組小鼠的得分增加(P<0.01)，見圖2。

注：(1)與正常對照組比較，P<0.01；(2)與糞菌移植對照組比較，P<0.01。圖1 各組小鼠爬桿實驗結果Fig.1 Results pole-climbing test in each group

注：(1)與正常對照組比較，P<0.01；(2)與糞菌移植對照組比較，P<0.01。圖2 各組小鼠牽引實驗結果Fig.2 Results traction test in each group

2.2SNpc中ROR-γt、Foxp3 mRNA表達

與正常對照組小鼠相比，糞菌移植對照組小鼠SNpc中ROR-γtmRNA和蛋白表達水平明顯上調(diào)(P<0.01)；但與糞菌移植對照組相比，糞菌移植組小鼠ROR-γtmRNA和蛋白的表達明顯下調(diào)(P<0.01)。與正常對照組小鼠相比，糞菌移植對照組小鼠SNpc中Foxp3 mRNA表達水平明顯下調(diào)(P<0.01)；與糞菌移植對照組小鼠相比，糞菌移植組小鼠Foxp3 mRNA及蛋白表達明顯上調(diào)(P<0.01)，見圖3和圖4。

注：(1)與正常對照組比較，P<0.01；(2)與糞菌移植對照組比較，P<0.01。圖3 各組小鼠SNpc中Foxp3及RORγt mRAN的表達Fig.3 Expression of Foxp3 and RORγt mRNA in SNpc of each group

2.3紋狀體中DA與5-HT含量

如圖5所示，與正常對照組相比，糞菌移植對照組小鼠紋狀體內(nèi)DA及5-HT的含量明顯降低(P<0.01)；與糞菌移植對照組相比，糞菌移植組小鼠紋狀體內(nèi)DA及5-HT的含量明顯升高(P<0.01)。表明糞便菌群移植對PD具有一定的保護作用。

注：(1)與正常對照組比較，P<0.01；(2)與糞菌移植對照組比較，P<0.01。圖4 各組小鼠SNpc中Foxp3及ROR-γt蛋白表達Fig.4 Expression of Foxp3 and ROR-γt protein in SNpc of each group

2.4外周血及SNpc中IL-17A、IL-22、IL-10及TGF-β含量

與正常對照組相比，糞菌移植對照組小鼠的外周血及SNpc中Th17細胞相關促炎細胞因子IL-17A及IL-22明顯上調(diào)(P<0.01)，而Treg細胞相關抗炎細胞因子IL-10及TGF-β的含量明顯下調(diào)(P<0.01)；與糞菌移植對照組相比，糞菌移植組小鼠的IL-17A與IL-22的含量明顯下調(diào)(P<0.01)，IL-10與TGF-β明顯上調(diào)(P<0.01)，見圖6。

注：(1)與正常對照組比較，P<0.01；(2)與糞菌移植對照組比較，P<0.01。圖5 各組小鼠紋狀體中DA與5-HT的含量Fig.5 Contents of DA and 5-HT in the striatum of each group

注：(1)與正常對照組比較，P<0.01；(2)與糞菌移植對照組比較，P<0.01。圖6 各組小鼠外周血及SNpc中IL-17A、IL-22、IL-10及TGF-β的含量Fig.6 Contents of IL-17A, IL-22, IL-10 and TGF-β in peripheral blood and SNpc of each group

2.5SNpc中Th17/Treg細胞平衡

結果顯示，與正常對照組相比，在糞菌移植對照組及糞菌移植組小鼠中有較多的Th17細胞(RORγt+CD4+)侵入到SNpc中；而相較于Th17細胞，Treg細胞僅有少量的表達。與糞菌移植對照組相比，在糞菌移植組小鼠SNpc中Th17細胞(RORγt+CD4+)的數(shù)量有所下調(diào)，而Treg細胞(Foxp3+CD4+)的數(shù)量有所上調(diào)，見圖7。

注：A為Th17細胞表達結果，B為Treg細胞表達結果。圖7 各組小鼠SNpc中Th17及Treg細胞的表達(IF，×400)Fig.7 Expression of Th17 and Treg cells in SNpc of each group (IF，×400)

3 討論

PD作為一種常見的神經(jīng)退行性疾病，其發(fā)病機制復雜多樣[12-13]。炎癥反應是PD的發(fā)病機制之一[14]，其中起最顯著作用的是T細胞[15-16]。已有研究證明，在神經(jīng)元變性過程中，CD8+和CD4+T細胞能侵入MPTP誘導的小鼠PD模型的大腦中[17-18]。在本研究中確認了MPTP誘導PD的相關特征，包括運動和行為損傷以及黑質(zhì)紋狀體DA及5-HT含量的下降。重要的是，本研究通過免疫熒光雙染結果觀察到CD4+T細胞在PD小鼠的SNpc中增加。更直接的證據(jù)表明，PD小鼠SNpc中Th17細胞數(shù)量增加，而Treg僅有較少量的表達，表明Th17細胞遷移并積聚在PD小鼠受損的腦實質(zhì)中。Th17與Treg細胞分別主要與促炎和抗炎作用相關。侵入到腦實質(zhì)內(nèi)的Th17細胞通過釋放炎性細胞因子如IL-17和IL-22來促進膠質(zhì)細胞的活化，而過度活化的膠質(zhì)細胞在PD動物受損的大腦區(qū)域釋放更多的炎性介質(zhì)和更少的神經(jīng)營養(yǎng)因子，進而產(chǎn)生神經(jīng)毒性，最后對神經(jīng)元造成直接損傷[19-20]。此外，Treg可以通過釋放抗炎因子如IL-10及TGF-β等調(diào)節(jié)炎癥反應，抑制上述過程，促進MPTP中毒后神經(jīng)元的存活[21-22]。因此識別CD4+T細胞的不同亞群，調(diào)控Th17/Treg細胞的平衡對于PD及其他炎癥性疾病具有重要意義。

據(jù)報道，糞便菌群的移植在PD、高血壓、肌萎縮側索硬化癥[23]、炎癥性腸病[24-25]等疾病中均發(fā)揮重要作用。本研究證明，在PD小鼠外周血及SNpc中促炎因子表達上調(diào)，抗炎因子表達下調(diào)。而在將正常小鼠的糞便經(jīng)過一系列處理后獲得的微生物群給予PD小鼠灌胃后，小鼠的PD樣行為、紋狀體中DA及5-HT及炎癥因子的含量被逆轉。并且使Th17/Treg功能被調(diào)控到相對平衡的狀態(tài)。綜上所述，通過糞便菌群移植的方法可調(diào)控Th17/Treg細胞反應的平衡，而不是針對促進中樞神經(jīng)系統(tǒng)抗原的自動反應性免疫，實際上是在誘導保護性的T細胞反應，而不會由于引起炎癥反應導致神經(jīng)元損傷的二次加重。因此這種采用糞便菌群移植來保護PD神經(jīng)損傷的治療方法具有十分重要的科學意義。