SYT1對肝癌細胞侵襲、轉移的影響及其分子機制*

許靜，喻超，楊盛力，孫誠誼**

(1.貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 肝膽外科，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學 肝膽胰脾重點實驗室，貴州 貴陽 550004；3.貴州省肝膽胰脾疾病研究所，貴州 貴陽 550004)

惡性腫瘤屬于國內臨床病死率較高的疾病，而肝癌是導致癌癥死亡的五大主要原因之一[1-2]。肝癌的發(fā)生具有種族和區(qū)域差異性，高發(fā)于發(fā)展中國家，中國每年新增肝癌病例數(shù)占全世界的二分之一以上[3]。肝癌早期癥狀并不明顯，腫瘤標志物甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)在癌癥初期的敏感性低[4]，超聲檢查雖能提高檢出率，但受檢查者的臨床經驗以及機器的先進程度影響[5-8]，因此患者確診時往往已是中晚期；且肝癌惡性程度較高，病情進展快且容易發(fā)生轉移[9]，因此，亟需找到更有效的分子治療靶點以獲得更好的抗癌方法。突觸囊泡蛋白(synaptotagmin, SYT)家族在人體內廣泛分布，已知有多于17種的亞型，突觸囊泡蛋白1 (synaptotagmin, SYT1) 作為突觸小泡膜表面的Ca2+傳感器，在胞吞胞吐以及囊泡轉運時起至關重要的作用[10-12]。研究認為，SYT1能抑制直腸癌細胞的增殖，并且誘導其死亡[13]，而SYT1在肝癌中的作用尚未有相關報道。前期預實驗表明，抑制SYT1的表達能明顯降低癌細胞的增殖率，有望在肝癌治療上找到新思路。上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)主要發(fā)生于上皮細胞來源的腫瘤，指上皮表型轉化為間充質表型的現(xiàn)象，該過程涉及復雜的分子機制，與腫瘤的侵襲轉移密切相關，可觀察到腫瘤細胞中鈣黏附蛋白E(E-cadherin)的表達下降，而波形蛋白(Vimentin)表達增多[14-17]，因此，可檢測這兩種蛋白的表達量來驗證腫瘤侵襲轉移的分子機制。本文通過抑制SYT1表達后研究其對肝癌細胞的侵襲和遷移能力帶來的影響，探討沉默SYT1后抑制肝癌的分子機制。

1 材料與方法

1.1細胞株與主要試劑

在本研究中所使用的肝癌細胞株為Hep3B、Huh7、HCCLM3、SMMC-7721、HLF和BEL-7404，正常肝細胞HL-7702，由武漢華中科技大學附屬協(xié)和醫(yī)院腫瘤中心實驗室惠贈，所使用的表達質粒為si-SYT1，DMEM(dulbecco's modified eagle medium)培養(yǎng)基、胰蛋白酶(TRYPSIN)、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)均購自美國gibco公司，Transwell小室購自美國Chemicon公司的ECM550，RNA提取試劑Trizol購自美國Invitrogen公司，引物SYT1、逆轉錄試劑盒、si-SYT1試劑盒均由武漢谷歌生物科技有限公司提供，proteintech公司提供SYT1、E-cadherin、 Vimentin一抗，CPTransfection kit 轉染試劑盒購自廣州銳博公司，4%多聚甲醛固定液、蘇木精、結晶紫購自武漢博士德生物公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 用加了10%胎牛血清及1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)肝癌細胞Hep3B、Huh7、HCCLM3、SMMC-7721、HLF和BEL-7404，以及正常肝細胞HL-7702，并將Hep3B、Huh7根據(jù)轉染的載體不同分組后，置于37 ℃、含5% CO2的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中。

1.2.2細胞轉染 分別取對數(shù)生長期的Hep3B、Huh7細胞，2×105個/孔，均勻置于六孔板中培養(yǎng)，待6 h細胞貼壁，換液后，用SYT1表達空載體、SYT1干擾慢病毒及SYT1過表達慢病毒質粒分別轉染兩株細胞，分別為SYT1對照組(對照組)、SYT1干擾下調組(干擾組)和SYT1過表達組(過表達組)，用lipofectamine3000促進轉染。

1.2.3SYT1在肝癌組織及對應的癌旁組織中的表達 選取肝膽胰外科自2010年7月—2019年5月收集的150例原發(fā)性肝癌患者，采用免疫組化實驗觀察SYT1在肝癌組織及其對應癌旁組織中的表達。用4%多聚甲醛固定肝癌組織及癌旁組織，石蠟包埋，組織切片置于68 ℃恒溫箱中，烘烤20 min，二甲苯浸泡20 min，更換二甲苯溶液再次浸泡20 min；依次用無水乙醇、80%乙醇、70%乙醇、3%H2O2分別浸泡10 min，用PBS洗去切片表面的其他液體(洗3次，每次5 min)；再用0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液浸泡，并加熱至95 ℃，加熱20 min，再靜置30 min待其冷卻；用PBS溶液洗3次；室溫下，用正常羊血清工作液封閉10 min；滴加一抗4 ℃過夜后，用PBS緩沖液洗3次，室溫下加入二抗反應1 h, PBS緩沖液洗3次；DAB顯色液染色10 min，PBS沖洗10 min，蘇木精復染，自來水沖洗10 min，脫水、透明、封片，顯微鏡觀察SYT1在肝癌組織和癌旁組織中的表達。

1.2.4SYT1在不同肝癌細胞及正常肝細胞中的表達 用Trizol溶液提取RNA，SYBR Premix ExTaq試劑盒進行qPCR實驗：經去基因組、總RNA純度和完整性檢測后，將樣品進行逆轉錄、擴增，qPCR反應體系為5μmol/L qPCR primer 0.9 μL, SYBR(2X) 7.5μL,DdH2O 5.6 μL,待檢測樣品 1 μL,經95 ℃預變性3 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s,循環(huán)40次。SYT1引物F鏈為GCTGCTGGTAGGGATCATTCR鏈為GTTTTTCGGTGGACTTTTGTCTC，GAPDH引物F鏈為GGAGCGAGATCCCTCCAAAATR鏈為GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG。以GAPDH為內參，以2-ΔΔCt表示目的基因相對表達量,實驗重復3次,結果取平均值。

1.2.5SYT1對肝癌細胞遷移能力的影響 分別取對數(shù)生長期的Hep3B、Huh7細胞，將細胞分為對照組和干擾組。利用由醫(yī)用級硅膠制作的OrisTM細胞接種限位塞(cell seeding stoppers)，將細胞接種于96孔板內的外環(huán)形區(qū)，接種數(shù)為 40 000 個/孔，設置 3個復孔。6 h后細胞貼壁，更換培養(yǎng)液并用Calcein-AM進行細胞染色，染色30 min后，使用Cell Analyzer 6500HS機器采集圖像，作為0 h圖像。然后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，再次采集圖像,計算遷移率。遷移比率=(干擾組遷移48 h的細胞面積-干擾組遷移0 h的細胞面積)/(對照組遷移48 h的細胞面積-對照組遷移0 h的細胞面積)。

1.2.6SYT1對肝癌細胞遷移、侵襲能力的影響 將轉染后的Hep3B、Huh7細胞分為對照組、干擾組和過表達組，用帶有基質膠的transwell小室和不帶基質膠的transwell小室，分別進行細胞遷移和侵襲實驗。用無血清的DMEM培養(yǎng)基制備細胞懸液，調整細胞濃度至2×105/mL。取200 μL 鋪于Transwell小室上室，下室加入500 μL含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h。24 h后取出Transwell小室上室，用棉簽擦去基質膠和上室內的細胞，固定后結晶紫染色，在顯微鏡下拍照和計數(shù)，結果取平均值。實驗設置3 個復孔，重復3 次。

1.2.7E-cadherin和Vimentin在Hep3B、Huh7細胞中的表達 待Hep3B、Huh7細胞長滿80%～90%后(約72 h)，將細胞置于冰上用RIPA裂解，提取總蛋白；5×loading buffer于100 ℃隔水加熱7 min，用90 V恒壓電泳、200 mA恒流轉膜2 h，4 ℃一抗搖床孵育過夜，室溫下二抗孵育2 h；洗膜，檢測蛋白表達。

1.3統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1SYT1 mRNA和蛋白在肝癌組織及對應的癌旁組織中的表達

在肝癌組織和對應癌旁組織中SYT1 mRNA相對表達量分別為1.68 ± 0.21、4.36 ± 0.33，與癌旁組織比較，肝癌組織中SYT1 mRNA和蛋白相對表達量增加(P<0.05)。見圖1。

注：A為SYT1 mRNA的表達(qPCR檢測結果)，B為SYT1蛋白免疫組化結果(HE,×100)；(1)與癌旁組織比較，P<0.05。圖1 SYT1 mRNA和蛋白在肝癌組織及其對應癌旁組織中的表達Fig.1 Expression of SYT1 mRNA and protein in liver cancer tissues and para-carcinoma tissues

2.2SYT1在不同肝癌細胞及正常肝細胞中的表達

正常肝細胞HL-7702中SYT1的表達低于6株肝癌Huh7、Hep3B、HCCLM3、SMMC-7721、HLF和BEL-7404細胞，其中SYT1在Huh7和Hep3B細胞中的表達又高于其他肝癌細胞(P<0.05)。見圖2。

注：(1)HL-7702與比較，P<0.05。圖2 SYT1在不同肝癌細胞及正常肝細胞中的表達Fig.2 Expression of SYT1 in different hepatocellular carcinoma cells and normal liver cells

2.3SYT1對肝癌細胞侵襲轉移能力的影響

OrisTM細胞遷移實驗結果顯示，Hep3B和Huh7干擾組細胞遷移能力低于對照組，Hep3B、Huh7的細胞遷移比率分別為0.880 2、0.872 4，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖3)，提示干擾SYT1的表達后，細胞遷移能力降低。Transwell細胞遷移實驗顯示，與對照組比較，Hep3B和Huh7干擾組細胞遷移數(shù)降低，過表達組的細胞遷移數(shù)升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表1和圖4)；與對照組比較，Hep3B和Huh7干擾組細胞中代表肝癌細胞侵襲能力的細胞數(shù)目較少，過表達組的侵襲細胞增多，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表2和圖4)，提示過表達組的細胞侵襲、遷移能力明顯高于對照組及干擾組的肝癌細胞。

表1 各組Hep3B和Huh7細胞Transwell細胞遷移實驗遷移細胞數(shù)Tab.1 The number of migration cells in Transwell cell migration test in Hep3B and Huh7 cells of each group

表2 各組Hep3B和Huh7細胞Transwell細胞侵襲實驗遷移細胞數(shù)Tab.2 The number of migration cells in Transwell cell invasion test in Hep3B and Huh7 cells of each group

2.4SYT1對肝癌細胞中E-cadherin和Vimentin表達的影響

Western blot結果顯示，與對照組比較，干擾組Hep3B、Huh7細胞中E-cadherin蛋白表達量增加，而Vimentin蛋白表達量下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0. 05)。見圖5。

圖3 干擾SYT1的表達對 Hep3B和Huh7細胞遷移能力的影響Fig.3 Effect of knockdown of SYT1 expression on cell migration ability in Hep3B and Huh7 cells of each group

注：A、B為Transwell細胞遷移實驗結果，C、D為Transwell細胞侵襲實驗結果；(1)與對照組比較，P<0.05。圖4 SYT1對 Hep3B和Huh7細胞遷移、侵襲能力的影響Fig.4 Effect of SYT1 on cell migration and invasion in Hep3B and Huh7 cells of each group

圖5 SYT1對 Hep3B和Huh7細胞中E-cadherin和Vimentin表達的影響(Western blot)Fig.5 Effect of SYT1 on E-cadherin and Vimentin expression in Hep3B and Huh7 cells of each group(Western blot)

3 討論

越來越多的研究顯示SYT1不僅在轉運囊泡時起著至關重要的作用[18-19]，也可影響認知功能[20]、與阿茨海默癥相關[21]、抑制結腸癌細胞并誘導癌細胞凋亡等[22]。然而，SYT1在肝癌領域的研究尚少，對于它的作用機制更是尚未清楚。本研究探究了SYT1對肝癌細胞侵襲、轉移影響，并尋找其可能的分子機制。通過細胞功能試驗發(fā)現(xiàn)，敲低SYT1的表達后，明顯降低了肝癌的侵襲和遷移能力，這對于提高肝癌患者的預后有著積極的意義。接著又探究SYT1對鈣粘附蛋白E和波形蛋白表達的影響，以期尋找SYT1促進肝癌侵襲遷移與EMT的關系。

本研究干擾SYT1的表達后，通過免疫印跡實驗檢測Vimentin和E-cadherin的蛋白表達水平，進一步探究SYT1促進肝癌細胞侵襲遷移能力的分子作用機制與EMT的相關性。SYT1在肝癌細胞和組織中的表達明顯高于癌旁細胞，表明該基因與肝癌相關。Transwell和OrisTM細胞遷移實驗結果顯示，SYT1的下調使得肝癌細胞侵襲、遷移能力下調，提示肝癌的侵襲遷移與該基因密切相關。Western blot實驗又證明了SYT1可以促進EMT的發(fā)生。

綜上所述，本研究結果證實，SYT1作為一種膜蛋白，可增強肝癌細胞增殖、遷移，從而促進肝癌的惡化進程；還證實了，SYT1表達的降低，使Vimentin表達降低而E-cadherin的表達升高，說明SYT1促進了EMT的發(fā)生，這可能是SYT1促進肝癌細胞侵襲轉移的一個途徑。