細(xì)胞培養(yǎng)密度對(duì)乳腺癌4T1細(xì)胞增殖、遷移、黏附及浸潤(rùn)能力的影響*

陳騰祥，孫密欣,2，肖俊，董宇華，熊英，蘭金芝，雷珊，張金娟**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.河北省邯鄲市第一醫(yī)院 中心實(shí)驗(yàn)室，河北 邯鄲 056000；3.貴州醫(yī)科大學(xué) 生物與工程學(xué)院, 貴州 貴陽(yáng) 550025)

乳腺癌(breast cancer)是常見(jiàn)的女性惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率均呈逐年上升趨勢(shì)[1-2]。調(diào)查顯示，乳腺癌位居女性癌癥發(fā)病率的第1位、病死率的第2 位[3]，嚴(yán)重影響女性身心健康。目前臨床手術(shù)治療、放化療等治療方案在不斷改進(jìn)，使得乳腺癌患者5年生存率有所提高[4-5]。乳腺癌的生存率依然不容樂(lè)觀，這主要與乳腺癌的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)有關(guān)[6]。癌組織的微環(huán)境是影響癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的重要因素[7-10]，癌細(xì)胞的增殖能力越強(qiáng)，癌組織在短期內(nèi)的細(xì)胞數(shù)也就也多，細(xì)胞的生存密度也就越大，細(xì)胞的生存密度是癌組織發(fā)展的重要因素之一[11-13]。細(xì)胞密度因素對(duì)于癌組織的發(fā)生發(fā)展的影響，目前文獻(xiàn)報(bào)道不多，為了解細(xì)胞密度對(duì)癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移能力的影響，本研究以4T1乳腺癌細(xì)胞作為研究對(duì)象，以60%和90%的細(xì)胞培養(yǎng)匯合度來(lái)模擬癌細(xì)胞的高密度或低密度的生存環(huán)境，通過(guò)增殖、遷移、黏附和浸潤(rùn)等實(shí)驗(yàn)評(píng)估癌細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移能力。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

4T1小鼠乳腺癌細(xì)胞株購(gòu)自廣州市吉妮歐生物科技有限公司，CO2恒溫培養(yǎng)箱(Model 310型)購(gòu)于美國(guó)Thermo公司，超凈工作臺(tái)(SW-CJ-2FD)購(gòu)于蘇州凈化設(shè)備有限公司，倒置顯微鏡(CKX41)購(gòu)于日本Olympus公司，離心機(jī)(Allegar 64R)購(gòu)于美國(guó)Beckman公司，酶標(biāo)儀購(gòu)于美國(guó)BioTek公司，DMEM(高糖)培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司，胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Gibco公司，胰酶粉劑購(gòu)于北京索來(lái)寶公司，細(xì)胞培養(yǎng)板(96孔、24孔、12孔)購(gòu)于中國(guó)無(wú)錫耐思生物科技有限公司，Transwell小室購(gòu)于美國(guó)Millipore公司，Matrigel膠購(gòu)于美國(guó)DB公司，吉姆薩染色劑和MTT試劑盒購(gòu)于北京索來(lái)寶公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 4T1乳腺癌細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM(高糖)培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，將細(xì)胞接種于6 cm培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)至匯合度為60%(sparse組)和90% (dense組)，如圖1所示，分別取高密度和低密度培養(yǎng)的4T1細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn) 經(jīng)高密度和低密度培養(yǎng)的4T1細(xì)胞，分別制備成2×105個(gè)/L的單細(xì)胞懸液，以1 mL/孔將細(xì)胞接種于24孔板，繼續(xù)培養(yǎng)至肉眼可見(jiàn)細(xì)胞集落時(shí)，吉姆薩染色，顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)(每孔隨機(jī)選取5個(gè)視野)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

sparse(匯合度約60%) dense(匯合度約90%)圖1 高、低密度培養(yǎng)的乳腺癌4T1細(xì)胞(100×)Fig.1 4T1 breast cancer cells cultured in low and high density(100×)

1.2.3劃痕實(shí)驗(yàn)檢查細(xì)胞遷移率 高密度和低密度培養(yǎng)的4T1細(xì)胞，制成9×108個(gè)/L的細(xì)胞懸液，以每孔3 mL接種于6 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)過(guò)夜、細(xì)胞鋪滿，用200 μL槍頭在單層細(xì)胞上呈劃“一”字痕，漂洗去除懸浮細(xì)胞，換成不含血清的DMEM，于0 (即刻)、6、12和18 h時(shí)在倒置顯微鏡下觀察和拍照，用photoshop軟件測(cè)量劃痕寬度，算出細(xì)胞遷移距離，計(jì)算細(xì)胞遷移率。細(xì)胞遷移率=(初始劃痕寬度-檢測(cè)時(shí)寬度)/初始劃痕寬度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4Transwell小室實(shí)驗(yàn)觀查細(xì)胞遷移率 取高密度和低密度培養(yǎng)的4T1細(xì)胞，分別制成單細(xì)胞懸液(2×108個(gè)/L)；取細(xì)胞懸液200 μL加入Transwell小室，下室為全培養(yǎng)基600 μL；培養(yǎng)18 h后，取出Transwell小室，擦除室內(nèi)殘余細(xì)胞，甲醇固定膜外細(xì)胞，吉姆薩染色，倒置顯微鏡下觀察并拍照，每孔取5個(gè)視野進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。遷移率=測(cè)試組跨膜細(xì)胞/對(duì)照組跨膜細(xì)胞 ×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5黏附實(shí)驗(yàn)計(jì)算細(xì)胞相對(duì)黏附率 取高密度和低密度培養(yǎng)的4T1細(xì)胞，分別制成單細(xì)胞懸液(2×108個(gè)/L)，以100 μL/孔加入預(yù)鋪了BSA的96孔板中(設(shè)3個(gè)空白孔)，培養(yǎng)60 min，漂洗掉未黏附的細(xì)胞。加入含5%MTT的DMEM 120 μL，37 ℃孵育3 h，棄上清，加入DMSO震蕩10 min，在酶標(biāo)儀上570 nm處OD值，扣除空白對(duì)照組背景，以dense組細(xì)胞孔OD值為相對(duì)值，計(jì)算細(xì)胞相對(duì)黏附率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6浸潤(rùn)實(shí)驗(yàn) 取高密度和低密度培養(yǎng)的4T1細(xì)胞，分別制成單細(xì)胞懸液(4×108個(gè)/L)，將細(xì)胞鋪到Traswell小室的Matrigel(預(yù)先制備)上，下室為含5%FBS的DMEM，培養(yǎng)24 h，擦除小室內(nèi)的Matrigel和細(xì)胞。固定漂洗后，吉姆薩染色，倒置顯微鏡下觀察和拍照(每孔取5個(gè)視野)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果

與sparse組比較，dense組的4T1細(xì)胞形成克隆數(shù)目明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，且形成的單個(gè)克隆面積更大。見(jiàn)圖2。

注：A為肉眼所見(jiàn)，B為鏡下所見(jiàn)；(1)與sparse組比較，P<0.01。圖2 細(xì)胞培養(yǎng)密度對(duì)乳腺癌4T1細(xì)胞克隆形成的影響Fig.2 The effect of cell culture density on the colony formation of 4T1 breast cancer cells

2.2細(xì)胞遷移率

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與sparse組比較，dense組的4T1細(xì)胞更快地遷移覆蓋劃痕處；劃痕18 h后，dense組細(xì)胞的遷移率為(87±6)%，顯著高于sparse組細(xì)胞的遷移率(48±12)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖3)。與sparse組細(xì)胞比較，dense組細(xì)胞穿過(guò)Transwell小室碳酸脂膜的細(xì)胞數(shù)顯著增多，以dense組4T1細(xì)胞的遷移率為100%，sparse組4T1細(xì)胞遷移率為(19±6)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖4)。

注： A為高、低密度培養(yǎng)來(lái)源的4T1細(xì)胞劃痕愈合情況，B為統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果；(1)與sparse組比較，P<0.01。圖3 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)密度對(duì)乳腺癌4T1細(xì)胞遷移能力的影響Fig.3 The effect of cell culture density on migration of 4T1 breast cancer cells evaluated by wound healing assay

注：A為高、低密度培養(yǎng)來(lái)源的4T1細(xì)胞Transwell跨膜遷移情況(吉姆薩染色，×200)，B為統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果；(1)與sparse組比較，P<0.01。圖4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)密度對(duì)乳腺癌4T1細(xì)胞遷移能力的影響Fig.4 The effects of cell culture density on the migration capacity of 4T1 breast cancer cells tested by Transwell migration assay

2.3細(xì)胞的黏附率和浸潤(rùn)能力

以 dense組的細(xì)胞粘附率作為100%，sparse組細(xì)胞的黏附率為(39±24)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Transwell細(xì)胞浸潤(rùn)實(shí)驗(yàn)顯示，dense組細(xì)胞穿過(guò)Matrigel基質(zhì)膠和小室碳酸脂膜的細(xì)胞數(shù)明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖5)。表明經(jīng)過(guò)高密度培養(yǎng)的細(xì)胞獲得了更強(qiáng)的黏附和遷移能力。

注：A為dense和sparse組的4T1細(xì)胞相對(duì)黏附率，B為Transwell-Matrigel浸潤(rùn)細(xì)胞圖(吉姆薩染色，×100)，C為Transwell-Matrigel實(shí)驗(yàn)浸潤(rùn)細(xì)胞計(jì)數(shù)直條圖；(1)與sparse組比較，P<0.05。圖5 細(xì)胞培養(yǎng)密度對(duì)乳腺癌4T1細(xì)胞的黏附和浸潤(rùn)能力的影響Fig.5 The effect of cell culture density on the adhesion and invasion of 4T1 breast cancer cells

3 討論

在癌癥發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中，癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移是不同的生物學(xué)過(guò)程，這兩個(gè)過(guò)程可以同時(shí)發(fā)生，也可以在不同的時(shí)期和環(huán)境中單獨(dú)發(fā)生或依次發(fā)生[14-15]。隨著癌細(xì)胞的增殖和組織中細(xì)胞密集，會(huì)使微環(huán)境發(fā)生相應(yīng)變化，反過(guò)來(lái)會(huì)對(duì)癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生影響[16-17]。對(duì)于具有高轉(zhuǎn)移能力的癌細(xì)胞，在高密度的環(huán)境下，其增殖和轉(zhuǎn)移能力是否都得到了提高，是值得關(guān)注的問(wèn)題。

4T1細(xì)胞是來(lái)源于BALB/c小鼠種系的乳腺癌細(xì)胞株，具有高度的成瘤性和轉(zhuǎn)移性，其在小鼠體內(nèi)形成的移植瘤和轉(zhuǎn)移病灶被認(rèn)為是臨床4期人乳腺癌的理想動(dòng)物模型[18-19]，為了探討具有高度轉(zhuǎn)移特性的4T1乳腺癌細(xì)胞在體外的增殖和轉(zhuǎn)移能力是否受細(xì)胞密度的影響，本研究檢測(cè)了經(jīng)過(guò)高、低密度培養(yǎng)的4T1細(xì)胞的增殖、克隆形成、遷移、浸潤(rùn)和黏附能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)高密度培養(yǎng)后，上述能力均有所提高。這與文獻(xiàn)[20]的研究結(jié)果一致，他們利用3D培養(yǎng)技術(shù)對(duì)纖維肉瘤細(xì)胞株HT1080進(jìn)行高、低密度培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高密度培養(yǎng)的HT1080遷移和增殖能力更強(qiáng)。利用低成瘤性和低轉(zhuǎn)移性的MCF7和WI-38進(jìn)行觀察，細(xì)胞培養(yǎng)密度對(duì)這些細(xì)胞的增殖、遷移和浸潤(rùn)能力的影響并不明顯。這些結(jié)果說(shuō)明高轉(zhuǎn)移性的癌細(xì)胞在高速增殖后，即啟動(dòng)了轉(zhuǎn)移的程序。然而，為什么高轉(zhuǎn)移性的癌細(xì)胞獲得了這種能力，這可能有缺氧、營(yíng)養(yǎng)缺乏、局部組織液的酸化或旁分泌的微環(huán)境影響，也可能有關(guān)鍵基因變異或表觀遺傳學(xué)的變化，這些還有待深入研究。