海馬神經(jīng)元原代細(xì)胞培養(yǎng)方法的改良*

高超，杜貴琴，許永劼，朱金鳳，潘衛(wèi),2,3**，李興,4

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 貴州省產(chǎn)前診斷中心，貴州 貴陽 550004；3.貴州醫(yī)科大學(xué) 環(huán)境污染與疾病監(jiān)控教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550004；4.貴州中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550002)

隨著糖尿病發(fā)生率的增高，由糖尿病引起的腦代謝異常也日益引起大眾的關(guān)注[1]。糖尿病腦病是一種多發(fā)性因素引起的復(fù)雜性病變，胰島素的絕對(duì)或者相對(duì)不足、高血糖致使大腦神經(jīng)元微環(huán)境的紊亂是糖尿病腦病發(fā)病的重要因素[2-4]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，海馬是2型糖尿病患者最先受累的腦區(qū)，同時(shí)也是阿爾茨海默癥最先產(chǎn)生病變的部位[5-6]。海馬是記憶鞏固的重要部位，發(fā)揮著學(xué)習(xí)以及認(rèn)知功能的作用，信息儲(chǔ)存也是海馬組織的功能之一。海馬組織屬于大腦邊緣系統(tǒng)，大部分由椎體神經(jīng)元構(gòu)成，種類單一，是體外研究糖尿病腦病細(xì)胞模型的理想選擇[7]。現(xiàn)階段，國(guó)內(nèi)外對(duì)原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元細(xì)胞的方法很多，但都存在一定問題，如膠質(zhì)細(xì)胞過多、細(xì)胞純度過低等。因此，本研究旨在提供一種改良的海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)方法，減少雜質(zhì)細(xì)胞干擾，提高細(xì)胞純度，為后續(xù)糖尿病腦病的機(jī)制研究提供幫助。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑 選取出生24 h內(nèi)SD乳鼠100只，體質(zhì)量4～6 g[合格證號(hào)為SCXK(黔)2018-0001]，由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心供給。 試劑包括Neurobasal-A培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)、DMEM高糖型培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)、B-27營(yíng)養(yǎng)因子(美國(guó)Gibco公司)、0.25%胰蛋白酶(美國(guó)Hyclone公司)、D-hanks液(美國(guó)Gibco公司)、胎牛血清(美國(guó)Hyclone公司)、馬血清(美國(guó)Hyclone公司)、左旋多聚賴氨酸(PLL，美國(guó)Sigma公司)、L-谷氨酰胺(美國(guó)Gibco公司)、CCK-8檢測(cè)試劑盒(中國(guó)凱基公司)、兔抗鼠神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE，美國(guó)abcam公司)、4%多聚甲醛(索萊寶公司)以及免疫組化抗體稀釋液(索萊寶公司)。

1.1.2主要儀器 Thermo-3111型CO2培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)、VL-4型無菌操作臺(tái)(珠海市再鑫儀器有限公司)、IMARK型酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)、倒置顯微鏡(日本Nikon公司)、數(shù)碼顯微鏡(日本Nikon公司)以及超純水儀(四川沃特爾水處理設(shè)備有限公司)。

1.1.3主要溶劑的配置 0.25 mg/L的左旋多聚賴氨酸(PLL)溶液：稱取PLL后超純水溶解，配制0.25 mg/L的溶液，經(jīng)過濾器過濾細(xì)菌后備用。種植型培養(yǎng)基：DMEM培養(yǎng)基、馬血清、胎牛血清、L-谷氨酰胺以及雙抗，比例為83 ∶10 ∶5 ∶1 ∶1。維持型培養(yǎng)基：Neurobasal-A培養(yǎng)基、B-27、谷氨酰胺以及雙抗，比例為96 ∶2 ∶1 ∶1。PBS溶液：稱取PBS粉末10 g溶解于1 L超純水中，高壓滅菌備用。

1.2原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元細(xì)胞

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)板的預(yù)處理 取6孔板、24孔板、96孔板進(jìn)行預(yù)處理。其中24孔板預(yù)先放置細(xì)胞爬片。用0.25 mg/L的左旋多聚賴氨酸(PLL)處理培養(yǎng)板，包被8 h或者過夜，放置在培養(yǎng)箱中，使用前用PBS清洗3遍，置于超凈工作臺(tái)晾干，備用。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) (1)取出生24 h內(nèi)SD乳鼠，在75%酒精中清洗30 s，斷頭后，用彎剪刀剪開頭蓋骨，將整個(gè)大腦放入預(yù)冷的D-hanks 液中，在數(shù)碼顯微鏡下用眼科鑷緩緩將大腦剝開，選取海馬體，用鑷子輕輕剝?nèi)ァ靶略滦巍焙ｑR組織，在數(shù)碼顯微鏡下，將海馬體上的被膜和血管完全剝離，盡量保證海馬的完整性，將剔除干凈的海馬組織放在預(yù)冷的種植培養(yǎng)基中。(2)將取下來的海馬組織剪碎至1 mm ×1 mm ×1 mm 大小，靜置2 min棄去上清液，加入種植培養(yǎng)基3 mL，用加樣槍吹打20次后，靜置2 min，吸取上清液，重復(fù)該步驟。將所取上清液放入離心機(jī)中離心5 min，轉(zhuǎn)速設(shè)定850 r/min，把上層液體去掉，37 ℃加入0.125%胰蛋白酶消化20 min，每隔5 min搖晃培養(yǎng)皿，使其充分消化，在顯微鏡下觀察組織塊上無細(xì)胞后，加入等體積的胎牛血清終止消化，過程中輕輕吹打數(shù)次，200目篩網(wǎng)過濾，放入離心機(jī)中離心5 min，轉(zhuǎn)速設(shè)定850 r/min，把上層液體去掉，制成單細(xì)胞懸液加入種植培養(yǎng)基。(3)細(xì)胞接種，將6孔板和96孔板事先用L-多聚賴氨酸包被，然后把細(xì)胞懸液調(diào)整至2×108個(gè)/L的濃度種植于其中，培育8 h，倒掉種植培養(yǎng)基，用PBS清洗3遍，換成維持型培養(yǎng)基培養(yǎng)，每隔2 d進(jìn)行換夜。

1.3海馬神經(jīng)細(xì)胞純度鑒定

將細(xì)胞爬片用多聚賴氨酸進(jìn)行處理，放入24孔培養(yǎng)板中，將細(xì)胞懸液以(1～5)×108個(gè)/L的濃度接種到其中，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)至5 d，用PBS沖洗細(xì)胞爬片3次，每次2 min，后用4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次，每次5 min。使用NSE免疫組化染色試劑盒鑒定海馬神經(jīng)細(xì)胞純度，隨機(jī)選取顯微鏡的視野，重復(fù)8次計(jì)算100個(gè)細(xì)胞中海馬神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)量，取其平均值，海馬神經(jīng)元純度為陽性百分率。

1.4CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力

將細(xì)胞懸液以(1～5)×108個(gè)/L的濃度接種到預(yù)先經(jīng)過多聚賴氨酸處理的96孔板中，海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)至第1、3、5、7、9、14天，全部操作嚴(yán)格按照CCK-8試劑盒說明書進(jìn)行。每組做5個(gè)平行孔，培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)2 d，之后拿出CCK-8溶液，每孔加入10 μL，置于37 ℃水浴箱中孵育2 h，酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度(450 nm)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次5個(gè)副孔。

2 結(jié)果

2.1原代海馬神經(jīng)元形態(tài)觀察

如圖1所示，培養(yǎng)第1天的細(xì)胞胞體飽滿透亮，形狀各有不同，呈圓形、橢圓形、不規(guī)則形，有光暈明顯圍繞在細(xì)胞周圍，且有一部分細(xì)胞開始貼壁，細(xì)胞上有少量突起，突起之間有少量連接；培養(yǎng)第4天的海馬神經(jīng)元細(xì)胞開始呈聚集狀態(tài)，細(xì)胞胞體相對(duì)于第1天來說增大，突起較之前更為明顯，有突起連接形成網(wǎng)絡(luò)；培養(yǎng)第4、5及7天的神經(jīng)元細(xì)胞體積變大、成熟飽滿，細(xì)胞胞漿較豐富，細(xì)胞光暈更為明顯，突起連接形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)也更加明顯；培養(yǎng)第11、13天的神經(jīng)元比較成熟，突起連接形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)也交錯(cuò)復(fù)雜，由于一部分神經(jīng)元細(xì)胞開始退化，培養(yǎng)液內(nèi)有懸浮的退化的細(xì)胞碎片使得細(xì)胞背景模糊不清晰。

圖1 不同培養(yǎng)天數(shù)的海馬神經(jīng)元細(xì)胞的形態(tài)變化(倒置顯微鏡，×200)Fig.1 Morphological changes of primary hippocampal neurons (inverted microscope，×200)

2.2海馬神經(jīng)元細(xì)胞活性檢測(cè)

培養(yǎng)第1～6天海馬神經(jīng)元細(xì)胞活性逐漸增強(qiáng)，第7天時(shí)細(xì)胞活性達(dá)峰值，并在第7～9天有一個(gè)短暫的平臺(tái)期，第11天后細(xì)胞活性逐漸下降，見圖2。

圖2 海馬神經(jīng)元細(xì)胞活性檢測(cè)Fig.2 The viability of cultured primary hippocampal neurons

2.3代海馬神經(jīng)元純度鑒定

NSE免疫組織化學(xué)染色培養(yǎng)7 d細(xì)胞，其中部分凸起和胞漿染色為棕灰色或者黃棕色的顆粒，計(jì)為海馬神經(jīng)元。海馬神經(jīng)元純度為90%。見圖3。

圖3 NSE法鑒定海馬神經(jīng)元純度(NSE,×200)Fig.3 IHC staining of NSE in primary hippocampal neurons(NSE,×200)

3 討論

在研究神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，神經(jīng)元是體外細(xì)胞培養(yǎng)的理想模型。海馬是神經(jīng)元比較集中的組織，非神經(jīng)元細(xì)胞較少，同時(shí)海馬作為學(xué)習(xí)記憶的主要場(chǎng)所，在認(rèn)知功能中扮演重要角色，故在進(jìn)行體外神經(jīng)元的原代培養(yǎng)時(shí)作為首選[8-9]。已有研究證明，糖尿病腦病的發(fā)生發(fā)展與大腦海馬區(qū)生物學(xué)功能的改變密切相關(guān)，海馬的結(jié)構(gòu)與功能正常與否直接影響到糖尿病患者的認(rèn)知功能[10]。現(xiàn)階段，原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元的方法雖多，但培養(yǎng)效果存在很大問題，如雜質(zhì)細(xì)胞過多、背景臟等問題。因此，本研究通過改良傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法，提供一種穩(wěn)定高效的海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)方法，能為后續(xù)研究糖尿病腦病以及多種神經(jīng)退行性疾病提供理想的體外細(xì)胞模型。

查閱文獻(xiàn)[11-12]，總結(jié)最近幾年的原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元方法，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)海馬神經(jīng)元主要存在以下幾個(gè)問題：(1)在取材過程中，不注意海馬組織上被膜和血管的剔除。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，如果血管未剔除干凈，消化分離時(shí)會(huì)殘存較多的紅細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，使得在細(xì)胞計(jì)數(shù)和濃度摸索時(shí)造成困難，同時(shí)也會(huì)影響海馬神經(jīng)元本身的生長(zhǎng)。被膜中含有較多的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，膠質(zhì)細(xì)胞本身會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性抑制神經(jīng)元生長(zhǎng)發(fā)育。本研究在數(shù)碼顯微鏡視野下，使用眼科鑷將海馬組織中的被膜和血管剔除干凈，極大降低了雜質(zhì)細(xì)胞。(2)消化不易控制。在取下完整的海馬組織后，無法確定最佳的消化工具和作用時(shí)間，其中消化工具常為胰酶或木瓜酶。但胰蛋白酶活性強(qiáng)不易控制，任玥等[13]采用木瓜酶，相對(duì)于胰蛋白酶力度溫和，極大的改進(jìn)了原代培養(yǎng)中酶消化環(huán)節(jié)所帶來的時(shí)間和劑量難以控制的問題。非酶消化法因成本過高，使用較少。本研究綜合上述發(fā)現(xiàn)，選擇稀釋后濃度為0.125%胰蛋白酶為工具，發(fā)現(xiàn)該濃度的胰蛋白酶作用溫和，減低細(xì)胞損傷。在消化時(shí)間上，本研究選擇15～20 min，每隔5 min搖晃培養(yǎng)皿并觀察消化情況，及時(shí)終止消化，避免損傷細(xì)胞。(3)細(xì)胞純化不足。神經(jīng)元培養(yǎng)最重要的問題就是如何提高其純度，抑制非神經(jīng)元細(xì)胞生長(zhǎng)。很多研究發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中加入阿糖胞苷可以顯著抑制非神經(jīng)元細(xì)胞生長(zhǎng)，但這種方法無法很好控制阿糖胞苷的作用時(shí)間和作用濃度，很容易導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞生長(zhǎng)受到影響[14-15]。還有研究發(fā)現(xiàn)，采用 B27無血清培養(yǎng)基可以選擇性地使神經(jīng)元生長(zhǎng)，而抑制非神經(jīng)元細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖[16-18]。研究同樣證明了這一點(diǎn)，加入B27的無血清培養(yǎng)基能夠較好的抑制非神經(jīng)元細(xì)胞生長(zhǎng)，且作為神經(jīng)元特異性刺激因子，對(duì)神經(jīng)生長(zhǎng)作用顯著，能夠起到純化神經(jīng)元的作用。(4)有研究發(fā)現(xiàn)初始種植密度對(duì)神經(jīng)元貼壁無影響，但會(huì)嚴(yán)重影響軸突和樹突的伸展，從而影響細(xì)胞間信號(hào)的傳遞。神經(jīng)元細(xì)胞密度過高過低都會(huì)直接影響細(xì)胞的狀態(tài)，當(dāng)密度過大，細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)接觸抑制、爭(zhēng)奪營(yíng)養(yǎng)等現(xiàn)象，使其無法完全發(fā)育成熟；而過低的培養(yǎng)密度如0.5×108/L也是不利的，Kaech等[19]研究證實(shí)，低密度培養(yǎng)下的海馬神經(jīng)元很難維持長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)，發(fā)揮生物信息傳遞的功能。本實(shí)驗(yàn)依據(jù)李一鵬等[20]方案，選擇(1～5)×108個(gè)/L細(xì)胞濃度，培養(yǎng)出的神經(jīng)元細(xì)胞胞漿豐富、光暈明顯，發(fā)達(dá)的突起向外延伸并且變粗分出許多分支，互相連接形成密集交錯(cuò)的網(wǎng)絡(luò)，培養(yǎng)至14 d仍有較強(qiáng)活性。

本研究發(fā)現(xiàn)，與傳統(tǒng)直接將剪碎的組織塊加胰蛋白酶消化不同，將海馬組織經(jīng)剪碎、吹打、離心后，易消化得到更純的神經(jīng)元。在選材過程中，盡量選擇乳鼠，無需解剖孕鼠，獲得的神經(jīng)元細(xì)胞活性高，同時(shí)避免腦部海馬區(qū)血管和被膜不易剔除干凈的缺點(diǎn)。整個(gè)過程中，將腦組織及海馬全程浸泡在預(yù)冷的D-hanks液或種植培養(yǎng)基中，提高細(xì)胞的存活率，降低大腦代謝情況。整個(gè)殺鼠過程盡量在3 h內(nèi)完成，減少組織細(xì)胞損傷。經(jīng)本方法原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元，細(xì)胞胞體形態(tài)飽滿，細(xì)胞表面光暈明顯，聚集現(xiàn)象突出，細(xì)胞突起粗大且致密，互相交織呈密集的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，經(jīng)NSE免疫組織化學(xué)鑒定純度高達(dá)90%以上，具有很好的實(shí)用性。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)汲取了前人經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)改良海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)方法，提高了神經(jīng)元純度，為體外快速穩(wěn)定高效培養(yǎng)神經(jīng)元提供方案，同時(shí)也為后續(xù)關(guān)于糖尿病腦病及其他神經(jīng)退行性疾病的研究奠定基礎(chǔ)。