ICG磁性PLGA納米粒的制備及其在小鼠體內(nèi)的腦靶向作用*

楊暢，馬廣龍，張俊朗，Wafa Al-jamal，李勇軍

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 省部共建藥用植物功效與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 & 貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 貴州 貴陽 550004; 2.貝爾法斯特女王大學(xué) 藥學(xué)院, 北愛爾蘭 貝爾法斯特 BT9 7BL；3.貴州醫(yī)科大學(xué) 民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心, 貴州 貴陽 550004)

研究發(fā)現(xiàn)，腦腫瘤[1]、腦血管疾病[2]、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染[3]、精神疾病[4]等腦部疾病對人類的身體健康影響日益增大，因此構(gòu)建一種新型的腦靶向藥物傳遞系統(tǒng)，使藥物濃集于腦部達(dá)到增加療效、降低藥物毒副作用的目的，已經(jīng)成為全球腦部疾病藥物研發(fā)的熱點(diǎn)。吲哚菁綠(indocyanine green，ICG)是被美國食品藥品監(jiān)督管理局(food & drug administration，F(xiàn)DA)批準(zhǔn)用于臨床的近紅外熒光染料[5-7]，因其具有優(yōu)異的光學(xué)特性、良好的組織滲透力、低生物體干擾性及低毒性等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛作為造影劑應(yīng)用于熒光成像，但I(xiàn)CG在水中穩(wěn)定性差、體內(nèi)消除較快(血液半衰期2～4 min)及細(xì)胞攝取率低等缺陷又限制了其在診療方面的應(yīng)用[5-8]。聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly(lactide-co-glycolic acid)，PLGA]是由乳酸(lactic acid，LA)和羥基乙酸(glycolic acid, GA)這兩種單體按照不同比例縮聚而成，且經(jīng)美國FDA批準(zhǔn)用于組織工程、醫(yī)用材料、藥物載體的生物降解高分子聚合物[9-10]。PLGA具有良好的生物相容性、生物可降解性、合成簡單、穩(wěn)定性高、降解速度可調(diào)節(jié)以及可塑性良好等特點(diǎn)[9-11]，將ICG載入PLGA，可提高ICG的穩(wěn)定性，調(diào)節(jié)其在體內(nèi)的循環(huán)和分布，放大ICG的熒光成像效應(yīng)[7,12]。本研究將ICG和四氧化三鐵納米顆粒共載于PLGA納米粒中，追蹤四氧化三鐵納米顆粒在磁場中的運(yùn)行軌跡，以觀察磁性納米粒在小鼠體內(nèi)的腦靶向情況，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 NOD/SCID gamma(NSG)小鼠，系非肥胖糖尿病(non obese diabetic, NOD)和重癥聯(lián)合免疫缺陷(severe combined immunodeficient，SCID)基礎(chǔ)上敲除白細(xì)胞介素2受體γ鏈(interleukin 2 receptor gamma chain，IL-2Rγ)的小鼠，雄性、4只、體質(zhì)量20～25 g，英國Envigo公司提供，為清潔級動(dòng)物。本實(shí)驗(yàn)獲得英國貝爾法斯特女王大學(xué)批準(zhǔn)(NO.2841)。

1.1.2試劑 PLGA(瑞士Corbion Purac)、ICG(美國Adooq)、聚(乙二醇)甲醚-嵌段-聚(丙交酯-共-乙交酯)[poly(ethylene glycol) methyl ether-block-poly(lactide-co-glycolide)，PEG-PLGA]、聚乙烯醇[poly(vinyl alcohol)，PVA]、甲醇(色譜級)、乙腈(色譜級)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)及12～14 kDa的透析管(英國Sigma-Aldrich)、69%濃硝酸(英國VWR公司)、10 kDa超濾管(愛爾蘭Merck Millipore)，四氧化三鐵納米顆粒(20 g/L，甲苯)由Wafa J. Al-Jamal實(shí)驗(yàn)室提供，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.1.3儀器 ENTRIS 224i-1S分析天平(德國賽多利斯)、MERAFUGE 8R冷凍離心機(jī)(美國Thermo Scientific)、FLUOstar? Omega 酶標(biāo)儀(英國BMG Labtech)、Zetasizer Nano ZS90激光粒度分析儀(英國Malvern Panalytical)、55AA原子吸收分光光度計(jì)(美國安捷倫)、JEM-1400Plus透射電鏡(日本JEOL)、直徑8 mm的F645-N52-10磁鐵(英國Magnet Expert)以及Bruker In Vivo Xtreme小動(dòng)物活體熒光成像儀(美國布魯克)。

1.2方法

1.2.1納米沉淀法制備ICG磁性PLGA納米粒 稱取PLGA 6 mg和PEG-PLGA 4 mg溶于乙腈3 mL中，超聲混合溶解，備用；ICG 1 mg溶于甲醇溶液1.5 mL，與20 g/L四氧化三鐵納米顆粒溶液50 μL混合，加PLGA混合溶液中混合均勻，磁力攪拌下逐滴滴入到5%(W/V)PVA水溶液6 mL中，磁力攪拌4 h，4 ℃、6 000 r/min超濾離心15 min，超純水重懸洗滌沉淀10次，得濃縮液1.2 mL，4 ℃保存，備用。

1.2.2激光粒度分析儀測定ICG磁性PLGA納米粒的粒徑、聚合物分散性指數(shù)(polymer dispersity index,PDI)及Zeta電位 取ICG磁性PLGA納米粒溶液10 μL與10 mmol/L NaCl溶液990 μL混合，置于樣品池中，Zetasizer Nano ZS90激光粒度分析儀上測定其粒徑、PDI及Zeta電位分布。

1.2.3透射電鏡檢測ICG磁性PLGA納米粒形貌及粒徑 取ICG磁性PLGA納米粒溶液200 μL滴于銅網(wǎng)上，濾紙吸去多余的液體，晾干，置于JEM-1400 Plus透射電鏡中觀察其形貌和粒徑大小。

1.2.4ICG紫外可見吸收光譜測定及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 取2 g/L ICG標(biāo)準(zhǔn)品溶液5 μL置于96孔板中，與DMSO溶液95 μL混合，2倍稀釋，得100.000 0、50.000 0、25.000 0、12.500 0、6.250 0、3.125 0及1.562 5 mg/L一系列濃度的ICG標(biāo)準(zhǔn)品溶液，置于FLUOstar? Omega 酶標(biāo)儀中檢測其紫外可見吸收光譜，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5紫外可見吸收光譜法測定ICG的包封率和載藥量 取ICG磁性PLGA納米粒溶液5 μL置于96孔板，加DMSO 95 μL溶液混勻，采用FLUOstar? Omega 酶標(biāo)儀檢測793 nm處吸光度；采用紫外可見吸收光譜法計(jì)算ICG的包封率(包封率=純化后的藥物量×100%/純化前的藥物量)和載藥量(載藥量=納米粒內(nèi)包封的藥物量×100%/載藥納米粒的總重量)[12-13]。

1.2.6原子吸收分光光度法測定四氧化三鐵納米粒的包封率和載藥量 取ICG磁性PLGA納米粒溶液200 μL于100 ℃金屬浴蒸干，加69%濃硝酸200 μL，80 ℃消化4 h，冷卻至室溫，加超純水稀釋至4 mL，于原子吸收分光光度計(jì)上檢測四氧化三鐵納米粒的包封率和載藥量[12]，計(jì)算方法同ICG。

1.2.7小動(dòng)物活體熒光成像 隨機(jī)取健康且生長狀態(tài)相似的NSG小鼠2只，1只小鼠頭部放置磁鐵，1只小鼠頭部未放置磁鐵；同時(shí)經(jīng)尾靜脈注射ICG磁性PLGA納米粒溶液(ICG為1 μg/g)，1 h和24 h后分別于小動(dòng)物活體成像儀下(激發(fā)波長為760 nm、發(fā)射波長為830 nm、曝光10 s)拍攝其活體熒光成像照片。另取2只健康且生長狀態(tài)相似的小鼠，同前述樣操作，經(jīng)尾靜脈注射ICG磁性PLGA納米粒溶液(ICG為1 μg/g)1 h后取出腦部，并分別于取腦前后將整體動(dòng)物和離體腦部置于小動(dòng)物活體成像儀下(激發(fā)波長為760 nm、發(fā)射波長為830 nm、曝光10 s)拍攝其熒光成像照片，并利用系統(tǒng)自帶的分子成像軟件對離體腦部的近紅外熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1ICG磁性PLGA納米粒的性質(zhì)表征

激光粒度分析儀檢測結(jié)果顯示，ICG磁性PLGA納米粒的粒徑為(172.77±2.14)nm，PDI為(0.225±0.015)，Zeta為(-4.18±0.67)mV(圖1)；透射電鏡觀察結(jié)果顯示，四氧化三鐵納米顆粒表現(xiàn)為黑色小點(diǎn)，均勻分布于PLGA納米粒中，且ICG磁性PLGA納米粒呈球形(粒徑約為200 nm)，與激光粒度分析儀結(jié)果一致(圖2)；紫外可見吸收光譜法檢測結(jié)果顯示，ICG標(biāo)準(zhǔn)品在DMSO溶液中于793 nm有最大吸收，線性范圍為1.562 5～50.000 0 mg/L(圖3)；ICG磁性PLGA納米粒中ICG包封率和載藥量分別為61.8%和0.165%。四氧化三鐵納米顆粒消解后的包封率和載藥量分別為40.1%和0.042%。

圖1 ICG磁性PLGA納米粒的粒徑和Zeta電位分布Fig.1 Size and Zeta potential measurements of ICG magnetic PLGA nanoparticles

15 000× 60 000×圖2 ICG磁性PLGA納米粒的透射電鏡結(jié)果Fig.2 TEM images of ICG magnetic PLGA nanoparticles

圖3 ICG標(biāo)準(zhǔn)品在DMSO中的紫外可見吸收光譜和標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 UV-Vis spectra and the standard curves of ICG in DMSO

2.2小動(dòng)物活體熒光成像

小動(dòng)物活體熒光成像儀下可見，ICG磁性PLGA納米粒在磁場作用1 h后向放置磁鐵的NSG小鼠頭部聚集，未放置磁鐵的NSG小鼠體內(nèi)見ICG磁性PLGA納米粒主要集中于腹部，ICG磁性PLGA納米粒在磁場作用24 h后2只小鼠體內(nèi)均未見明顯的熒光(圖4)；取腦前后，將2只尾靜脈注射ICG磁性PLGA納米粒的NSG小鼠放置于小動(dòng)物活體熒光成像儀下觀察，無論是活體動(dòng)物還是離體組織均顯示放置磁鐵1 h后的NSG小鼠頭部的熒光強(qiáng)度高于未放置磁鐵的NSG小鼠(圖5)，定量分析結(jié)果顯示放置磁鐵的NSG小鼠頭部的累積熒光強(qiáng)度約為未放置磁鐵的NSG小鼠的1.2倍(圖6)。

圖4 NSG小鼠靜脈注射ICG磁性PLGA納米粒后1 h和24 h的活體熒光成像結(jié)果Fig.4 In vivo imaging of NSG mice at 1 h and 24 h after intravenous injection ICG magnetic PLGA nanoparticles

圖5 NSG小鼠靜脈注射ICG磁性PLGA納米粒1 h后整體動(dòng)物和離體腦部的熒光成像結(jié)果Fig.5 Fluorescence imaging of the whole animal and isolated brain at 1 h after intravenous injection of ICG magnetic PLGA nanoparticles in NSG mice

圖6 NSG小鼠靜脈注射ICG磁性PLGA納米粒1 h后離體腦部內(nèi)的累積熒光強(qiáng)度Fig.6 Sum fluorescence intensity in isolated brain of NSG mice at 1 h after intravenous injection ICG magnetic PLGA nanoparticles

3 討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示制備得到的ICG磁性PLGA納米粒的粒徑約為173 nm，PDI約為0.225，Zeta電位約為-4.18 mV，粒徑較小，尺寸均一，分散度較好。Zeta電位為負(fù)值，其負(fù)電荷可能來源于PLGA表面末端離子化的羧基，但由于PVA在聚合物表面形成了穩(wěn)定的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，屏蔽了聚合物表面電荷，因此其Zeta電位值較低[14]。透射電鏡下四氧化三鐵納米顆粒呈黑色小點(diǎn)，均勻分布于PLGA納米粒中，與原子吸收分光光度法分別從定性和定量兩方面表征了磁性PLGA納米粒，證實(shí)PLGA成功將四氧化三鐵納米顆粒載入其中。借鑒Wafa課題組建立的ICG藥物傳遞系統(tǒng)策略[13]，結(jié)合ICG磁性PLGA納米粒包封率和載藥量的常見測定方法[12]，通過DMSO破壞ICG磁性PLGA納米粒的結(jié)構(gòu)，將ICG游離出來，通過紫外可見吸收光譜法進(jìn)行測定，其包封率和載藥量，較其他文獻(xiàn)報(bào)道略高[12,15]，這可能與選用的PLGA類型有關(guān)。在磁場的作用下，經(jīng)小動(dòng)物活體成像儀可觀察到ICG磁性PLGA納米粒在1 h內(nèi)朝NSG小鼠腦部聚集，證實(shí)了ICG磁性PLGA納米粒的確具有一定的腦靶向作用，可用作腦部藥物傳遞系統(tǒng)。但其腦靶向的作用力較弱，僅比無磁場作用的磁性PLGA納米粒高1.2倍。這可能與磁性納米粒在藥物載體中的裝載量較小有關(guān)。盡可能的保證在較小的粒徑范圍內(nèi)提高載磁量，將有助于磁靶向力的進(jìn)一步提高，從而將更多的藥物運(yùn)輸?shù)侥X部。經(jīng)24 h動(dòng)物體內(nèi)代謝后，未見小鼠體內(nèi)呈現(xiàn)出ICG的熒光，提示ICG磁性PLGA納米?？赡芤呀?jīng)被肝臟代謝或者經(jīng)腎臟排出體外[16-18]，安全性較好。

目前，用于腦靶向的納米遞藥載體有脂質(zhì)體、固體脂質(zhì)納米粒、聚合物膠束、樹枝狀聚合物、碳納米管、聚合物納米粒、磁性納米粒等[19-20]。其中磁性納米粒由于受到機(jī)體內(nèi)部環(huán)境(如復(fù)雜的血管網(wǎng)絡(luò))、精確磁場的施加方式、磁場強(qiáng)度等問題的影響[21-22]，以及可能出現(xiàn)的微血管聚集栓塞現(xiàn)象[23-25]，導(dǎo)致磁驅(qū)動(dòng)的腦靶向策略的可行性一直不明確。雖然已有科學(xué)家通過各種方法成功制備了磁性PLGA納米粒[26-29]，但其主要用于腫瘤[12,26-28]和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[29]的治療；只有美國圣約翰大學(xué)Sadoqi課題組將其用于腦部藥物傳遞系統(tǒng)[15]。通過熒光檢測ICG磁性納米粒在SD大鼠的組織分布情況，發(fā)現(xiàn)游離的ICG不能進(jìn)入腦部，且游離的ICG和ICG磁性納米粒主要分布于肝、腎、脾和肺部組織。本研究結(jié)果顯示經(jīng)包裹后的ICG磁性納米?？梢赃M(jìn)入腦部，且在磁場的作用下進(jìn)入腦部的ICG較無磁場作用的ICG磁性納米粒多。因此證實(shí)ICG磁性PLGA納米粒具有一定的腦靶向作用。通過小動(dòng)物活體成像儀直接觀察ICG磁性PLGA納米粒在活體動(dòng)物體內(nèi)的運(yùn)行情況，可以更直觀的證實(shí)ICG磁性PLGA納米粒的腦靶向作用，進(jìn)一步減少以往組織分布實(shí)驗(yàn)對于動(dòng)物取材時(shí)人員操作規(guī)范性和檢測設(shè)備靈敏度的依賴。

綜上所述，ICG磁性PLGA納米粒具有一定的腦靶向作用，可用作腦部藥物傳遞系統(tǒng)。