樂伐替尼誘導肝癌耐藥細胞株的構建及其生物學特性探析*

楊哲豪，喻超，潘耀振，鄧路，鄭迪杰，孫誠誼*

(貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 肝膽外科，貴州醫(yī)科大學 肝膽胰脾重點實驗室，貴州省肝膽胰脾疾病研究所，貴州 貴陽 550004)

原發(fā)性肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是肝癌的主要組織學類型，發(fā)病占原發(fā)性肝癌的85%～90%[1-2]。HCC的發(fā)病機制復雜，癌細胞的增殖、侵襲、轉移與細胞內的各種級聯(lián)信號轉導通路是息息相關的，而細胞信號轉導通路中存在的多個關鍵性基因或是信號分子，乃是分子靶向治療的重要潛在作用靶點[3-4]。分子靶向藥物在臨床應用上雖然具有不良反應少和療效較為突出等優(yōu)點，靶向藥物還是存在著原發(fā)性耐藥和繼發(fā)性耐藥的問題[5-6]。樂伐替尼(levatinib)是一種口服的多靶點酪氨酸激酶受體抑制劑，主要以血管內皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGFR)、酪氨酸激酶受體編碼基因(rearranged during transfection，RET)、纖維母細胞生長因子受體(fibroblast growth factor receptor, FGFR)及血小板衍生生長因子受體(platelet-derived growth factor,PDGFR)等為作用靶點[7-10]，經3期臨床實驗證實，樂伐替尼在改善患者無進展生存期(progression-free survival，PFS)和客觀緩解率(objective response rate，ORR)等方面展示出優(yōu)于索拉菲尼的效果[11-12]，現(xiàn)已被美國食品及藥物管理局(food and drug administration，F(xiàn)DA)批準應用于治療不可切除的肝細胞癌[9]，然而HCC靶向治療中不可避免出現(xiàn)耐藥性[5]，目前針對HCC治療過程中產生樂伐替尼耐藥后的治療方案研究尚比較缺乏。本研究采用藥物逐步遞增法，于體外建立樂伐替尼作用下HCC的分子靶向藥物耐藥細胞株SMMC-7721，初步探究耐藥細胞對化療藥的敏感性及相關機制，報告如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞與藥品 肝癌細胞株SMMC-7721由本實驗室保存，樂伐替尼(批號S116410，10 mol/L)、阿霉素(批號S120810，10 mol/L)、氟尿嘧啶(批號S1209，100 mg)及順鉑(批號S116010，10 mol/L)購自美國Selleck Chemicals公司。

1.1.2主要試劑與儀器 兔抗人P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)、多藥耐藥相關蛋白(multidrug resistance protein，MRP)、肺耐藥相關蛋白(lung resistance protein，LRP)、谷胱甘肽S-轉移酶pi(glutathione-s-transferase pi，GST-pi)、拓撲異構酶Ⅱɑ(topoisomeraseⅡɑ，TopoⅡɑ)及乳腺癌耐藥蛋白(breast cancer resistance protein,BRCP)抗體購自武漢塞維爾生物科技有限公司，DMEM、胎牛血清、胰酶及相關細胞培養(yǎng)耗材購自于美國Gibco公司，細胞計數(shù)試劑盒(cell counting kit-8，CCK-8)及Western blot相關試劑均購置于武漢谷歌生物科技公司，逆轉錄試劑盒及SYBR Premix ExTaq試劑盒均購自日本TaKaRa公司；CFX96 Touch熒光定量PCR儀購自美國Bio-rad公司，ChemiDocTMTouch Bio-rad化學發(fā)光成像系統(tǒng)購自美國Bio-rad公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 取人HCC細胞株SMMC-7721培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基中，置于37 ℃的5%CO2恒溫培養(yǎng)箱，待細胞長勢良好、密度達到90%時進行消化傳代。

1.2.2耐藥細胞株的建立及分組 應用藥物逐步遞增法誘導得到耐藥細胞株。取對數(shù)生長期的SMMC-7721細胞接種于含初始濃度100 nmol/L樂伐替尼和10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，適時更換加藥培養(yǎng)基，初期可見大量細胞漂浮、死亡，待2～3周細胞貼壁穩(wěn)定生長后，用不加藥培養(yǎng)基培育3～5 d后傳代，繼續(xù)倍增濃度重復上述操作，最終誘導濃度為3.6 μmol/L，并于終止最終濃度持續(xù)培養(yǎng)1個月，歷時8個月構建樂伐替尼耐藥HCC細胞株SMMC-7721；后續(xù)實驗中以未經處理的細胞為對照組，誘導后產生耐藥的細胞為耐藥組。

1.2.3CCK8法檢測細胞對藥物的敏感性 取對數(shù)期長勢良好的對照組和耐藥組細胞用胰酶消化、吹打，制備為細胞懸液，計數(shù)并稀釋；分別以3×103個/孔接種于96孔板中，并預留不含細胞的空白組，置于37 ℃的5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，加入含相應藥物濃度的培養(yǎng)基200 μL/孔，樂伐替尼起始濃度為0.001μmol/L，阿霉素、氟尿嘧啶及順鉑起始濃度均為0.01 μmol/L，每種藥物均10倍稀釋5個梯度濃度，每個濃度處理5個復孔；繼續(xù)于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，分別于每孔中加入CCK-8試劑10 μL，避光培養(yǎng)1 h；采用酶聯(lián)免疫分析儀檢測樣品在490 nm處吸光值并計算各梯度濃度樂伐替尼、阿霉素、氟尿嘧啶及順鉑作用下的細胞生存率；采用Graphpad prism8.0軟件繪圖并計算不同藥物對細胞的半數(shù)抑制濃度(median inhibition concentration，IC50)和樂伐替尼的耐藥指數(shù)(resistance index,RI)。

1.2.4Real time-PCR檢測耐藥基因MDR1、LRP、MRP2、GST-pi、TopoⅡɑ及BCRP的表達 取對數(shù)生長期的各組細胞經胰酶消化，培養(yǎng)基中和，800 r/min離心5 min，棄上清，加Trizol試劑1 mL裂解細胞，提取總RNA并檢測RNA濃度和純度；依照逆轉錄試劑盒說明書將樣品逆轉錄為cRNA，以GAPDH作為內參，使用SYBR Premix ExTaq試劑盒進行Real time-PCR實驗檢測MDR1、LRP、MRP2、GST-pi、TopoⅡɑ及BCRP基因的表達。

1.2.5Western blot 檢測P-gp、LRP、MRP2、GST-pi、TopoⅡɑ及BCRP蛋白的表達 取各組細胞用RIPA裂解緩沖液裂解，4 ℃、12 000 r/min離心10 min；使用BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白質，將膜用5%脫脂奶封閉1.5 h，并在對應條件下與P-gp、LRP、MRP2、GST-pi、TopoⅡɑ和BCRP一抗、二抗溫育，洗膜、曝光后，用Image lab檢測條帶灰度值，計算各耐藥基因相關蛋白的相對表達量。

1.3統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1耐藥細胞對樂伐替尼的耐藥性

用時8個月，在體外誘導出樂伐替尼耐藥細胞株SMMC-7721，CCK-8檢測結果顯示對照組和耐藥組細胞的IC50分別為(0.15±0.03)μmol/L和(4.34±0.12)μmol/L，RI為28，兩組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1。

注：(1)與對照組比較，P<0.05。圖1 對照組和耐藥組細胞的樂伐替尼濃度-細胞存活率曲線Fig.1 Levatinib concentration-cell survival curves of cells of the control and drug-resistant groups

2.2耐藥SMMC-7721細胞對不同化療藥物的敏感性

與對照組比較，阿霉素、氟尿嘧啶和順鉑對耐藥組SMMC-7721細胞的IC50均降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

注：(1)與對照組比較，P<0.05。圖2 不同化療藥物下對照組和耐藥組細胞的IC50比較 Fig.2 Median inhibition concentrations of different chemotherapeutic agents in cells of the control and drug-resistant groups

2.3耐藥SMMC-7721細胞中MDR1、LRP、MRP2、GST-pi、TopoⅡɑ及BCRP基因的表達

與對照組相比，耐藥組SMMC-7721細胞的MDR1、LRP、MRP2、GST-pi、TopoⅡɑ和BCRP耐藥基因的相對表達量均下降，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。見圖3。

注：與對照組比較，(1)P<0.01，(2)P<0.05。圖3 對照組和耐藥組SMMC-7721細胞中MDR1、LRP、MRP2、GST-pi、TopoⅡɑ和BCRP耐藥基因的表達Fig.3 Experession of drug-resistance genes MDR1，LRP，MRP2，GST-pi，TopoⅡɑ and BCRP in SMMC-7721 cells of the control and drug-resistant groups

2.4耐藥SMMC-7721細胞中P-gp、LRP、MRP2、GST-pi、TopoⅡɑ及BCRP蛋白的表達

與對照組比較，耐藥組SMMC-7721細胞中P-gp、LRP、MRP2、GST-pi、TopoⅡɑ及BCRP蛋白表達均降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖4。

注：與對照組比較，(1)P<0.01，(2)P<0.05。圖4 對照組和耐藥組SMMC-7721細胞中P-gp、LRP、MRP2、GST-pi、TopoⅡɑ及BCRP蛋白的表達Fig.4 Expression of P-gp,LRP,MRP2,GST-pi,TopoⅡɑ and BCRP protein in cells of the control and drug-resistant groups

3 討論

靶向治療是目前晚期HCC治療的重要手段，索拉菲尼作為第一批應用于晚期HCC治療的分子靶向藥物，但因其反應率低、毒副作用大以及短期獲得性耐藥等問題，使患者收益大打折扣[5]。近兩年，隨著臨床實驗中樂伐替尼治療晚期HCC療效和安全性被逐漸證實，為臨床上靶向治療晚期HCC提供更多選擇[11]。有研究者發(fā)現(xiàn)，在建立非小細胞肺癌奧希替尼耐藥細胞株后其對化療藥物敏感性增強[13]。對于HCC產生樂伐替尼耐藥后對其他治療藥物的敏感性，尚未有研究報道。目前有研究報道腫瘤細胞對化療藥物敏感性與多藥耐藥有關[14-16]，而產生多藥耐藥的原因十分復雜，研究報道參與多藥耐藥的基因主要有：MDR1和MRP可以以跨膜蛋白轉運的方式排除化療藥物，MDR1編碼的P-gp還可活化抗凋亡通路使細胞對化療藥物耐受[17-19]；glutathione-s-transferase，GST以其藥物代謝酶作用降低化療敏感性[20-21]；LRP以胞吐作用排出抗腫瘤藥物[22-23]；TopoⅡ可導致藥物靶點不易與DNA形成復合物使得靶點對抗腫瘤藥藥物敏感性降低[24-25]；BCRP可調控細胞毒性物質的排出[26]。大量體外研究表明，MDR1、MRP、GST及BCRP等基因表達與肝癌細胞多藥耐藥性呈正相關趨勢，并且與阿霉素、氟尿嘧啶等藥物治療的敏感性密切相關[14]。

本研究通過藥物逐步遞增法誘導耐樂伐替尼的SMMC-7721細胞株，CCK-8實驗檢測樂伐替尼對對照組和耐藥組細胞的IC50，并計算出RI值為28，提示成功于體外建立耐樂伐替尼的SMMC-7721耐藥細胞株。為了探究樂伐替尼耐藥后細胞對化療藥物的敏感性變化，繼續(xù)通過CCK-8檢測耐藥細胞對阿霉素、氟尿嘧啶和順鉑的IC50發(fā)現(xiàn)較對照組細胞明顯降低，即耐藥細胞對上述藥物敏感性增強。進一步了解產生敏感性變化的潛在機制，通過檢測MDR1、LRP、MRP2、GST-pi、TopoⅡα及BCRP的表達后，發(fā)現(xiàn)無論在mRNA水平還是蛋白水平，耐藥組細胞中表達量均低于對照組。結果表明耐藥細胞對化療藥物敏感性增強與上述多藥耐藥基因的表達量降低有關。

綜上所述，本研究成功誘導得到耐樂伐替尼的HCC細胞株SMMC-7721，進一步實驗發(fā)現(xiàn)其對阿霉素、氟尿嘧啶和順鉑的敏感性增高，可能與耐藥細胞中MDR1、LRP、MRP2、GST-pi、TopoⅡα及BCRP基因的表達量下降有關。有望在臨床靶向治療肝細胞癌產生樂伐替尼耐藥后提供新的治療思路。具體作用方式和分子機制還需進一步探究。