敲低LEF1-AS1對胰腺癌細胞的影響*

楊哲豪，喻超，潘耀振，鄧路，鄭迪杰，孫誠誼*

(貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 肝膽外科，貴州醫(yī)科大學 肝膽胰脾重點實驗室，貴州省肝膽胰脾疾病研究所，貴州 貴陽 550004)

胰腺癌(pancreatic cancer，PC)是惡性程度極高的消化道腫瘤之一，早期難以發(fā)現(xiàn)且預后差。根據(jù)近年來的癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)，PC居癌癥死亡率的第六位，五年生存率僅為7%[1]。由于缺乏典型的臨床表現(xiàn)和特定的早期診斷標志物，只有15%～20%的PC患者被診斷為腫瘤可切除[2]，因此尋找特異性的生物標志物或新靶標成為PC診斷和治療的突破口[3-4]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)在許多生物活動過程中發(fā)揮調(diào)解作用，包括基因組印跡、表觀遺傳調(diào)控、可變剪接、細胞分化和癌變[5-6]。lncRNA在多種疾病的發(fā)病機制中起著重要作用，尤其是在癌癥、心血管疾病、神經(jīng)疾病和免疫介導的疾病中[7-9]。近年的研究證明，lncRNA遺傳表達可通過對細胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移和侵襲的調(diào)控來促進多種腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化[10-11]。淋巴增強因子1反義RNA1(lymphoid enhancer-binding factor1 antisense RNA1，LEF1-AS1)是近期發(fā)現(xiàn)的新lncRNA，Jin等[12]研究發(fā)現(xiàn)通過敲低LEF1-AS1后可顯著抑制惡性膠質(zhì)瘤細胞的增殖、侵襲，并促進細胞凋亡；Wang等[13]發(fā)現(xiàn)上調(diào)LEF1-AS1表達后促進了肺癌細胞的增殖和侵襲；Liu等[14]研究發(fā)現(xiàn)敲低LEF1-AS1后調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin通路可抑制成視網(wǎng)膜細胞瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。但LEF1-AS1在PC中發(fā)揮的作用尚不明確，因此本實驗通過敲低LEF1-AS1表達觀察其對PC細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響，現(xiàn)將結(jié)果匯報如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1生物信息學資料 使用gene expression profiling interactive analysis(GEPIA)網(wǎng)站分析來源于癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫中179例PC組織和171例正常組織LEF1-AS1的表達。

1.1.2細胞 正常人胰管上皮細胞株(human pancreatic duct epithelial，HPDE)和PC細胞株Panc-1、Bxpc-3、AsPC-1、Capan-1、CFPAC-1及MIA PaCa-2獲贈于華中科技大學附屬同濟醫(yī)院膽胰外科實驗室。

1.1.3主要試劑 胎牛血清、胰蛋白酶及DMEM培養(yǎng)基購自于美國Gibco公司，Trizol試劑購自美國Invitetrogen公司，細胞計數(shù)試劑盒(cell counting kit-8，CCK-8)、Transwell小室和Matrigel購自美國BD公司，B細胞白血病淋巴瘤2(B-cell leukemia-lymphoma-2，BCL-2)、B細胞白血病淋巴瘤相關蛋白(BCL-2-associated X protein gene，Bax)、波形蛋白(Vimentin)及鈣黏附蛋白E(E-cadherin)的抗體購自于美國Proteintech公司，siLEF1-AS1和siControl購自廣州銳博生物公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR試劑盒均購自日本TaKaRa公司。

1.1.4主要儀器 CFX96 Touch熒光定量PCR儀(quantitative real-time PCR，qPCR)購自美國Bio-rad公司，ChemiDocTMTouch bio-rad化學發(fā)光成像系統(tǒng)購自美國Bio-rad公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)和LEF1-AS1 mRNA的表達 HPDE和PC細胞株Panc-1、Bxpc-3、AsPC-1、Capan-1、CFPAC-1及MIA PaCa-2均培養(yǎng)于10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、體積分數(shù)5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；取對數(shù)生長期的以上各細胞，根據(jù)試劑說明書的標準流程，使用TRIzol試劑提取HPDE和PC細胞系的總RNA；使用PrimeScript RT試劑盒合成第一鏈cDNA，使用SYBR green進行實時PCR檢測LEF1-AS1mRNA的表達，GAPDH用作基線表達的管家基因。

1.2.2細胞轉(zhuǎn)染及分組 取對數(shù)生長期PC細胞Panc-1和MIA PaCa-2，胰酶消化，吹打為單細胞懸液后進行細胞計數(shù)，取相應細胞2×105個分別接種于6孔板中，培養(yǎng)過夜，根據(jù)試劑說明使用Lipofectamine 3000用siControl和siLEF1-AS1對細胞進行轉(zhuǎn)染，設置加入siControl的Panc-1和MIA PaCa-2細胞分別為對照組，加入siLEF1-AS1的Panc-1和MIA PaCa-2細胞分別為下調(diào)組。

1.2.3CCK-8測定 待對照組和下調(diào)組細胞轉(zhuǎn)染48 h后，分別消化計數(shù)細胞，將單細胞懸液以1×104個細胞/孔的速度種植在96孔培養(yǎng)板中，分別孵育24、48及72 h，每個時間點設置5個復孔，每孔加入CCK-8溶液10 μL，37 ℃孵育2～4 h，使用酶標儀在450 nm處記錄吸光度。

1.2.4平板克隆實驗 取對數(shù)期長勢良好的對照組和下調(diào)組細胞，分別消化、計數(shù)制備成單細胞懸液，以500個/孔的初始密度接種于6孔板中，置于37 ℃、體積分數(shù)5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周，4%多聚甲醛固定細胞，0.1%結(jié)晶紫染色，光學顯微鏡計數(shù)細胞集落形成數(shù)。

1.2.5劃痕實驗 取對數(shù)期長勢良好的對照組和下調(diào)組細胞，分別消化、計數(shù)，將單細胞懸液以1×105個/孔種植在6孔板中，待細胞生長至密度達90%，使用無菌200 μL移液器吸頭每孔劃3條相互平行且等寬劃痕，更換無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；用相差顯微鏡監(jiān)測單層的恢復情況(0～72 h)，隨機選取3個視野拍照，記錄劃痕寬度并計算細胞相對遷移率[細胞相對遷移率(%)=(0 h劃痕寬度-72 h后劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%]。

1.2.6細胞遷移及侵襲實驗 取對數(shù)期長勢良好的對照組和下調(diào)組細胞用胰酶消化后，用無血清DMEM 培養(yǎng)基制成單細胞懸液，將單細胞懸液以1×107個接種到Transwell上腔室，將含10%FBS的培養(yǎng)基600 μL添加到Transwell下腔室；溫育24 h，用棉簽除去不能穿透上腔室膜的細胞；將透過下腔室的細胞用4%多聚甲醛于室溫固定15 min，0.1%結(jié)晶紫染色；洗凈后烘干過夜，通過光學顯微鏡拍照并計數(shù)。細胞侵襲實驗中Transwell膜用Matrigel包被6 h，其余操作方法同前。

1.2.7Western blot檢測 對照組和下調(diào)組細胞轉(zhuǎn)染72 h后，提取細胞總蛋白，依照蛋白定量結(jié)果經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、洗膜，加入Bcl-2、Bax、E-cadherin及Vimentin蛋白對應一抗4 ℃搖床孵育過夜、二抗室溫孵育2 h，洗膜、曝光，用Image Lab檢測條帶灰度值，計算Bcl-2、Bax、E-cadherin及Vimentin的蛋白表達量。

1.3統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1LEF1-AS1的表達

TCGA結(jié)果顯示，LEF1-AS1在PC各細胞株中表達高于正常胰腺組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖1A)；qPCR檢測結(jié)果顯示，與HPDE相比，PC細胞株Panc-1、Bxpc-3、AsPC-1、Capan-1、CFPAC-1及MIA PaCa-2中LEF1-AS1表達水平上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖1B)。

2.2敲低LEF1-AS1對PC細胞增殖能力的影響

CCK-8實驗結(jié)果顯示，與對照組相比較，下調(diào)組Panc-1和MIA PaCa-2細胞24 h、48 h及72 h時OD值均下降(P<0.05，圖2A和2B)；平板克隆實驗結(jié)果顯示，與對照組比較，下調(diào)組Panc-1和MIA PaCa-2細胞集落形成數(shù)降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖2C和2D)。

注：A為TCGA數(shù)據(jù)結(jié)果(組織)，B為qPCR檢測結(jié)果(細胞)；(1)與正常胰腺組織比較，P<0.05；(2)與HPDE細胞比較，P<0.05。圖1 LEF1-AS1在正常或PC組織和細胞中的表達Fig.1 Expression of LEF1-AS1 in PC or normal tissues and cells of

注：A、B分別為PANC-1和MIA PaCa-2的CCK-8實驗結(jié)果，C為平板克隆實驗形態(tài)學結(jié)果，D為平板克隆實驗定量分析結(jié)果；(1)與對照組比較，P<0.05。圖2 敲低LEF1-AS1對各組PC細胞PANC-1和MIA PaCa-2增殖的影響Fig.2 Effect of knockdown LEF1-AS1 on proliferation of PC cells PANC-1 and MIA PaCa-2

2.3敲低LEF1-AS1對PC細胞侵襲和遷移能力的影響

劃痕實驗結(jié)果顯示，以0 h為對照，下調(diào)組Panc-1和MIA PaCa-2細胞72 h后遷移距離較對照組變短，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖3A和3B)；Transwell實驗結(jié)果顯示，與對照組比較，下調(diào)組Panc-1和MIA PaCa-2細胞遷移和侵襲能力都降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖3C和3D)。

注：(1)與對照組比較，P<0.05。圖3 敲低LEF1-AS1對PC細胞遷移及侵襲的影響Fig.3 Effect of knockdown LEF1-AS1 on invasion and migration of PC cells

2.4敲低LEF1-AS1后PC細胞Bcl-2、Bax、E-cadherin及Vimentin蛋白的表達

敲低LEF1-AS1表達后，與對照組比較，下調(diào)組PANC-1和MIA PaCa-2細胞中Bcl-2、Vimentin蛋白的表達量均下降，Bax和E-cadherin蛋白的表達量均升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖4。

注：(1)與對照組比較，P<0.05。圖4 PC細胞Bcl-2、Bax、E-cadherin及Vimentin蛋白的表達(Western blot)Fig.4 Expression of Bcl-2, Bax, E-cadherin and Vimentin protein in PC cells (Western blot)

3 討論

近年來，lncRNA在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的調(diào)控已引起廣泛關注。研究發(fā)現(xiàn)lncRNA廣泛參與了腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移[15-18]。越來越多的證據(jù)表明，lncRNA在各種人類腫瘤中異常表達，在促癌或抑癌基因的調(diào)控中起著重要作用，可以作為早期診斷和預后預測的生物學標志物亦或是作為腫瘤靶向治療的靶標[19-20]。借助微陣列和測序技術的重大進步，在腫瘤中已鑒定出眾多失調(diào)的lncRNA，并證明它們在多種腫瘤中起著重要的作用，例如PVT1、HOTAIR和MALAT1等長鏈非編碼RNA是PC發(fā)生和發(fā)展的重要調(diào)節(jié)劑[21-23]。Zhang等[24]發(fā)現(xiàn)LEF1-AS1在大多數(shù)腫瘤中都出現(xiàn)高表達，并實驗證明敲低其表達后可抑制口腔鱗狀細胞癌的增殖、遷移和侵襲。在本研究中，通過分析癌癥基因組圖譜的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)LEF1-AS1在PC組織中表達明顯高于正常組織，進一步實驗發(fā)現(xiàn)在PC細胞系中高表達。這些證據(jù)提示，LEF1-AS1可能參與了PC的發(fā)展。為了進一步驗證假設，進行了一系列體外實驗，發(fā)現(xiàn)敲低LEF1-AS1后對PC細胞增殖、侵襲和遷移均有抑制作用。有研究表明Bcl-2是一種癌基因，其過度表達能增強細胞對多數(shù)細胞毒素的抵抗性，具有抑制凋亡的作用，而Bax是Bcl-2家族中的促凋亡基因，其過度表達可拮抗Bcl-2的保護效應促進細胞凋亡[25]。另外有研究認為，上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是腫瘤細胞獲得侵襲和遷移能力的重要生物學過程，其特點是細胞粘附分子表達減少、細胞角蛋白骨架轉(zhuǎn)化為Vimentin為主的細胞骨架的特征等，其中E-cadherin表達下降被認為是EMT的重要標志[26]。為了探究敲低LEF1-AS1后PC細胞功能表型變化的是否與上述機制有關，進行相關實驗發(fā)現(xiàn)敲低LEF1-AS1表達后PC細胞中Bcl-2表達下降，Bax表達升高，提示敲低LEF1-AS1后能促進PC細胞凋亡；而Vimentin表達升高和E-cadherin下降，則提示在敲低LEF1-AS1后抑制PC細胞上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生。

綜上，LEF1-AS1在PC組織和PC細胞系中均出現(xiàn)高表達，體外敲低PC細胞PANC-1和MIA PaCa-2中LEF1-AS1的表達可能通過促進細胞凋亡和抑制上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化發(fā)生的進程，從而抑制PC細胞的增殖、遷移和侵襲能力。還需做進一步研究，以闡明LEF1-AS1對PC增殖、遷移和侵襲過程中的具體調(diào)控機制。該結(jié)論有助于為PC早期診斷、臨床治療提供新的依據(jù)和理論基礎。