苦參燥濕止癢洗劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

張樂青，亓淑芬*，李 培

（1. 陽(yáng)谷縣人民醫(yī)院，山東 陽(yáng)谷 252300；2. 聊城市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東 聊城 252000）

苦參燥濕止癢洗劑是陽(yáng)谷縣人民醫(yī)院根據(jù)臨床實(shí)踐總結(jié)的有效方劑，由苦參、黃柏、蛇床子、白鮮皮、荊芥、防風(fēng)、透骨草、地膚子、花椒共九味中藥組成；有清熱燥濕、殺蟲止癢功效；用于治療帶下病屬濕熱下注證，癥見帶下量多、色黃、氣臭、外陰瘙癢等。為保證苦參燥濕止癢洗劑臨床療效和質(zhì)量穩(wěn)定，本研究制定了蛇床子、防風(fēng)的薄層鑒別方法?？鄥樵撓磩┲械木帲袣⑾x利尿，清熱燥濕功效，主要活性成分為苦參堿，采用HPLC測(cè)定其含量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1290 InfinityⅡ色譜工作站（美國(guó)安捷倫公司）；檢測(cè)器（DEBAV00573）；KH3200DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)）；ZW-3型多功能紫外分析儀（濟(jì)南三泉中石）；BSA224S-CW電子天平（北京賽多利斯）；硅膠板（青島海洋化工廠分廠）。

1.2 試藥與試劑

苦參堿對(duì)照品（批號(hào)110805-201709），蛇床子素對(duì)照品（批號(hào)101236-201509），防風(fēng)對(duì)照藥材（批號(hào)120947-201409），均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供?？鄥⒃餄裰拱W洗劑由陽(yáng)谷縣人民醫(yī)院提供（批號(hào)：20190822，20190825，20190828）；蛇床子陰性溶液、防風(fēng)陰性溶液、苦參陰性溶液均為處方除去相應(yīng)藥味后，按處方比例及制備工藝同法制得；乙腈（瑞典歐普森）為色譜純，水為自制超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 蛇床子素 取30 ml苦參燥濕止癢洗劑，先后兩次分別加30 ml乙醚萃取，合并萃取液，水浴蒸干，殘?jiān)? ml乙醇使溶解，作為供試品溶液。取30 ml蛇床子陰性溶液，按照供試品溶液的制備方法制備陰性對(duì)照溶液。另取蛇床子素對(duì)照品，加乙醇制成每1 ml含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（中國(guó)藥典2015年版四部通則0502）試驗(yàn)，分別吸取上述3種溶液各8 μl，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以苯-乙酸乙酯（15:1）為展開劑，展開，取出薄層板，晾干，置紫外燈（365 nm波長(zhǎng)）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液相應(yīng)的位置上，出現(xiàn)相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾，結(jié)果見圖1。

圖1 蛇床子薄層色譜鑒別

2.1.2 防風(fēng) 取20 ml苦參燥濕止癢洗劑，使用二氯甲烷液萃取兩次，每次20 ml，棄去二氯甲烷液，水液用正丁醇提取2次，每次20 ml，合并兩次正丁醇提取液，蒸干，殘?jiān)蛹状? ml使溶解，作為供試品溶液。取20 ml防風(fēng)陰性溶液，按上述方法制備陰性對(duì)照溶液。再稱取0.5 g防風(fēng)對(duì)照藥材，加20 ml丙酮，超聲30 min，過(guò)濾，蒸干，殘?jiān)? ml甲醇使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法（中國(guó)藥典2015年版四部通則0502），分別吸取上述3種溶液各5 μl，點(diǎn)在同一硅膠G薄層板上，用二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇（10:3:1）為展開劑，展開，取出薄層板，晾干，置紫外燈（254 nm波長(zhǎng)）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液相應(yīng)的位置上，出現(xiàn)相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾。結(jié)果見圖2。

圖2 防風(fēng)薄層色譜鑒別

2.2 苦參堿的含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱：Ultimate XB-NH2柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相[1-3]：無(wú)水乙醇-乙腈-3 %磷酸溶液（10:80:10），檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm，柱溫：30 ℃，流速：1.0 ml/min，進(jìn)樣量：10 μl。理論塔板數(shù)按苦參堿峰計(jì)算應(yīng)不低于2000。

圖3 高效液相色譜圖

2.2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取苦參堿對(duì)照品12.66 mg，置入25 ml量瓶，加無(wú)水乙醇-乙腈（20:80）混合溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，做為對(duì)照品貯備液。再精密量取對(duì)照品貯備液1 ml至10 ml量瓶，加無(wú)水乙醇-乙腈（20:80）混合溶液稀釋至刻度，搖勻，即得[4]。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密量取苦參燥濕止癢洗劑20 ml，置分液漏斗中，加濃氨溶液1 ml混勻，加三氯甲烷萃取，共萃取3次，每次20 ml，合并三氯甲烷萃取液，蒸干，殘?jiān)尤燃淄檫m量使溶解，并轉(zhuǎn)移至25 ml量瓶，加三氯甲烷稀釋至刻度，搖勻，精密量取該溶液10 ml，加入中性氧化鋁柱（5 g，內(nèi)徑1 cm），依次用20 ml三氯甲烷和20 ml三氯甲烷-甲醇（1:1）溶液洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)訜o(wú)水乙醇適量使溶解，并轉(zhuǎn)移至10 ml量瓶，加無(wú)水乙醇稀釋至刻度，搖勻，過(guò)濾，即得。

2.2.4 陰性對(duì)照溶液的制備 精密量取苦參陰性溶液20 ml，按2.2.3項(xiàng)下方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.2.5 專屬性試驗(yàn) 分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液各10 μl，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定并且記錄色譜圖，見圖3。供試品溶液色譜圖中，在與對(duì)照品溶液色譜圖的相應(yīng)位置，有相同保留時(shí)間的色譜峰，而陰性對(duì)照溶液在此保留時(shí)間處無(wú)干擾。

2.2.6 線性關(guān)系考察 精密量取對(duì)照品貯備液0.2，0.5，1，2，4 ml，分別置入10 ml量瓶，加無(wú)水乙醇-乙腈（20:80）混合溶液稀釋至刻度，搖勻。分別精密吸取上述不同濃度的對(duì)照品溶液各10 μl，按2.2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得線性回歸方程為Y=60.038C-97.8，r=0.9998（n=5）。結(jié)果表明，苦參堿在濃度為10.128～202.56 μg/ml范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批（批號(hào)：20190822）樣品5份，按2.2.3項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，測(cè)得苦參堿的平均含量為0.123 mg/ml，RSD為0.3 %（n=5），表明方法重復(fù)性良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取線性關(guān)系考察項(xiàng)下質(zhì)量濃度為50.64 μg/ml的苦參堿對(duì)照品溶液，分別在配制后0，2，4，8，10，12 h進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果苦參堿峰面積的RSD為0.9 %（n=6）。結(jié)果表明，對(duì)照品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.9 精密度試驗(yàn) 取2.2.6項(xiàng)下的對(duì)照品溶液（濃度為50.64 μg/ ml），連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定5次，結(jié)果苦參堿峰面積的RSD為0.4 %（n=5），結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.2.10 加樣回收率試驗(yàn) 分別精密量取已知苦參堿含量的樣品溶液（批號(hào)：20190822）10，20，30 ml各2份，置于分液漏斗中，再分別加入濃氨溶液0.5，1，1.5 ml，混勻，用20 ml三氯甲烷萃取3次，合并萃取液，蒸干，殘?jiān)尤燃淄檫m量使溶解，并轉(zhuǎn)移至25 ml量瓶，加三氯甲烷稀釋至刻度，搖勻。分別精密量取各溶液10 ml，加入中性氧化鋁柱（5 g，內(nèi)徑1 cm），再精密量取苦參堿對(duì)照品貯備液1 ml共3份、2 ml共3份，分別加入中性氧化鋁柱（5 g，內(nèi)徑1 cm）中，依次用20 ml三氯甲烷和20 ml三氯甲烷-甲醇（1:1）溶液洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)訜o(wú)水乙醇適量使溶解，并轉(zhuǎn)移至10 ml量瓶，加無(wú)水乙醇稀釋至刻度，搖勻，過(guò)濾，即得。按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得苦參堿的平均回收率為99.7 %，RSD為1.1 %（n=6），見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)（n=6）

2.2.11 樣品含量測(cè)定 取3種不同批號(hào)的樣品溶液（批號(hào)為20190822，20190825，20190828），按2.2.3項(xiàng)方法制備供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，按外標(biāo)法計(jì)算各供試品中苦參堿的含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n=3）

3 討論

參考《中國(guó)藥典》及相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)苦參燥濕止癢洗劑中防風(fēng)進(jìn)行TLC鑒別，分別采用三氯甲烷-甲醇（3:1）[5]、氯仿-無(wú)水乙醇-乙酸乙酯（42:1）[6]、三氯甲烷-甲醇（4:1）[7]及二氯甲烷:乙酸乙酯:甲醇（10:3:1）做展開劑，結(jié)果以二氯甲烷:乙酸乙酯:甲醇（10:3:1）為展開劑時(shí)，各斑點(diǎn)間的分離度比較好，陰性溶液無(wú)干擾，且主斑點(diǎn)更加清晰。在對(duì)蛇床子進(jìn)行TLC鑒別研究中，分別采用甲苯-乙酸乙酯（9:1）[8]、苯-乙酸乙酯（30:1）[9]、苯-乙酸乙酯（15:1）為展開劑，結(jié)果以苯-乙酸乙酯（15:1）為展開劑時(shí)，薄層板顯色后主斑點(diǎn)更清晰；且只有在該展開劑條件下，各斑點(diǎn)分離清晰。因苦參堿的含量可采用HPLC法進(jìn)行較為精確的測(cè)定，故不再做苦參的薄層鑒別。

在苦參堿含量測(cè)定供試品的制備研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中取樣品40 ml制成供試品溶液，取10 μl注入液相色譜儀測(cè)定，消耗三氯甲烷和濃氨試液均較多，結(jié)果RSD大于2.0 %；取樣品10 ml制成供試品溶液，取10 μl注入液相測(cè)定，結(jié)果峰形不理想，最終確定取樣量為20 ml，得濃度為120 μg/ml的供試品溶液時(shí)，得到的色譜圖最理想?？鄥⒅械幕钚猿煞种饕獮榭鄥A和氧化苦參堿，氧化苦參堿在加熱提取的過(guò)程中逐漸被還原成苦參堿[10]，而苦參燥濕止癢洗劑是經(jīng)過(guò)加熱提取的，氧化苦參堿未檢出，所以本實(shí)驗(yàn)采用HPLC只檢測(cè)苦參中的苦參堿含量。本方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，結(jié)果穩(wěn)定，可為控制苦參燥濕止癢洗劑的質(zhì)量，保證其臨床用藥的有效性提供參考。