HPLC-MS/MS測(cè)定阿齊沙坦在大鼠血漿中的濃度及其藥動(dòng)學(xué)研究

劉小雨，常鴻彥，王迎春，徐玲玲，王 芳，劉愛明，逯海燕，戚 敏*

（1. 山東省藥學(xué)科學(xué)院 新藥評(píng)價(jià)中心，山東 濟(jì)南 250101；2. 山東力諾制藥有限公司，山東 濟(jì)南 250101）

阿齊沙坦是一種血管緊張素II受體拮抗劑，多用于治療高血壓癥，可單獨(dú)使用或與其他降血壓藥物一起使用，且具有平穩(wěn)持久降壓作用，不會(huì)引起干咳[1-3]。阿齊沙坦與兩種常用的血管緊張素II受體拮抗劑奧美沙坦、纈沙坦相比，其降壓效果有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)優(yōu)勢(shì)[4-5]，且阿齊沙坦還能通過(guò)部分激活過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-γ（PPAR-γ）對(duì)糖尿病患者產(chǎn)生潛在的保護(hù)作用[6-9]。阿齊沙坦酯相比于阿齊沙坦胃腸道反應(yīng)較輕，但進(jìn)入體內(nèi)很快轉(zhuǎn)化成阿齊沙坦。鑒于國(guó)內(nèi)外目前關(guān)于阿齊沙坦及阿齊沙坦酯的開發(fā)研究較多，本文建立了一種靈敏、快速、專屬性好的高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法（HPLC-MS/MS）來(lái)檢測(cè)大鼠血漿中阿齊沙坦的濃度，并應(yīng)用于藥動(dòng)學(xué)研究，對(duì)阿齊沙坦及其制劑的開發(fā)研究具有重要意義。

1 儀器與材料

1.1 儀器

AB SCIEX ExionLC-Triple Quad 4500液相質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)（SCIEX，美國(guó)）。包括工作站控制系統(tǒng)，脫氣機(jī)，ExionLC AC二元高壓泵，ExionLC AD Multiplate自動(dòng)進(jìn)樣器，ExionLC AC柱溫箱，Triple Quad 4500系統(tǒng)及Analyst 1.6.3數(shù)據(jù)采集軟件。Z216MK高速冷凍離心機(jī)（Hermle，德國(guó)）；Advantage A10 Milli-Q超純水機(jī)（Merck，德國(guó)）；Vortex Genius 3渦旋儀（IKA，德國(guó)）；移液器（Rainin）。

1.2 材料

阿齊沙坦（純度99.6 %，山東省藥學(xué)科學(xué)院）；纈沙坦（純度98.0 %，山東省藥學(xué)科學(xué)院）；乙腈（色譜級(jí)，F(xiàn)isher Chemical）；甲酸（色譜級(jí)，F(xiàn)isher Chemical）；超純水（Advantage A10 Milli-Q超純水機(jī)制備）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠，雄性，18只，體重200～220 g，由濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司提供，在溫度25 ℃、濕度60 %±5 %條件下飼養(yǎng)一周。隨機(jī)分成3組，每組6只，分別灌胃給予1，3，9 mg/kg阿齊沙坦。于給藥前，藥后5 min、15 min、30 min、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、24 h、48 h頸靜脈取血0.2 ml，置1.5 ml涂肝素鈉的尖底離心管中，8 ℃下8000 r/min離心10 min，取血漿于-80 ℃冰箱中保存。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC-MS/MS條件

色譜條件：Thermo Accucore C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，2.6 μm），流動(dòng)相為0.1 %甲酸-水（A）與乙腈（B）。洗脫梯度：0～2.5 min，10 %～80 % B；2.6～3.5 min，80 % B；3.6～5.0 min，10 % B；流速：0.50 ml/min；進(jìn)樣量：1.0 μl；柱溫：40 ℃。

質(zhì)譜條件：離子化方式：電噴霧-正離子（Turbo V）；氣簾氣：35 psi；離子化溫度：500 ℃；離子化電壓：5500 V；噴霧氣：50 psi；輔助加熱氣：55 psi。監(jiān)測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）。阿齊沙坦定量離子對(duì)為m/z457.1/279.1，去簇電壓110 V，碰撞能量10 eV；內(nèi)標(biāo)纈沙坦定量離子對(duì)為m/z436.1/291.1，去簇電壓130 V，碰撞能量10 eV。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液及血漿樣品的配制

阿齊沙坦標(biāo)準(zhǔn)溶液：精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品約10 mg于10 ml量瓶中，加乙腈溶解，配制成濃度為1.0 mg/ml的儲(chǔ)備液。分別用70 %乙腈稀釋成為0.2，0.5，1.0，2，5，10，20，50，100，200 μg/ml的系列標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液及0.6，16，160 μg/ml的質(zhì)控（QC）標(biāo)準(zhǔn)溶液。

內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液：精密稱取纈沙坦標(biāo)準(zhǔn)品約10 mg于10 ml量瓶中，乙腈溶解，配制成濃度為1.0 mg/ml的儲(chǔ)備液。再用乙腈稀釋成為1000 ng/ml的內(nèi)標(biāo)工作溶液。

血漿樣品的制備：分別取0.2，0.5，2.0，5.0，20，50，100，200 μg/ml阿齊沙坦系列工作液10 μl，加入大鼠空白血漿（抗凝劑為肝素鈉）90 μl，渦旋混勻，配制成濃度為20，50，200，500，2000，5000，10 000，20 000 ng/ml的系列標(biāo)準(zhǔn)曲線血漿樣品。分別取0.2，0.6，16，160 μg/ml阿齊沙坦QC標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μl，加入大鼠空白血漿（抗凝劑為肝素鈉）90 μl，渦旋混勻，配成濃度為20，60，1600，16 000 ng/ml的阿齊沙坦QC血漿樣品。

2.3 血漿樣品預(yù)處理

取20 μl血漿樣品置于1.5 ml離心管中，加入980 μl內(nèi)標(biāo)工作溶液，渦旋混勻2 min，13 000 r/min離心5 min，取上清，進(jìn)樣檢測(cè)。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性 取大鼠空白血漿20 μl，加入980 μl乙腈，渦旋混勻2 min，13 000 r/min離心5 min，取上清，進(jìn)樣檢測(cè)，得空白質(zhì)譜圖（圖1A）；取20 μl空白血漿，按2.3項(xiàng)下方法操作，得空白基質(zhì)含內(nèi)標(biāo)質(zhì)譜圖（圖1B）；取16 μg/ml的阿齊沙坦標(biāo)準(zhǔn)液10 μl，加空白血漿90 μl，渦旋后取20 μl濃度為1600 ng/ml的含藥血漿，按2.3項(xiàng)下方法操作，得阿齊沙坦質(zhì)譜圖（圖1C）；取給予大鼠3 mg/kg阿齊沙坦0.5 h的血漿樣品20 μl，按2.3項(xiàng)下方法操作，得血漿樣品質(zhì)譜圖（圖1D）。阿齊沙坦和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別為2.60 min和2.69 min，內(nèi)源性物質(zhì)和內(nèi)標(biāo)均不干擾待測(cè)物的準(zhǔn)確定量。

圖1 阿齊沙坦和內(nèi)標(biāo)的MRM質(zhì)譜圖

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 取2.2項(xiàng)下配制的系列標(biāo)準(zhǔn)曲線血漿樣品20 μl，按2.3項(xiàng)下操作處理。以阿齊沙坦的濃度為橫坐標(biāo)X，阿齊沙坦與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值為縱坐標(biāo)Y，用加權(quán)最小二乘法（權(quán)重為1/X2）進(jìn)行回歸運(yùn)算?；貧w方程為Y=4.86X-1.33×10-7，r=0.9979。阿齊沙坦在20～20 000 ng/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.3 準(zhǔn)確度和精密度 取2.2項(xiàng)下配制的QC血漿樣品20 μl，按2.3項(xiàng)下方法操作，每一濃度6個(gè)平行樣本，3個(gè)分析批分3 d進(jìn)行，以標(biāo)準(zhǔn)曲線回算阿齊沙坦的濃度，并計(jì)算其批內(nèi)和批間準(zhǔn)確度和精密度。批內(nèi)和批間準(zhǔn)確度RE在±15 %內(nèi)，精密度RSD小于15 %。結(jié)果見表1。

2.4.4 基質(zhì)效應(yīng)與提取回收率 取6只大鼠的空白血漿各20 μl，分別加入980 μl乙腈，渦旋混勻2 min后，8 ℃下、13 000 r/min離心5 min，得空白基質(zhì)提取液。分別取低（60 ng/ml）、中（1600 ng/ml）、高（16 000 ng/ml）3個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液20μl，加入內(nèi)標(biāo)工作溶液20 μl，加入空白基質(zhì)提取液960 μl，渦旋混勻后檢測(cè)，每一濃度6個(gè)平行樣本，峰面積記為Set1；分別取低（60 ng/ml）、中（1600 ng/ml）、高（16 000 ng/ml）3個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μl，加入內(nèi)標(biāo)工作溶液20 μl，再加入水960μl，進(jìn)樣分析，每一濃度6個(gè)平行樣本；峰面積記為Set3。以Set1/Set3計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)。通過(guò)計(jì)算2.4.3項(xiàng)下低、中、高濃度質(zhì)控（QC）樣本中待測(cè)物峰面積與Set1中分析物的峰面積比值計(jì)算回收率?；|(zhì)效應(yīng)與回收率結(jié)果見表2。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

表2 回收率和基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果（n=6）

2.4.5 穩(wěn)定性考察 取低、高濃度的阿齊沙坦QC血漿樣本20 μl，每一濃度6個(gè)平行樣本，按2.3項(xiàng)下方法操作，分別考察凍融循環(huán)穩(wěn)定性、室溫16 h穩(wěn)定性、-80 ℃長(zhǎng)期放置穩(wěn)定性和48 h自動(dòng)進(jìn)樣器穩(wěn)定性。結(jié)果見表3。

表3 阿齊沙坦在不同條件下的穩(wěn)定性結(jié)果（n=6）

2.4.6 稀釋效應(yīng) 取1.0 mg/ml阿齊沙坦?jié)舛葍?chǔ)備液10 μl，加入空白血漿90 μl，渦旋混勻，得濃度為100 μg/ml的血漿樣本。取10 μl，加入空白血漿90 μl，渦旋混勻，取20 μl，按2.3項(xiàng)下方法操作，平行測(cè)定6個(gè)樣本，其均值的準(zhǔn)確度RE為3.9 %，精密度RSD為5.4 %。說(shuō)明血漿樣本經(jīng)過(guò)10倍稀釋后不影響準(zhǔn)確定量。

2.5 藥動(dòng)學(xué)結(jié)果

從-80 ℃冰箱取出大鼠血漿樣本，室溫融化，取20 μl，按2.3項(xiàng)下方法處理（大鼠灌胃9 mg/kg阿齊沙坦后0.25，0.5，1，2 h樣品，用大鼠空白血漿稀釋10倍后，取20 μl，按2.3項(xiàng)下方法處理），根據(jù)隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算阿齊沙坦在大鼠血漿中的濃度。用Phoenix Build 8.1.0.3530計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，結(jié)果見表4和圖2。

SD大鼠灌胃給予1，3，9 mg/kg阿齊沙坦后，Cmax分別為2686，7298，27 999 ng/ml，比值為1:3.8:10.4；AUC0-t分別為22 246，55 460，186 446 h·ng/ml，比值為1:3.4:8.4。

3 討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

本研究分別考察了不同的流動(dòng)相及色譜柱，最后流動(dòng)相選擇0.1 %的甲酸-水和乙腈，峰形好，內(nèi)源性物質(zhì)不干擾分析物的準(zhǔn)確定量；色譜柱選擇Thermo Accucore C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，2.6 μm），該色譜柱具有柱效高、柱壓低、分析時(shí)間短等優(yōu)勢(shì)。

3.2 樣本處理

血漿樣本處理采用一步蛋白沉淀法，方法簡(jiǎn)單，易操作，能達(dá)到較高的響應(yīng)且不具有基質(zhì)效應(yīng)，能滿足高通量分析。血漿樣本用量少，靈敏度高，可達(dá)到更好的動(dòng)物福利。

表4 阿齊沙坦藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

圖2 大鼠灌胃給予阿齊沙坦后的血藥濃度-時(shí)間曲線

3.3 采樣時(shí)間優(yōu)化

SD大鼠灌胃給藥后血漿采集時(shí)間選擇5 min、15 min、30 min、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、24 h、48 h。最終結(jié)果顯示吸收相有2～3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，消除相有4～5個(gè)時(shí)間點(diǎn)，AUC0-48h/AUC0-∞均大于99.0 %，說(shuō)明采樣時(shí)間點(diǎn)選擇合理。

3.4 藥動(dòng)學(xué)結(jié)果

阿齊沙坦在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)力結(jié)果顯示，阿齊沙坦在大鼠體內(nèi)的達(dá)峰濃度和暴露量隨劑量升高基本成比例增加。阿齊沙坦灌胃給藥后在大鼠體內(nèi)的達(dá)峰時(shí)間Tmax為0.5～2.0 h，半衰期T1/2為7.3～9.0 h，文獻(xiàn)報(bào)道[10]健康受試者給予阿齊沙坦40 mg后Tmax為2.0～2.5 h，半衰期T1/2為11 h。結(jié)果表明，阿齊沙坦在體內(nèi)達(dá)峰時(shí)間快，半衰期長(zhǎng)，可提高患者的依從性。

本研究基于HPLC-MS/MS技術(shù)建立了大鼠血漿中阿齊沙坦的檢測(cè)方法并對(duì)其進(jìn)行了驗(yàn)證，該方法能快速準(zhǔn)確地進(jìn)行血中藥物濃度檢測(cè)，且血漿用量少，靈敏度高，重現(xiàn)性好，可用于阿齊沙坦藥動(dòng)學(xué)研究。