EPF單抗聯(lián)合順鉑對(duì)家畜膀胱腫瘤抑瘤效果的影響

鐘永怡 周泉 蘇立杰 練玉銀 王家驥 陳驍熠

摘要：為觀察早孕因子單克隆杭體（EPF-McAb）聯(lián)合順鉑（DDP）對(duì)膀胱癌細(xì)胞EJ裸鼠移植瘤的抑制作用，常規(guī)將EJ細(xì)胞接種于裸鼠右側(cè)背部皮下，待腫瘤長至直徑約5mm時(shí)隨機(jī)分為4組，每組5只，即空白對(duì)照組、順鉑組、低劑量單杭聯(lián)合組和高劑量單杭聯(lián)合組。定期測(cè)量裸鼠腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線。給藥2周后處死裸鼠，剝?nèi)∧[瘤，稱瘤重，計(jì)算抑瘤率。通過蘇木精-伊紅（Hematoxylin-eosin，HE）染色觀察細(xì)胞病理學(xué)改變;免疫印跡法檢測(cè)早孕因子（EPF）的表達(dá)情況。結(jié)果表明，順鉑組、低劑量單杭聯(lián)合組和高劑量單杭聯(lián)合組裸鼠移植瘤生長速度均慢于空白對(duì)照組。與順鉑組比較，低劑量單杭聯(lián)合組和高劑量單杭聯(lián)合組裸鼠末次給藥的移植瘤體積分別為（131.05±8.26）和（97.92±7.35）mm³。低劑量單杭聯(lián)合組抑瘤率（35.78%）和高劑量單杭聯(lián)合組抑瘤率（53.04%）均高于順鉑組抑瘤率（22.36%），差異均達(dá)顯著水平（P<0.05）。與空白對(duì)照組比較，單杭聯(lián)合組裸鼠EPF蛋白的表達(dá)量下降（P<0.05）。表明EPF-McAb聯(lián)合順鉑可抑制膀胱癌細(xì)胞EJ在裸鼠體內(nèi)增殖，其機(jī)制可能通過抑制EPF的表達(dá)發(fā)揮作用。

關(guān)鍵詞：早孕因子單克隆杭體（EPF-McAb）;順鉑;膀脫腫瘤;家畜

中圖分類號(hào)：R739.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2020）09-0133-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.09.028

一般來說，動(dòng)物的膀胱腫瘤是比較罕見的，然而在世界的某些地區(qū)牛、羊等家畜的膀胱腫瘤卻比較多見[1]。家畜中的膀胱癌是一種分化程度較低、具有高度浸潤轉(zhuǎn)移能力、預(yù)后差的惡性腫瘤[2，3]。大多數(shù)患有膀胱腫瘤或者尿道腫瘤的家畜都會(huì)出現(xiàn)血尿、尿頻、痛性尿淋漓或排尿困難等癥狀，其他癥狀包括尿失禁、多尿、煩渴和呼吸困難等[4，5]。早孕因子（EPF）是在妊娠早期哺乳動(dòng)物血清中存在的一種分泌性蛋白，由澳大利亞學(xué)者M(jìn)orton在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)并命名[6]。EPF不僅是正在分裂的胚胎和腫瘤組織的產(chǎn)物[7-9]，也是正在增殖的細(xì)胞的產(chǎn)物，胚胎和腫瘤的生長存活均有賴于EPF。因此，EPF具有免疫抑制活性、生長調(diào)節(jié)活性和免疫逃逸作用[10-12]。關(guān)于早孕因子單克隆抗體（EPF-McAb）聯(lián)合順鉑（DDP）在動(dòng)物體內(nèi)對(duì)膀胱癌抑制作用的研究少見報(bào)道，本試驗(yàn)通過建立膀胱癌裸鼠移植瘤模型，研究EPF-McAb聯(lián)合DDP的抗家畜膀胱腫瘤效應(yīng)并初步探討其作用機(jī)制，為EPF-McAb在家畜膀胱腫瘤治療中的應(yīng)用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、動(dòng)物及主要材料

人膀胱癌細(xì)胞EJ，中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫;6周齡SPF級(jí)BALB/c雄性裸鼠，廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)：SCXK（粵）2013-0034]：順鉑，齊魯制藥有限公司;胎牛血清、DMEM及0.25%胰酶，Gibco公司;細(xì)胞裂解液、PMSF，上海碧云天生物技術(shù)有限公司;辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG，北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司;蘇木素，南京建成生物工程研究所有限公司;ECL發(fā)光液，美國millipore公司;β-actin抗體，Abeam公司：倒置顯微鏡，德國Leica公司;凝膠成像分析系統(tǒng)，美國Azure公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物飼養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS和1%青霉素-鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于37℃、飽和濕度、5%CO₂孵箱中培養(yǎng)。BALB/c裸鼠飼養(yǎng)于無特定病原體（Specific pathogen free，SPF）環(huán)境中。

1.2.2 動(dòng)物模型的建立、分組及給藥 無菌環(huán)境下取對(duì)數(shù)生長期的EJ細(xì)胞0.25%胰酶消化后，制成密度為5×10⁷個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液，用注射器取0.2mL接種于裸鼠右側(cè)背部皮下。7d后可見有移植瘤生長，隨后每天用游標(biāo)卡尺測(cè)量裸鼠移植瘤直徑，待腫瘤長至直徑約5mm后，將20只裸鼠隨機(jī)分成4組，即空白對(duì)照組（生理鹽水）、順鉑組（2mg/kg DDP）、低劑量單抗聯(lián)合組（100μgEPF-McAb和2mg/kgDDP）、高劑量單抗聯(lián)合組（300μgEPF-McAb和2mg/kg DDP），每組5只。尾靜脈注射，隔天給藥，共給藥4次。

1.2.3 繪制腫瘤生長曲線 分組后每2d測(cè)量腫瘤直徑1次，記錄移植瘤的最大徑（a）和最小徑（b），計(jì)算腫瘤體積。腫瘤體積（mm³）=長徑（a）×短徑（b）²×π/6，記錄至試驗(yàn)結(jié)束。根據(jù)各組腫瘤體積的平均值繪制腫瘤生長曲線。

1.2.4 計(jì)算抑瘤率 最后一次給藥后第10天，頸椎脫臼法處死全部裸鼠，剝離瘤體并稱瘤重，計(jì)算腫瘤的抑瘤率。抑瘤率=（1-治療組平均瘤質(zhì)量/空白組平均瘤質(zhì)量）×100%。

1.2.5 組織形態(tài)學(xué)觀察 切取腫瘤后，立即固定于10%中性甲醛溶液中，梯度乙醇脫水、二甲苯透明，常規(guī)包埋蠟塊，切片進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察腫瘤細(xì)胞數(shù)目、密度及壞死情況。

1.2.6 蛋白印跡試驗(yàn) 分別收集空白組和試驗(yàn)組細(xì)胞提取總蛋白，BCA法檢測(cè)總蛋白濃度，加入loading buffer混合后沸水浴變性，經(jīng)15%SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉2h，EPF-McAb稀釋度為1：1000，室溫中孵育2h后洗膜，二抗孵育膜1h，再次洗膜后采用ECL在暗室中顯色，X光膠片記錄陽性條帶，掃描后用gel pro 4.0軟件分析陽性條帶灰度值，以EPF與β-actin灰度值的比值為EPF蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)資料進(jìn)行處理分析。所有計(jì)量資料均符合正態(tài)分布，以平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤（x±s）表示;計(jì)量資料間比較，在確定方差齊性后（P>0.05），采用單因素方差分析（One-way ANO-VA），各組間的多重比較采用Bonferroni法;如果方差不齊（P<0.05）則采用Welch法，組間多重比較采用Dunnett's T3法。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 裸鼠移植瘤體積和腫瘤生長情況

由圖1可見，接種后，各治療組移植瘤均表現(xiàn)為體積增大，呈局部結(jié)節(jié)狀生長。空白對(duì)照組、順鉑組、低劑量單抗聯(lián)合組和高劑量單抗聯(lián)合組裸鼠腫瘤體積平均分別為（1071.40±116.31）、（831.05±53.24）、（702.13±29.75）和（503.59±47.81）mm³。順鉑組、低劑量單抗聯(lián)合組和高劑量單抗聯(lián)合組裸鼠的移植瘤生長速度均顯著慢于空白對(duì)照組（P<0.05）。

2.2 裸鼠腫瘤質(zhì)量和抑瘤率

最后一次給藥后第10天處死裸鼠，解剖見腫瘤表面包膜完整，呈結(jié)節(jié)狀或類圓形，空白對(duì)照組、順鉑組、低劑量單抗聯(lián)合組和高劑量單抗聯(lián)合組裸鼠腫瘤質(zhì)量分別為（2.102±0.141）、（1.632±0.118）、（1.350±0.071）和（0.987±0.056）g;順鉑組、低劑量單抗聯(lián)合組和高劑量單抗聯(lián)合組的抑瘤率分別為22.36%、35.78%、53.04%，與空白對(duì)照組比較差異均顯著（P<0.05）（表1）。

2.3 HE染色觀察EPF-McAb聯(lián)合順鉑對(duì)裸鼠皮下移植瘤形態(tài)的影響

鏡檢結(jié)果可見，空白對(duì)照組裸鼠腫瘤細(xì)胞間隙較小，分布均勻，但排列紊亂，具有明顯的核異型性、核分裂多、細(xì)胞核大、胞質(zhì)較少等特點(diǎn)。低劑量單抗聯(lián)合組及高劑量單抗聯(lián)合組與順鉑組相比，病理可見腫瘤細(xì)胞大小不均，細(xì)胞間隙較大，形態(tài)不整，細(xì)胞核固縮，核分裂相對(duì)較少，可見有少量炎性細(xì)胞浸潤，腫瘤細(xì)胞壞死明顯，細(xì)胞增殖被抑制（圖2）。

2.4 EPF蛋白表達(dá)

由圖3可見，空白對(duì)照組、順鉑組、低劑量單抗聯(lián)合組和高劑量單抗聯(lián)合組裸鼠EPF蛋白表達(dá)灰度值分別為101.05、75.46、31.37、16.71;順鉑組、低劑量單抗聯(lián)合組和高劑量單抗聯(lián)合組與空白對(duì)照組相比差異均達(dá)顯著水平（P<0.05）。

3 小結(jié)與討論

家畜中的膀胱腫瘤是一種分化程度較低、具有高度浸潤轉(zhuǎn)移能力、預(yù)后差的惡性腫瘤[2，3]，家畜疾病的防治工作直接影響?zhàn)B殖戶的收入及養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展水平[13]。研究發(fā)現(xiàn)抗EPF-McAb對(duì)小鼠體內(nèi)移植瘤生長有影響[14]，抗EPF-McAb無論在體外或體內(nèi)均可抑制腫瘤的生長[14]。本試驗(yàn)通過建立膀胱癌裸鼠移植瘤模型，尾靜脈給藥后，繪制腫瘤生長曲線，觀察抑瘤效果;通過蘇木精-伊紅（Hematoxylin-eo-sin，HE）染色觀察細(xì)胞病理學(xué)改變;免疫印跡法檢測(cè)EPF蛋白的表達(dá)情況，了解EPF-McAb聯(lián)合順鉑對(duì)裸鼠膀胱腫瘤的抑瘤效果。結(jié)果表明，EPF-McAb聯(lián)合順鉑可抑制膀胱癌細(xì)胞EJ在裸鼠體內(nèi)增殖，其機(jī)制可能通過抑制EPF蛋白的表達(dá)發(fā)揮作用，為進(jìn)一步探究家畜膀胱腫瘤的治療奠定了基礎(chǔ)。

張冬云等[9]在肺癌等多種腫瘤或非腫瘤患者的血清中發(fā)現(xiàn)，絨癌、膀胱癌、黑色素瘤、惡性葡萄胎4種腫瘤血清和黑色素瘤標(biāo)本組織液具有t-EPF活性，故猜測(cè)EPF-McAb可能對(duì)膀胱腫瘤有治療作用。在本試驗(yàn)中，隨EPF-McAb劑量的增加腫瘤的體積及質(zhì)量逐漸減小，順鉑組、低劑量單抗聯(lián)合組和高劑量單抗聯(lián)合組的抑瘤率分別為22.36%、35.78%、53.04%，表明不同濃度的EPF-McAb有顯著抑制腫瘤生長的作用，抑瘤效果較順鉑組更為顯著，且隨著EPF-McAb劑量的增加，對(duì)腫瘤的抑制作用逐漸增強(qiáng)，抑制作用與濃度呈明顯的相關(guān)性，這與Quinn等[15]的試驗(yàn)結(jié)果一致，表明EPF-McAb對(duì)膀胱癌有很好的治療作用。

已有較多報(bào)道顯示單抗聯(lián)合臨床藥物對(duì)裸鼠移植瘤的生長有抑制作用。張皓等[16]提出，曲妥珠單抗聯(lián)合吉西他濱可以有效抑制裸鼠移植瘤生長，其機(jī)制可能與下調(diào)Cox-2蛋白表達(dá)有關(guān);此外，梁亮等[17]發(fā)現(xiàn)，西妥昔單抗聯(lián)合伊馬替尼可以下調(diào)ATP7A、p-Akt、p-mTOR蛋白表達(dá)，同時(shí)明顯降低結(jié)腸癌大鼠血清VEGF含量，進(jìn)而影響結(jié)腸癌組織中的能量合成，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖;祝保艷等[18]則表示卡博替尼聯(lián)合PD-L1單抗對(duì)黑色素瘤小鼠移植瘤有抑制作用，這種協(xié)同抗腫瘤作用機(jī)制可能是通過促進(jìn) B16-F10細(xì)胞凋亡及抑制AKT/mTOR通路所致。而在本研究中，EPF-McAb聯(lián)合順鉑可以明顯抑制膀胱癌裸鼠移植瘤的生長，與上述研究結(jié)果一致。

有研究顯示，EPF-McAb使腫瘤細(xì)胞體外生長受到限制，可能是由于EPF-McAb干擾了維持腫瘤細(xì)胞增殖活性階段的機(jī)制[14]。EPF具有免疫抑制作用，主要抑制淋巴細(xì)胞功能，而且EPF與腫瘤生長有關(guān)[15，19]，利用EPF-McAb結(jié)合EPF蛋白，可能減輕EPF對(duì)免疫系統(tǒng)的抑制作用，從而抑制EJ細(xì)胞的增殖。故單抗聯(lián)合藥物對(duì)腫瘤的治療具有一定理論和試驗(yàn)依據(jù)。對(duì)于家畜來說，若能科學(xué)地使用和掌握藥物，就能有效地治療家畜養(yǎng)殖中遇到的相關(guān)疾病，有助于家畜的健康成長，并提升其經(jīng)濟(jì)效益[20]。

綜上所述，本研究結(jié)果表明EPF-McAb聯(lián)合順鉑可抑制膀胱癌細(xì)胞EJ在裸鼠體內(nèi)增殖，其機(jī)制可能通過抑制EPF蛋白的表達(dá)發(fā)揮作用。本試驗(yàn)結(jié)果為EPF-McAb治療家畜膀胱腫瘤提供了一定的理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]貴州農(nóng)學(xué)院《牛的蕨中毒與蕨的致癌性》科研組.牛原發(fā)性膀胱腫瘤的研究——35例的病理學(xué)觀察[J].獸醫(yī)科技雜志，1981（2）：11-17.

[2]薛森耀，王曉，鐘修龍，等.原發(fā)性膀胱小細(xì)胞癌的診斷和治療[J].中華腔鏡泌尿外科雜志（電子版），2016，10（5）：311-314.

[3]肖恒軍，劉繼紅，周四維，等.原發(fā)性膀胱小細(xì)胞癌3例的診斷和治療[J].現(xiàn)代泌尿外科雜志，2002（3）：130-132.

[4]許樂仁.牛膀胱腫瘤性血尿癥病理學(xué)的研究[J].中國獸醫(yī)科技，1985（5）：31-36.

[5]許樂仁.我國牛膀胱腫瘤性血尿癥的流行病學(xué)研究[J].貴州農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，1986（1）：23-31.

[6]MORTON H，HEGH V，CLLINIE G J.Immunosuppression detectedin pregnant mice by rosette inhibition test[J].Nature，1974，249（456）：459-460.

[7]ROLFE B E，MORTON H，CAVANAGH A C，et al.Detection of anearly pregnancy factor-like substance in sera of patients withtesticular germ cell tumors[J].Am J Reprod Immunol，1983，3（2）：97-100.

[8]王敏華，蘇寶田.滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者血清早孕因子樣物質(zhì)的檢測(cè)[J].實(shí)用癌癥雜志，1993（1）：5-8.

[9]張冬云，王家驥，楊英，等.腫瘤源性早孕因子的篩檢、純化及鑒定[J].中國生化藥物雜志，2002（1）：3-6.

[10]AKYOL S，GERCEL-TAYLOR C，REYNOLDS L C，et al.HSP-10 in ovarian cancer：expression and suppression of T-cellsignaling[J].Gynecol oncol，2006，101（3）：481-486.

[11]CORRAO S，CAMPANELLA C，ANZALONE R，et al.HumanHsp10 and Early pregnancy factor（EPF）and their relationshipand involvement in cancer and immunity：Current knowledge andperspectives[J].Life Sci，2010，86（5-6）：145-152.

[12]MCCOMBE P A.Recombinant EPF/chaperonin 10 promotes thesurvival of 04-positive pro-oligodendrocytes prepared fromneonatal rat brain[J].Cell stress chaperones，2008，13（4）：467-474.

[13]鄧超.家畜常見病及相關(guān)治療管理方案[J].中國畜禽種業(yè)，2018，14（11）：42.

[14]QUINN K A，MORTON H.Effect of monoclonal antibodies to earlypregnancy factor（EPF）on the in vivo growth of transplantablemurine tumours[J].Cancer immunol immunother，1992，34（4）：265-271.

[15]QUINN K A，ATHANASAS-PLATSIS S，WONG T Y，et al.Monoclonal antibodies to early pregnancy factor perturb tumourcell growth[J].Clin Exp Immunol，1990，80（1）：100-108.

[16]張皓，周躍華，堯良清.曲妥珠單抗聯(lián)合吉西他濱對(duì)卵巢癌小鼠移植瘤生長及免疫功能的影響[J].中國免疫學(xué)雜志，2019，35（5）：608-612.

[17]梁亮，黃許森，黃海舸，等.西妥昔單抗聯(lián)合伊馬替尼對(duì)二甲肼誘導(dǎo)的結(jié)腸癌大鼠的治療作用及機(jī)制研究[J].廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，34（12）：1702-1705.

[18]祝保艷，李婧婧，李丹丹，等.卡博替尼聯(lián)合PD-L1單抗對(duì)黑色素瘤小鼠移植瘤的抑制作用機(jī)制[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2019，40（2）：172-178.

[19]權(quán)凱，張改平.早孕因子的生物學(xué)特性及其在動(dòng)物繁殖領(lǐng)域中的應(yīng)用[J].中國畜牧獸醫(yī)，2009，36（4）：122-125.

[20]韓明科.家畜疾病治療用藥應(yīng)掌握的原則與注意事項(xiàng)探析[J].畜牧獸醫(yī)科學(xué)（電子版），2017（7）：75-76.

收稿日期：2019-05-30

基金項(xiàng)目：廣東省科技計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（2008A030201022）

作者簡(jiǎn)介：鐘永怡（1993-），女，廣東清遠(yuǎn)人，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)楣残l(wèi)生與預(yù)防醫(yī)學(xué)，（電話）13678920392（電子信箱）zhongyon-gyi1993@163.com;通信作者，王家驥（1955-），男，廣東廣州人，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事全科醫(yī)學(xué)研究，（電話）13926179883（電子信箱）wjiaji@163.com;陳驍熠（1965-），女，廣東廣州人，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事食品與營養(yǎng)衛(wèi)生研究，（電話）18620586562（電子信箱）wwchenxyl@163.com。