牛奶中獸藥殘留限量新國(guó)標(biāo)及主要檢測(cè)方法的國(guó)內(nèi)外比較分析

解書(shū)斌，韓偉，閻玉林，于忠娜

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海都學(xué)院，山東萊陽(yáng) 265200；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島 266109；3.青島海關(guān)技術(shù)中心，山東青島 266002；4.青島譜尼測(cè)試有限公司，山東青島 266100)

Turnipseed SB等[1]提出獸藥是一類應(yīng)用廣泛的藥物，具有許多不同的化學(xué)和治療特性。獸藥殘留是指在動(dòng)物中使用獸藥可能會(huì)使母體化合物、代謝產(chǎn)物或結(jié)合物的殘基留在經(jīng)治療的動(dòng)物衍生的食品中，牛奶中的獸藥殘留是養(yǎng)殖過(guò)程中獸藥濫用導(dǎo)致的。獸藥殘留過(guò)量對(duì)人體健康有著嚴(yán)重影響，若長(zhǎng)期食用獸藥殘留超標(biāo)的食品，則可能導(dǎo)致人體獸藥殘留蓄積，引起人體毒害損傷，以及病原體耐藥性的產(chǎn)生，甚至致畸、致癌[2]。為應(yīng)對(duì)牛奶中獸藥殘留超標(biāo)問(wèn)題世界各國(guó)和組織都已制定了相關(guān)的法律法規(guī)和監(jiān)控體系。我國(guó)于2019年9月6日發(fā)布，即將于2020年4月1日正式實(shí)施的食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 31650-2019[3]重新修訂了食品中獸藥最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，替代農(nóng)業(yè)部公告第235號(hào)《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》相關(guān)部分。本文重點(diǎn)對(duì)獸藥殘留的種類以及獸藥最大殘留限量值、檢測(cè)方法等方面進(jìn)行分析。

1 牛奶中獸藥殘留的種類及最大殘留限量

1.1 GB 31650-2019對(duì)牛奶中獸藥殘留規(guī)定 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了牛奶中阿苯達(dá)唑等81種獸藥的最大殘留限量，對(duì)81種獸藥按照其用途分類，共涉及五種獸藥類型，分別為抗菌類、抗寄生蟲(chóng)類、激素類、消炎鎮(zhèn)痛類、農(nóng)藥除蟲(chóng)類，具體結(jié)果見(jiàn)圖1。標(biāo)準(zhǔn)中所規(guī)定的抗菌類獸藥數(shù)量最多，有37種，占國(guó)標(biāo)所涉及獸藥種類的45.7%?？咕愃幬镉?0種不同類型，包括β-內(nèi)酰胺類(9種)、氨基酸糖苷類(6種)、喹諾酮類(4種)、大環(huán)內(nèi)酯類(4種)、四環(huán)素類(4種)、多肽類(2種)、磺胺類(2種)、酰胺醇類(2種)、林克胺類(2種)，以及抗菌增效劑(2種)。其次為抗寄生蟲(chóng)類獸藥有25種，約占標(biāo)準(zhǔn)涉及獸藥種類的30.9%，其中抗線蟲(chóng)類藥物最多，有12種；其次為抗吸蟲(chóng)和球蟲(chóng)藥物各4種，抗錐蟲(chóng)、滴蟲(chóng)、梨形蟲(chóng)藥物相對(duì)較少，分別為2種、2種、1種；農(nóng)業(yè)除蟲(chóng)類獸藥有9種，約占涉及獸藥種類的11.1%；激素類藥物有6種，約占涉及種類的7.4%，其中糖皮質(zhì)激素類藥物有2種，性激素藥物3種；神經(jīng)類藥物3種，約占3.7%；消炎鎮(zhèn)痛類藥物1種，僅占1.2%。

圖1 81種獸藥殘留最大殘留限量種類數(shù)量比較Fig.1 Comparison of the number of 81 types ofveterinary drug residue maximum residue limits

1.2 GB 31650-2019牛奶中獸藥殘留規(guī)定與農(nóng)業(yè)部公告第235號(hào)比較分析 自2002年中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第235號(hào)發(fā)布到如今已有17年，第235號(hào)公告對(duì)59種牛奶中獸藥檢出最大限量做出了標(biāo)準(zhǔn)，食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 31650-2019對(duì)第235號(hào)公告做出了補(bǔ)充及修改，增加了23種牛奶獸藥殘留檢出最大標(biāo)準(zhǔn)，具體見(jiàn)表1。增加的牛奶獸藥最高檢出限量標(biāo)準(zhǔn)中以抗寄生蟲(chóng)類獸藥為最多，有12種；抗菌類藥物有5種，其中大環(huán)內(nèi)酯類抗生素2種；農(nóng)業(yè)除蟲(chóng)劑4種；激素以及消炎鎮(zhèn)痛類各1種。同時(shí)GB 31650-2019對(duì)7種牛奶中獸藥殘留檢出最高限量進(jìn)行了修改。新國(guó)標(biāo)增加了多拉菌素、新霉素、泰樂(lè)菌素的獸藥殘留最大檢出標(biāo)準(zhǔn)，其中新霉素、泰樂(lè)菌素的最高檢出限分別增加了200%和100%，多拉菌素由牛奶中不得檢出更改為最大檢出限量為15 μg/kg，而農(nóng)業(yè)殺蟲(chóng)類藥物辛硫磷在新國(guó)標(biāo)中卻未做最大檢出限量規(guī)定，具體見(jiàn)表2。

表1 新國(guó)標(biāo)相比舊國(guó)標(biāo)新增獸藥檢出限標(biāo)準(zhǔn)Tab 1 New veterinary drug detection limit standardscompared with the old national standard

表2 新國(guó)標(biāo)與第235號(hào)公告獸藥檢出限變化Tab 2 New national standards and announcementNo.235 changes in detection limits of veterinary drugs

1.3 我國(guó)與國(guó)外主要乳品貿(mào)易國(guó)家獸藥殘留檢出標(biāo)準(zhǔn)比較分析 為保障國(guó)內(nèi)和國(guó)際乳品流通的安全性，保障人民身體健康，全球各國(guó)與組織都對(duì)牛奶中獸藥殘留最大檢出限量做出了規(guī)定，乳品質(zhì)量安全不達(dá)標(biāo)，獸藥殘留檢出過(guò)量的產(chǎn)品禁止進(jìn)入市場(chǎng)并禁止國(guó)際流通。針對(duì)牛乳中獸藥殘留檢出限量問(wèn)題，共搜集了7個(gè)世界上主要的乳品貿(mào)易國(guó)家及組織規(guī)定的牛奶中獸藥殘留檢出限量標(biāo)準(zhǔn)，從規(guī)定獸藥的種類、數(shù)量等方面進(jìn)行了分析。

不同國(guó)家和組織所規(guī)定的牛奶中獸藥殘留限定的數(shù)量之間有較大的差異，如圖2所示。日本是所調(diào)查國(guó)家或組織中規(guī)定獸藥殘留限定數(shù)量最多的國(guó)家，2019年日本肯定列表中所規(guī)定的獸藥殘留數(shù)量高達(dá)355種[4]；澳大利亞位居其次，2019年規(guī)定了319種獸藥殘留限量[5]；歐盟規(guī)定了牛奶中111種獸藥殘留限量[6]；中國(guó)新國(guó)標(biāo)規(guī)定牛奶中獸藥殘留限量數(shù)量為81種，緊隨其后；新西蘭2019年所規(guī)定牛奶中獸藥殘留數(shù)量為55種[7]；2018年加拿大獸藥署以及國(guó)際食品法典委員會(huì)CAC(Codex Alimentarius Commission)修訂獸藥殘留標(biāo)準(zhǔn)(CX/MRL 2-2018)，兩者規(guī)定的限定數(shù)量相當(dāng)，分別為37、36種[8-9]。

圖2 主流國(guó)家或組織規(guī)定牛奶中獸藥殘留最大殘留限量種類數(shù)量比較Fig 2 Comparison of the number of types of maximumresidue limits for veterinary drug residues in milkregulated by mainstream countries or organizations

本文還對(duì)各牛奶生產(chǎn)銷售主流國(guó)家及組織的不同用途的獸藥種類數(shù)量進(jìn)行了比對(duì)分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。不同國(guó)家或組織對(duì)不同類型獸藥殘留的限量數(shù)量的規(guī)定各不相同，各國(guó)及組織對(duì)抗菌藥的規(guī)定數(shù)量所占比重普遍較大，除了日本、澳大利亞所占比例較低，分別為30.4%、28.8%，其余國(guó)家或組織抗菌藥物所占比例均已達(dá)到45.0%以上。中國(guó)僅次于加拿大以及CAC，所占比例為45.7%；其次為殺蟲(chóng)劑和抗寄生蟲(chóng)類藥物，其中殺蟲(chóng)劑類藥物除加拿大并未對(duì)獸藥殘留限量作規(guī)定外，其余各國(guó)、組織規(guī)定限量數(shù)量占比均在10.0%以上，日本和澳大利亞更是占到了32.4%和26.0%，而中國(guó)只占11.1%；抗寄生蟲(chóng)類藥物各國(guó)、組織規(guī)定限量數(shù)量差異較大，中國(guó)、CAC所占比例最高分別為30.9%和24.3%，而日本、澳大利亞、新西蘭三個(gè)國(guó)家抗寄生蟲(chóng)藥規(guī)定限量數(shù)量占比較低，分別為0.48%、5.6%、7.3%；除草劑類藥物，僅有日本、澳大利亞、新西蘭有所涉及，特別是澳大利亞和日本除草劑類藥物規(guī)定限量數(shù)量占比高達(dá)34.5%和21.4%，新西蘭為16.4%；激素類藥物，除新西蘭外各國(guó)或組織都有涉及，其中中國(guó)占比最大，為7.4%，歐盟和CAC位居其次為5.4%，日本、澳大利亞兩國(guó)規(guī)定激素類藥物限量數(shù)量分別為6種和1種，所占比例僅為1.7%和0.3%；植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑類藥物，僅有日本、澳大利亞兩國(guó)做出了限量規(guī)定，其余幾國(guó)或組織并未涉及；此外本文所涉及到的所有獸藥種類，僅有日本、澳大利亞涉及到了全部7種獸藥類型，其他國(guó)家或組織主要對(duì)除草劑以及植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑類藥物沒(méi)有涉及。

圖3 不同用途獸藥殘留在各個(gè)國(guó)家或組織中的分布比較Fig 3 Distribution comparison of veterinary drug residues for different purposes indifferent countries or organizations

2 牛奶中主要獸藥殘留檢測(cè)方法比較

近年來(lái)食品安全問(wèn)題越來(lái)越引起人們的重視，國(guó)家雖然對(duì)動(dòng)物用藥限量已有了明確規(guī)定，但農(nóng)場(chǎng)為追求經(jīng)濟(jì)效益、減少損失，依然會(huì)不顧風(fēng)險(xiǎn)加大用藥量，牛奶中的獸藥殘留問(wèn)題也日漸嚴(yán)重，獸藥殘留的檢測(cè)方法更是得到了極大的發(fā)展與完善，目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于牛奶中獸藥殘留的檢測(cè)方法主要分為4大類[10]：儀器分析法、免疫法、適應(yīng)體傳感器檢測(cè)法以及微生物法。

2.1 儀器分析法 儀器分析法是檢測(cè)牛奶中獸藥殘留應(yīng)用最廣泛的方法，該方法根據(jù)獸藥中的特異性基團(tuán)或標(biāo)志性物質(zhì)的反應(yīng)等來(lái)測(cè)定其含量。儀器分析法需要對(duì)樣品進(jìn)行復(fù)雜的前處理，迫使獸藥特異性基團(tuán)或標(biāo)志性物質(zhì)與牛奶中成分分離[11]，而后用儀器進(jìn)行定性或定量分析?，F(xiàn)行儀器分析法主要包括色譜法和光譜法[12]。色譜法主要有：氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、色譜質(zhì)譜聯(lián)用法(GC/MS、GC/MS-MS、LC/MS、LC/MS-MS、TLC/MS)。光譜法主要有：近紅外光譜法(FT-NIR)、中紅外光譜法(FT-MIR)。國(guó)內(nèi)多采用氣相色譜和質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用技術(shù)定性和定量分析食品中殘留物，對(duì)于熱不穩(wěn)定的化合物則用HPLC-MS技術(shù)進(jìn)行確認(rèn)分析。歐盟采用色譜分離與放免技術(shù)的聯(lián)用和免疫親和色譜等技術(shù)來(lái)分析動(dòng)物組織中的抗生素、黃曲霉毒素、激素和β-激動(dòng)劑等[13]。2013年Cámara等[14]建立了一種利用高效液相色譜結(jié)合二極管陣列檢測(cè)器可同時(shí)檢測(cè)多種β-內(nèi)酰胺類獸藥的方法。獸藥殘留檢出限達(dá)到3.4～8.6 μg /L，滿足國(guó)家最低殘留限量的要求。Yu等[15]建立了一種簡(jiǎn)單、靈敏、高效的牛奶和奶粉中獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)，該方法利用C18攪拌棒吸附萃取技術(shù)結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)可對(duì)牛奶中6種磺胺類藥物實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)。Lv 等[16]建立了一種利用固相萃取結(jié)合高效液相色譜檢測(cè)樣品中四環(huán)素類藥物殘留的新方法。

2.2 微生物檢測(cè)法 微生物檢測(cè)法又叫做微生物抑制試驗(yàn)(microbial inhibitions test, MIT), 牛奶中的殘留物微生物抑制劑測(cè)試最早可追溯到1952年。該方法主要應(yīng)用在抗生素殘留量的檢測(cè)[17]，由于抗生素能對(duì)微生物的新陳代謝和生理機(jī)能產(chǎn)生抑制作用，所以可以用來(lái)檢測(cè)并計(jì)算出牛奶中獸藥殘留量，檢測(cè)方法主要有三種：微生物抑制法、微生物受體法和酶比色法，常見(jiàn)的檢測(cè)方法有氯化三苯基四氮唑法(TTC法)和微生物受體檢測(cè)法等[18]。MIT法是以嗜熱脂肪芽孢桿菌為指示菌，該菌對(duì)多種抗生素十分敏感，而對(duì)青霉素類和頭孢菌素類尤為敏感。我國(guó)較早和較多使用的是荷蘭DSM Foods公司的戴爾沃系列，該系列MIT試劑盒最早開(kāi)發(fā)于50年代，目前已成為全球公認(rèn)的乳品抗生素殘留的檢測(cè)方法[13]。TTC法適用于能殺滅或抑制嗜熱乳酸鏈球菌的各種常用抗生素或消毒劑的檢驗(yàn), 最初選擇嗜熱乳酸鏈球菌是因?yàn)榇司鷮?duì)牛乳中青霉素較為敏感, 該方法1955年4月1日起在我國(guó)生效為法定方法，并最終被GB/T 4789.27-2008替代。

Kumar等[19]利用微生物檢測(cè)法對(duì)牛奶中的萌芽芽孢和休眠孢子進(jìn)行了獸藥殘留抑制實(shí)驗(yàn)，來(lái)判定并檢測(cè)獸藥殘留情況。該項(xiàng)研究表明此方法或可以用于奶制品產(chǎn)業(yè)，但因檢測(cè)靈敏性與選擇性較差，僅能做半定量的檢測(cè)。Samsonova等[20]建立了檢測(cè)多種不同類型食品中獸藥(氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素)殘留的方法并選擇了微生物抑制法、免疫法、以及生物傳感器檢測(cè)法，對(duì)三種方法的優(yōu)劣進(jìn)行了比較分析，論述了未來(lái)獸藥殘留檢測(cè)方法的發(fā)展趨勢(shì)。Yamaki等[21]使用微生物檢測(cè)法對(duì)西班牙的一個(gè)牧場(chǎng)中的羊奶中殘留的獸藥進(jìn)行了分析，結(jié)果表明樣品中的陽(yáng)性率為2.6%，其中β-內(nèi)酰胺類獸藥大約為25%，但是該方法存在一定的假陽(yáng)性，且靈敏度有待提高。

2.3 免疫法 免疫法是根據(jù)抗體與抗原之間的高選擇性特異結(jié)合為基礎(chǔ)而建立的檢測(cè)方法[22-23]?？乖c抗體間的結(jié)合具有高度的敏感性與特異性，根據(jù)標(biāo)記抗體或抗原與對(duì)應(yīng)適配體進(jìn)行反應(yīng)呈現(xiàn)出的函數(shù)關(guān)系，此方法可以對(duì)牛奶樣品中的獸藥殘留進(jìn)行定性或定量分析。利用免疫法原理建立的一系列便捷、高效的檢測(cè)方法已被廣泛應(yīng)用于牛奶獸藥殘留檢測(cè)[24]。最常見(jiàn)的有快速檢測(cè)試紙卡、放射免疫測(cè)定法(Radioimmunoassay,RIA)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA試劑盒法)。目前分析ELISA試劑盒正在興起，并不局限于乳品抗感染藥物的檢測(cè)，其他獸藥如激素殘留、抗寄生蟲(chóng)藥物，以及農(nóng)藥殘留、微生物毒素殘留都已有針對(duì)的ELISA試劑盒。2001年12月國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局推薦Randox公司的ELISA試劑盒作為動(dòng)物激素、抗生素殘留的首選篩選試劑。Charm Ⅱ 7600是現(xiàn)有的快速放射性檢疫檢測(cè)技術(shù)中最為成功的例子。該檢測(cè)系統(tǒng)就是利用細(xì)菌的專一性受體來(lái)識(shí)別、結(jié)合同一類抗生素族中的母環(huán)為工作原理而建立起來(lái)的、較為快捷的生物放射檢測(cè)技術(shù)，能同時(shí)檢測(cè)同一抗生素族在樣品中的殘留情況, 是現(xiàn)有的快速放射性檢疫檢測(cè)技術(shù)中最為成功的例子。目前Charm Ⅱ 7600檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)β-內(nèi)酰胺類、氯霉素類、四環(huán)素類、磺胺類、鄰氯青霉素及堿性磷酸酶等7項(xiàng)檢測(cè)已被FDA認(rèn)證[13]。2016年Chen等[25]建立了熒光偏振免疫分析法，通過(guò)異硫氰酸熒光素標(biāo)記的獸藥，在黑暗條件，示蹤劑與抗體結(jié)合，然后測(cè)量加入不同濃度的藥物與示蹤劑競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體后的熒光偏振值，進(jìn)而高靈敏度檢測(cè)奶制品中克林沙星的殘留。Pennacchio 等[26]利用免疫傳感器方法檢測(cè)牛奶中的青霉素G，該方法可以直接地應(yīng)用于檢測(cè)牛奶中青霉素G的殘留，而不受其他物質(zhì)的干擾。

2.4 適應(yīng)體傳感器檢測(cè)法 核酸適配體概念的提出最早可追溯到1990年[27]。核酸適配體能與多種目標(biāo)物實(shí)現(xiàn)特異性結(jié)合，適配體與靶向目標(biāo)物結(jié)合后會(huì)發(fā)生結(jié)構(gòu)上的改變，根據(jù)核酸適配體的這一特性，可用適配體作為探針檢測(cè)多種目標(biāo)物，包括霉菌毒素、獸藥殘留、重金屬等[28-29]，由于適配體是一段特定DNA序列，可不受自然及物理?xiàng)l件約束直接體外合成并且其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，現(xiàn)已受到研究人員廣泛關(guān)注[30]。2013年Sun等[31]開(kāi)發(fā)了一種基于石墨烯-納米金離子等多種復(fù)合材料之間協(xié)同的適配體傳感器，該適配體傳感器可用于牛奶中卡那霉素的檢測(cè)。

3 展 望

自2002年中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第235號(hào)發(fā)布到如今已有17年，第235號(hào)公告對(duì)59種牛奶中獸藥檢出最大限量做出了標(biāo)準(zhǔn)，2019年9月6日發(fā)布，即將于2020年4月1日正式實(shí)施的食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 31650-2019對(duì)第235號(hào)公告做出了補(bǔ)充及修改，增加了23種牛奶獸藥殘留檢出最大標(biāo)準(zhǔn)，并對(duì)7種獸藥殘留檢出最大限量做出了修改，進(jìn)一步完善了國(guó)內(nèi)獸藥使用規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)，而對(duì)比世界上主要乳品貿(mào)易國(guó)家如日本、澳大利亞的限量規(guī)定數(shù)量上還有一定的差距，特別是在除草劑類藥物和殺蟲(chóng)劑類藥物的限量規(guī)定上，國(guó)內(nèi)沒(méi)有規(guī)定或是規(guī)定比例較少。

近年來(lái)食品安全問(wèn)題越來(lái)越受重視，隨著科技的發(fā)展和生物化學(xué)領(lǐng)域的不斷探索，人類為應(yīng)對(duì)動(dòng)物性疾病做出了諸多努力，特別是在動(dòng)物疾病用藥方面，新型特效藥物不斷研發(fā)制造，這就導(dǎo)致了獸藥數(shù)量繁多，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)法規(guī)更新不及時(shí)，內(nèi)容涵蓋不全，從而使食品生產(chǎn)廠家無(wú)法規(guī)可依，無(wú)標(biāo)準(zhǔn)參照。同時(shí)農(nóng)場(chǎng)為追求經(jīng)濟(jì)效益、減少損失，依然會(huì)不顧風(fēng)險(xiǎn)加大用藥量，牛奶中的獸藥殘留問(wèn)題得不到根本的解決，為應(yīng)對(duì)獸藥殘留問(wèn)題，應(yīng)盡快完善食品獸藥殘留法規(guī)、最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)和監(jiān)管體系，積極有效的控制牛奶中獸藥殘留問(wèn)題。