牛蒡子粉中牛蒡苷元在仔豬體內(nèi)的藥物動力學(xué)研究

冉志平，吳利軍，楊文海，陳潔，陳夏冰，邵志勇，金爾光，周華，童偉文，李杰，何斌

(武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，武漢 430208)

牛蒡子是一種常用中藥，性寒，味辛、苦，歸肺、胃經(jīng)，具有疏散風(fēng)熱、宣肺透疹等功效，獸醫(yī)臨床上用于治療外感風(fēng)熱、咳嗽氣喘、咽喉腫痛等癥[1]。牛蒡子的主要有效成分為木脂素類化合物，包括牛蒡苷和牛蒡苷元等[2]，牛蒡苷在胃腸道微生物作用下轉(zhuǎn)化為牛蒡苷元發(fā)揮藥理作用[3]，即牛蒡苷元為牛蒡子的直接有效成分[4]。牛蒡苷元具有抗炎[5]、抗病毒[6]、抗腫瘤[7]、抗糖尿病[8]等眾多藥理作用，具有良好的研發(fā)和應(yīng)用前景；本文研究了靜脈注射牛蒡甘元和牛蒡子粉灌胃給藥后在仔豬體內(nèi)的藥物代謝動力學(xué)特征，為新獸藥的研發(fā)和臨床用藥提供理論依據(jù)和參考，為中獸藥現(xiàn)代化進(jìn)行有意義的探索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品 牛蒡苷元標(biāo)準(zhǔn)品(批號：160509)含量≥98.1%，由上海融禾醫(yī)藥科技有限公司生產(chǎn)；準(zhǔn)確稱取牛蒡苷元標(biāo)準(zhǔn)品，甲醇溶解加水定容，制備含牛蒡苷元1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。牛蒡子粉由牛蒡子經(jīng)100目粉碎而得，牛蒡子粉中牛蒡苷元和牛蒡苷含量采用中《華人民共和國獸藥典》推薦方法經(jīng)實驗室檢測，含牛蒡苷元0.33%、牛蒡苷4.33%，購于武漢九州通醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司。乙腈、甲醇色譜級，購自美國 Themo公司；二氯甲烷、丙二醇等分析純，購于上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 儀器 1200型高效液相色譜儀，自動進(jìn)樣器、紫外檢測器，美國AgiLent公司；D3024R 高速離心機(jī)，SCILO-GEX公司；電子天平(±0.0001 g)，德國賽多利斯公司；N-EVAPTM111型氮吹儀，美國路易公司。

1.1.3 動物 杜長大仔豬8頭，雌雄各半，編號1-8號，體重：30.0±5.0kg；購于武漢博牧生物科技有限公司。試驗前正常飼養(yǎng)觀察1周，自由飲水和采食，飼料為不含任何藥物的全價日糧。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱為AgiLent SB-C18柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)；檢測波長為280 nm；流動相為甲醇：乙腈：水(31∶20∶49，V∶V∶V)；流速為0.8 mL/min；進(jìn)樣量為30 μL；柱溫為(30±0.1)℃[9，10，11]。

1.2.2 血漿樣品處理 將血漿樣品從-20℃冰箱中取出，室溫下自然解凍，準(zhǔn)確吸取0.5 mL于5.0 mL離心管中，加入2.0 mL二氯甲烷，渦旋振蕩60 s后以10000 r/min離心10.0 min吸取二氯甲烷層，同法提取兩次，合并兩次二氯甲烷層，置于15.0 mL離心管中，40℃水浴氮氣吹干，殘渣用200 μL流動相溶解，10000 r/min離心10.0 min，上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后以30 μL進(jìn)樣分析，記錄色譜圖[12-14]。

1.2.3 血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 向7支5.0 mL聚丙烯離心管中各加入500 μL空白血漿，然后依次加入一系列已稀釋好的牛蒡苷元標(biāo)準(zhǔn)工作液，得到藥物濃度依次為0.05、0.1、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0 μg/mL的血漿樣品。分別按照血漿樣品處理方法處理，進(jìn)行HPLC分析，記錄色譜圖。以測得的牛蒡苷元峰面積(x)為橫坐標(biāo)，濃度(y)為縱坐標(biāo)，建立血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合回歸方程，求出相關(guān)系數(shù)(r)。

1.2.4 方法學(xué)驗證 取空白血漿500 μL置于5.0 mL聚丙烯離心管中，然后依次加入已稀釋好的牛蒡苷元標(biāo)準(zhǔn)工作液高、中、低三個濃度，充分混合均勻，配制成含牛蒡苷元濃度分別為5.0、1.0、0.1 μg/mL的血漿樣品，按照血漿處理方法進(jìn)行處理，進(jìn)行HPLC檢測分析，每個濃度一天內(nèi)設(shè)置5個平行進(jìn)行檢測，以考察日內(nèi)變異系數(shù)；連續(xù)重復(fù)檢測5 d，以測定日間變異系數(shù)。并計算方法的回收率、準(zhǔn)確度、精密度以及靈敏度。

1.2.5 藥物動力學(xué)試驗設(shè)計 給藥前12.0 h 禁食，對每頭仔豬進(jìn)行稱重，并采集血樣作為空白對照。1-8號仔豬以每頭1.0 g/kg.bw的牛蒡子粉灌胃給藥。牛蒡子粉灌胃給藥后，每頭仔豬于0.167、0.333、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、8.0、12.0、24.0、48.0 h采血5.0 mL左右；所采集血樣置于已加肝素鈉的聚丙烯離心管中，以3000 r/min離心15.0 min分離血漿，取上清液于-20 ℃冷凍保存，待測定[15]。

1.2.6 豬血漿中藥物濃度的測定 將給藥后不同時間點獲得的血漿，按“血漿樣品的處理"方法處理后進(jìn)行HPLC分析，計算牛蒡苷元的峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，計算出血漿中牛蒡苷元的濃度。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 采用ExceL軟件分析處理方法學(xué)數(shù)據(jù)并繪制血漿標(biāo)準(zhǔn)工作曲線及藥-時曲線圖；藥物動力學(xué)模型擬合及參數(shù)計算均采用中國藥理學(xué)會數(shù)學(xué)專業(yè)委員會編制的3p97藥物動力學(xué)軟件分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛蒡苷元在血漿中的色譜行為 在本研究所建立的方法下，牛蒡苷元保留時間為14.0 min，峰形對稱性良好，基線平穩(wěn)，與雜質(zhì)峰分離良好，檢測效率高?？瞻籽獫{色譜圖如圖1，空白血漿添加牛蒡苷元(1.0 μg/mL)色譜圖如圖2，樣品(0.55 μg/mL)血漿色譜圖如圖3。

圖1 空白血漿色譜圖Fig 1 Chromatogram of blank plasma

圖2 空白血漿中添加牛蒡苷元(1 μg/mL)色譜圖Fig 2 Chromatogram of plasma with Arctigenin(1.0 μg/mL)

圖3 給藥后血漿中牛蒡苷元(0.55μg/mL)色譜圖Fig 3 Chromatogram of arctigenin in plasma(0.55 μg/mL) after administration

2.2 血漿標(biāo)準(zhǔn)工作曲線 牛蒡苷元標(biāo)準(zhǔn)品在0.05～10.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r=0.9998，線性方程為y=0.0265x-0.0328(x表示牛蒡苷元的峰面積；y表示牛蒡苷元在血漿中的濃度)。牛蒡苷元在仔豬血漿中的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線如圖4。

圖4牛蒡苷元在血漿中的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線Fig 4 Calibration curve of Arctigenin in piglet plasma

2.3 方法學(xué)驗證結(jié)果 牛蒡苷元在仔豬血漿中的最低檢測限為0.025 μg/mL，最低定量限為0.05 μg/mL。牛蒡苷元在0.05～5.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為y=0.0264x-0.0295，相關(guān)系數(shù)為r=0.9998。該方法回收率大于83.35%，日內(nèi)變異系數(shù)均在3.51%以內(nèi)，日間變異系數(shù)均在5.90%以內(nèi)；仔豬空白血漿中添加牛蒡苷元的回收率和變異系數(shù)如表1和表2。

表1 豬空白血漿中添加ACT的回收率和日內(nèi)變異系數(shù)考察結(jié)果(n=5)Tab 1 Intra-day recovery and precision values forthe determination of ACT in pig plasma(n=5)

表2 豬空白血漿中添加ACT的回收率和日間變異系數(shù)考察結(jié)果(n=5)Tab 2 Inter-day recovery and precision values forthe determination of ACT in pig plasma(n=5)

2.4 藥物動力學(xué)試驗數(shù)據(jù) 單劑量灌喂牛蒡子粉(1.0 g/kg·bw)后，在仔豬體內(nèi)的血藥濃度如表3，主要藥物動力學(xué)參數(shù)如表4，血藥濃度-時間曲如圖5。

圖5 單劑量灌胃牛蒡子粉(1.0 g/kg·bw)后牛蒡苷元在豬體內(nèi)的藥物濃度-時間曲線Fig 5 The curve of drug concentration-time in pigs ofACT after a single oral dose of Fructus arctii powder(1.0 g/kg·bw)

表3 單劑量灌胃牛蒡子粉(1.0 g/kg·bw)后牛蒡苷元在豬體內(nèi)的血藥濃度(μg/mL)Tab 3 Blood concentration(μg/mL) of ACT in pigs after a single oral dose of Fructus arctii powder(1.0 g/kg·bw)

表4 單劑量灌胃牛蒡子粉(1.0g/kg.bw)后在豬體內(nèi)的主要藥物動力學(xué)參數(shù)(n=8)Tab 4 The main pharmacokinetic parameters in pigsafter a single oral dose of Fructus arctii powder(1.0 g/kg·bw)

灌胃牛蒡子粉后，牛蒡苷元在仔豬體內(nèi)的血藥濃度-時間數(shù)據(jù)符合有吸收二室模型，藥時曲線出現(xiàn)雙峰，達(dá)峰時間(tmax)為0.853±0.211 h，峰濃度(cmax)為0.430±0.035μg /mL，吸收半衰期(t1/2ka)為0.274±0.102h、消除半衰期t1/2β為63.467±29.115 h，表觀分布容積Vd為1.680±0.402 L/kg，表明牛蒡子粉在仔豬體內(nèi)吸收較快，分布較為廣泛，代謝消除極為緩慢。

3 討論與結(jié)論

牛蒡子粉灌胃給藥后，牛蒡苷元在仔豬體內(nèi)的吸收半衰期t1/2ka(0.274±0.102 h)較短，達(dá)峰時間tmax(0.853±0.211 h)較快，表明其吸收迅速、達(dá)到最高血藥濃度時間較短；消除半衰期t1/2β(63.467±29.115 h)較長，表觀分布容積Vd(1.680±0.402 L/kg)較大，峰濃度cmax(0.430±0.035 μg /mL)相對較低，這與He 報道的大鼠口服牛蒡苷元后迅速分布到組織中的結(jié)論相符[13]。表明牛蒡苷元在仔豬體內(nèi)消除較為緩慢，較大程度的分布到組織中，導(dǎo)致其在血液中的血藥濃度相對較低，可在仔豬體內(nèi)較長時間發(fā)揮作用。

灌胃給藥后牛蒡子粉中牛蒡苷元的血藥濃度-時間曲線呈現(xiàn)明顯的雙峰，藥物第一次達(dá)峰時間(Tmax)為0.5 h，峰濃度(Cmax)為0.606±0.036 μg/mL，在1.5 h時第二次達(dá)峰，峰濃度(Cmax)為0.413±0.036 μg/mL，這與袁媛測定的牛蒡子水提物在小鼠體內(nèi)的血藥濃度呈現(xiàn)雙峰現(xiàn)象相符，袁媛對牛蒡子水提物進(jìn)行藥效動力學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)在延長小鼠咳嗽潛伏期與抑制咳嗽次數(shù)方面也有兩個高峰，說明藥物的吸收過程比較特殊，且藥效與藥代動力學(xué)研究存在關(guān)聯(lián)，并分析雙峰原因可能是由水提物中牛蒡苷轉(zhuǎn)化成牛蒡苷元引起的，也有可能是肝腸循環(huán)引起[16]。

在中藥藥物動力學(xué)研究中，出現(xiàn)雙峰的現(xiàn)象較多，機(jī)理也比較復(fù)雜，這與中藥成分復(fù)雜以及相同母核的成分之間相互轉(zhuǎn)化等特點相關(guān)[17]。郭曉宇等[18]研究大鼠口服黃芩苷與黃芩素的藥物動力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)二者血藥濃度-時間曲線均為雙峰，認(rèn)為二者的雙峰現(xiàn)象可能是由黃芩苷在體內(nèi)腸道菌群的作用下被水解成其苷元形式的黃芩素和腸肝循環(huán)引起，Shi 等[19]認(rèn)為黃芩素的雙峰現(xiàn)象可能與相同母核成分之間的轉(zhuǎn)化有關(guān)。陽長明[20]對保心微丸中的肉桂酸成分在大鼠體內(nèi)的藥物動力學(xué)特征進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其血藥濃度-時間曲線為雙峰，認(rèn)為肉桂醛在體內(nèi)可氧化成肉桂酸，再次被吸收后使曲線呈現(xiàn)雙峰，也可能因為腸肝循環(huán)引起。

據(jù)此，本試驗給仔豬灌胃牛蒡子粉后，藥時曲線的雙峰現(xiàn)象很有可能是由牛蒡苷轉(zhuǎn)化為牛蒡苷元所致，血漿中所測得的牛蒡苷元一部分是由牛蒡子粉中所含的牛蒡苷元以原型吸收而來，另一部分是牛蒡苷在胃腸道菌群的作用下轉(zhuǎn)化為牛蒡苷元而來；也有可能是因為肝腸循環(huán)而導(dǎo)致第二峰的出現(xiàn)，也有可能是兩方面原因共同作用的結(jié)果，有關(guān)牛蒡苷元雙峰現(xiàn)象的具體原因有待進(jìn)一步研究。