茯苓多糖聯(lián)合恩諾沙星體內外抗菌活性評價

黃松，崔明旭*，劉愛玲，武曉英，史德勝，王一凡，栗棲鳳，李守軍，曹貴東

(1.瑞普(天津)生物藥業(yè)有限公司，天津 300300；2.天津瑞普生物技術股份有限公司，天津 300308；3.太原師范學院生物系，山西晉中 030619；4.山西瑞象生物藥業(yè)有限公司，太原 030032)

生物膜是指細菌粘附于接觸物表面，分泌多糖基質、纖維蛋白、脂質蛋白等，將其自身包繞其中而形成的大量細菌聚集膜樣物[1]。生物膜可以增強細菌生存的抗逆性，使其在接受藥物治療時，產生抗藥性，導致疾病不易治愈[2]。茯苓多糖是一種陽離子多聚糖，通過堿提醇沉法提取自擬層孔菌科真菌茯苓的干燥菌核。通過物理方法分離得到的茯苓多糖具有良好的生物相容性和無毒性[3]。有文獻報導，殼聚糖和抗生素聯(lián)用，可以增強抗生素對細菌生物膜的清除能力，增強抗生素的殺菌效果[4-5]。目前，尚未有關于茯苓多糖與抗生素聯(lián)合使用的報告，在本研究中，評價了茯苓多糖聯(lián)合恩諾沙星對不同細菌體外和體內的抗菌作用。

1 材料與方法

1.1 儀器 HR40-‖ A2型生物安全柜(青島海爾)；ME204電子天平(上海梅特勒)；ME55電子天平(上海梅特勒)；0.22 μm過濾器(日本島津)；1 mL一次性注射器(江蘇治宇)；G154TW高壓蒸汽滅菌鍋(廈門致微)；96孔培養(yǎng)板(美國Coming)；生化培養(yǎng)箱(寧波江南儀器廠)；恒溫搖床(金壇杰瑞爾)；酶標儀(北京普朗)；移液器(德國Eppendoff)。

1.2 材料與試劑 耐藥金黃色葡萄球菌(BSA)分離自白羽肉雞(Brolier)，由瑞普(天津)生物藥業(yè)有限公司謝玲玲分離鑒定并保存于瑞普藥物研究院；金黃色葡萄球菌ATCC 190807(SA)購自美國菌種保藏中心；大腸桿菌BNCC 336902(E.coli)購自北納生物公司；茯苓多糖(SJJ)、殼寡糖(COS)和恩諾沙星注射液(ENR)由瑞普(天津)生物藥業(yè)有限公司生產；4周齡昆明小白鼠36只，購自天津裕達實驗動物養(yǎng)殖有限公司；二甲亞砜(DMSO)購自天津博迪；噻唑藍(MTT)購自上海阿拉丁公司；醫(yī)用酒精；脫脂棉；其他試劑均為分析純。

胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)：取30 g，加入到1 L去離子水中，加熱煮沸，完全溶解后，分裝，121 ℃滅菌30 min，待用。

胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)：取30 g胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基和16 g瓊脂，加入1 L去離子水，加熱煮沸，完全溶解后，分裝，121 ℃滅菌30 min，在生物安全柜中冷卻至60 ℃，無菌操作倒入9 cm無菌培養(yǎng)皿中(每個培養(yǎng)皿20 mL)，冷卻凝固，待用。培養(yǎng)基均購自北京陸橋公司。

1.3 MIC的測定

1.3.1 細菌的復蘇 從-80 ℃冰箱中取出凍存的菌液，37 ℃水浴快速解凍，在TSA平板劃線培養(yǎng)，在37 ℃培養(yǎng)24 h后，挑取單菌落一環(huán)，接種于50 mL TSB培養(yǎng)基中，在37 ℃恒溫搖床中震蕩培養(yǎng)8 h，轉速為180 r/min，將菌液在4 ℃中保存?zhèn)溆肹6]。

1.3.2 二倍稀釋法測定MIC 取4 ℃保存的菌液，37 ℃，180 r/min培養(yǎng)6 h后，采用比濁稀釋法用TSB將細菌濃度調整到105CFU/mL，備用[7]。

在96孔板中，將藥物ENR、SJJ+ENR、COS+ENR、SJJ、COS做二倍稀釋，10個梯度，然后加入105CFU/mL的菌液，過夜培養(yǎng)后觀察抑菌情況[8-9]。

1.4 生物膜試驗

1.4.1 生物膜的培養(yǎng) 在96孔板的每個孔內加入200 μL稀釋至108CFU/mL的菌液，四周加無菌PBS，靜置在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內，培養(yǎng)72 h，讓細菌形成生物膜[10]。

1.4.2 藥敏試驗 形成生物膜后，棄掉培養(yǎng)基，用0.9%的NaCl溶液清洗1次，洗去浮游菌，再加入一定濃度的藥物(ENR為16，32，64，128 μg/mL；CHI為512 μg/mL和256 μg/mL)和TSB培養(yǎng)基，分為單獨用藥和聯(lián)合用藥兩種，在恒溫箱中孵育24 h[1]。

1.4.3 MTT試驗 藥物處理后，棄掉培養(yǎng)基，用0.9%的NaCl溶液清洗3次，加入10 μL 5 mg/mL的MTT溶液和90 μL的TSB培養(yǎng)基，37 ℃靜置孵育3 h后，然后棄掉培養(yǎng)基，加入100 μL DMSO溶解藍紫色結晶甲瓚，用酶標儀在570 nm處測定吸光值，吸光值同活菌數量成正比[1]。

1.5 體內抑菌試驗

1.5.1 試驗動物及飼養(yǎng) 清潔級健康昆明小白鼠(20±2)g，4周齡，共36只，同等條件下飼喂，晝夜節(jié)律，供給充足的飲水和飼料[10]。

1.5.2 攻毒菌液的制備 取對數期金黃色葡萄球菌(SA)，調整菌液濃度至108CFU/mL，9000 r/min離心10 min，棄去上清培養(yǎng)基，用無菌PBS重懸細菌，調整菌液濃度至5×105CFU/mL，4 ℃靜置待用[11]。

1.5.3 小鼠急性感染模型 將試驗小鼠隨機分為6組，每組6只，每只小鼠腹腔注射100 μL金黃色葡萄球菌(5×105CFU/mL，無菌PBS稀釋)，24 h后腹腔注射給藥，空白組注射100 μL生理鹽水，對照組1注射100 μL ENR，對照組2注射100 μL SJJ，對照組3注射100 μL COS，實驗組1注射100 μL SJJ+ENR，實驗組2注射100 μL COS+ENR，每天一次，連續(xù)給藥2 d[12]。

1.5.4 小鼠體內細菌載量的測定 最后一次給藥12 h后，斷頸處死小鼠，無菌取肝臟、腎臟和肺臟，稱取0.1 g，加入1 mL無菌PBS勻漿，稀釋適當倍數，取50 μL均勻涂布于TSA平板，37 ℃培養(yǎng)過夜，計數CFU[10]。

1.6 數據采集和分析 所有數據的分析和顯著性差異P值的計算均采用GraphPad Prism V6.01 數據分析軟件進行，用平均值±標準偏差(means±SD)表示，P值小于0.05為顯著性差異，P值大于0.05為無顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 MIC的測定 如表1所示，SJJ在兩種濃度下，沒有使ENR在體外抑制BSA的MIC降低。

表1 各種藥物對BSA的MICTab 1 MIC of BSA for various medicines

如表2所示，SJJ在兩種濃度下，沒有使ENR在體外抑制SA的MIC降低。

表2 各種藥物對SA的MICTab 2 MIC of SA for various medicines

如表3所示，SJJ在兩種濃度下，沒有使ENR在體外抑制E.coli的MIC降低。

表3 各種藥物對E.coli的MICTab 3 MIC of E.coli for various medicines

綜上，SJJ聯(lián)合ENR在體外抑制浮游菌的試驗表明，其沒有明顯的改善ENR的抑菌能力，不能使ENR的MIC降低。

2.2 生物膜試驗 在抑制BSA生物膜試驗中，結果如圖1所示，低濃度的ENR無明顯的抑制BSA生物膜的效果，而聯(lián)合SJJ后，表現出明顯的對BSA生物膜的抑制效果；在圖2中，COS與ENR聯(lián)合使用抑制BSA生物膜，無明顯的增效作用。

圖1 SJJ聯(lián)合ENR抑制BSA生物膜Fig 1 SJJ combined with ENR inhibits BSA biofilms

圖2 COS聯(lián)合ENR抑制BSA生物膜Fig 2 COS combined with ENR inhibits BSA biofilms

在抑制SA生物膜試驗中，結果如圖3所示，低濃度的ENR聯(lián)合SJJ后，抑制SA生物膜的效果無顯著性增加，高濃度的ENR聯(lián)合SJJ后，抑制SA生物膜的效果有顯著性增加；在圖4中，COS與ENR聯(lián)合使用抑制SA生物膜，無明顯的增效作用。

圖3 SJJ聯(lián)合ENR抑制SA生物膜Fig 3 SJJ combined with ENR inhibits SA biofilms

圖4 COS聯(lián)合ENR抑制SA生物膜Fig 4 COS combined with ENR inhibits SA biofilms

2.3 臟器載菌量的檢測 在體內抑菌試驗中，肝臟活菌計數結果如圖5所示，SJJ+ENR用藥后，肝臟的活菌數量明顯少于單獨使用ENR給藥組，表明SJJ可以顯著增加ENR在體內抑制SA的效果，如圖6和圖7所示，這一結果在腎臟和肺臟中也得到了驗證。

圖5 藥物處理后的肝臟活菌計數Fig 5 Viable count of liver bacteria after drug treatment

圖7 藥物處理后的肺臟活菌計數Fig 7 Viable count of lungs bacteria after drug treatment

3 討論與結論

試驗結果顯示，在抑制浮游菌的實驗中，SJJ和COS聯(lián)合ENR沒有明顯增強抑菌效果，其最小抑菌濃度仍保持不變；在抑制細菌生物膜的試驗中，SJJ聯(lián)合ENR在抑制BSA和SA生物膜的活性方面，有較好的效果，COS聯(lián)合ENR在抑制BSA生物膜方面，沒有明顯的增強ENR的抑菌活性，在抑制SA生物膜方面，COS減弱了ENR的生物活性；在體內試驗中，SJJ聯(lián)合ENR在治療小鼠肝臟和腎臟的細菌感染時，SJJ使ENR的抑菌效果顯著性增強，而COS處理的小鼠ENR抑菌活性沒有顯著性增強；在治療肺部感染方面，SJJ和COS均可以使ENR的抑菌效果顯著性提高，但是SJJ要略優(yōu)于COS。

吳俊偉[7]研究表明，恩諾沙星的抗菌譜廣，能作為廣譜抗菌藥使用，但是其抑菌能力偏弱。其設計的恩諾沙與硫酸粘菌素聯(lián)合藥敏試驗結果顯示，硫酸粘菌素對恩諾沙星抑制大腸桿菌、沙門氏菌有顯著的增效作用，對金黃色葡萄球菌的增效作用略有降低，這可能和硫酸粘菌素作用于細胞膜機理相關；馬燕[13]在研究殼聚糖與磺胺類抗生素聯(lián)合用藥抑制綠膿桿菌的試驗中發(fā)現，殼聚糖可以作為增強劑和抗生素聯(lián)用，起到強效抗菌的目的。本試驗中，采用水提醇沉得到的茯苓多糖聯(lián)合恩諾沙星進行體外和體內的藥敏試驗，在體外的浮游菌實驗中，茯苓多糖沒有明顯增強抗生素抑菌能力的作用，但是在生物膜和小鼠體內實驗中，可以從試驗結果看到明顯的增效，這和母海缽[14]在研究殼聚糖聯(lián)合慶大霉素抑制細菌生物被膜的實驗結果相吻合，表明陽離子多聚糖可以在富含大量陰離子的細菌生物被膜表面聚集，并破壞生物被膜的結構，增大其通透性，促進抗生素透過生物被膜，從而增強其抑制生物被膜的能力。本試驗所使用的茯苓多糖，也會富含大量陽離子的多聚糖，在聯(lián)合藥敏試驗中，表現出了更好的抑菌增效作用，為茯苓多糖產品開發(fā)提供了思路。

本文的研究發(fā)現，相比單獨的恩諾沙星，茯苓多糖(SJJ)和恩諾沙星聯(lián)用能更有效地破壞金黃色葡萄球菌的生物膜。根據文獻報導，陽離子多糖可以促進抗生素透過細菌的生物膜，從而破壞生物膜，抑制致病菌[15-16]。而茯苓多糖(SJJ)作為一種多陽離子多聚糖，正好利用這一策略，提高了抗生素的作用效果，減少了所需抗生素的劑量，有助于減少由于抗生素濫用導致的耐藥菌增多這一現象。同時，茯苓多糖和恩諾沙星聯(lián)用，在抑制分離自白羽肉雞的金黃色葡萄球菌(BSA)方面，也有很明顯的抗菌效果，這也為后續(xù)開發(fā)針對耐藥性致病菌提供了實驗依據。