雙黃連口服液質(zhì)量分析

吳雪琴，王勝義，王磊，王富河，吳亮紅，崔東安，孫研

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所,甘肅省中獸藥工程技術(shù)研究中心，蘭州 730050)

中獸醫(yī)藥作為我國(guó)獸醫(yī)醫(yī)療系統(tǒng)的重要組成部分，在疾病預(yù)防和治療方面發(fā)揮著重要作用。在全球高度重視細(xì)菌耐藥性和抗生素慎重使用背景下，中獸藥逐步成為保障動(dòng)物源食品安全的重要戰(zhàn)略工具[2]。另一方面，綠色、無(wú)抗的中獸藥亦成假獸藥盛行的重災(zāi)區(qū)。由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部組織的獸藥質(zhì)量監(jiān)督抽檢和風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)報(bào)告結(jié)果顯示，中藥類產(chǎn)品不合格率偏高，不合格項(xiàng)目主要集中在產(chǎn)品性狀、鑒別、檢查項(xiàng)和含量等，并有些中獸藥產(chǎn)品中檢出非法添加物[3-4]。因此，監(jiān)測(cè)中獸藥產(chǎn)品質(zhì)量總體水平和狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)可能影響藥品質(zhì)量與安全的因素及隱患，為進(jìn)一步強(qiáng)化對(duì)中獸藥產(chǎn)品質(zhì)量的監(jiān)管、不斷提高中獸藥產(chǎn)品安全有效和質(zhì)量水平的可控、保障動(dòng)物用藥安全和動(dòng)物源食品安全提供有力的技術(shù)支撐。

雙黃連口服液由金銀花、黃芩和連翹三味中藥提取精制而成，具有辛涼解表、清熱解毒的功效[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，雙黃連口服液具有廣譜抑菌[5]、抗病毒[6]、解熱抗炎[7]、免疫調(diào)節(jié)[8]等作用。在治療畜禽感冒、炎癥、病菌感染等疾病的臨床效果好，而且其毒副作用小，因此在獸醫(yī)臨床的應(yīng)用廣泛。同時(shí)，雙黃連制劑，組方精簡(jiǎn)，療效確切，因此是獸藥企業(yè)青睞的產(chǎn)品，目前有1245個(gè)獸藥企業(yè)具有雙黃連制劑的生產(chǎn)批準(zhǔn)文號(hào)，其中有569個(gè)企業(yè)生產(chǎn)雙黃連口服液。

研究以雙黃連口服液產(chǎn)品為研究對(duì)象，依據(jù)2015版《中國(guó)獸藥典》二部雙黃連口服液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，采用薄層色譜法和高效液相色譜法，分析雙黃連口服液中黃芩苷、綠原酸和連翹苷的色譜特征和含量，對(duì)市售雙黃連口服液進(jìn)行質(zhì)量考察，為進(jìn)一步提升雙黃連口服液質(zhì)量控制提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品和對(duì)照品 在市面上隨機(jī)購(gòu)買18個(gè)不同廠家的藥品，將其進(jìn)行編號(hào)1-18。綠原酸對(duì)照品(110753-201817)、黃芩苷對(duì)照品(110715-201821)、連翹苷對(duì)照品(110821-201816)。

1.1.2 儀器與試劑 高效液相色譜U-3000(賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司)；SP-20E全自動(dòng)點(diǎn)樣儀(上?？普苌萍加邢薰?；GoodLook-1000型全自動(dòng)薄層色譜成像系統(tǒng)(上?？普苌萍加邢薰?；SGel型電動(dòng)噴霧器(德國(guó)DESAGA公司)；ME235S型微量分析天平(賽多利斯公司)；AL104電子天平(梅特勒-托利多有限公司)；KH5200型超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；硅膠G板200 mm×100 mm(青島海洋化工廠生產(chǎn))；聚酰胺薄膜(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；中性氧化鋁柱(Agela Techologies)；精密鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)

甲醇、乙腈為色譜純；乙醇、醋酸、三氯甲烷、硫酸等為分析純。

1.2 方法

1.2.1 定性鑒別[1]

1.2.1.1 黃芩苷、綠原酸的定性鑒別方法[1]供試品溶液的制備：分別量取18個(gè)廠家的雙黃連口服液1 mL，分別加75%乙醇溶液5 mL，搖勻，既得。

對(duì)照品溶液的制備：精密稱取黃芩苷對(duì)照品11.49 mg、綠原酸對(duì)照品1.14 mg，加入75%乙醇分別定容在10 mL量瓶中，濃度為1.122和0.114 mg/mL。

方法測(cè)定：照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一聚酰胺薄膜上，以36%乙酸為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈365 nm下檢視。檢查供試品色譜中，在與黃芩苷對(duì)照品、綠原酸對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，是否顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。

1.2.1.2 連翹苷的薄層鑒別方法[1]供試品溶液的制備：分別量取18個(gè)廠家的雙黃連口服液1 mL，分別加甲醇5 mL，搖勻，靜置，取上清液，既得。

對(duì)照品溶液的制備：精密稱取連翹苷對(duì)照品5.13 mg，加甲醇定容在10 mL量瓶中，濃度為0.513 mg/mL。

方法測(cè)定：照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇(5∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%的硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。檢查供試品色譜中，在與連翹對(duì)照品色譜色譜相應(yīng)的位置上，是否顯相同顏色的斑點(diǎn)。

1.2.2 含量測(cè)定

1.2.2.1 黃芩苷、綠原酸含量測(cè)定[1]色譜條件：Waters Symmetry? C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相∶乙腈為A、0.4%磷酸溶液為B如表1梯度洗脫；體積流量1.0 mL/min；柱溫:30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)324 nm；在上述色譜條件下，理論塔板數(shù)按綠原酸峰計(jì)算不應(yīng)低于6000。

表1 黃芩苷、綠原酸洗脫梯度表Tab 1 Gradient table of Baicalin and chlorogenicacid elution

供試品溶液的制備：分別精密量取18個(gè)廠家的雙黃連口服液1 mL，置50 mL量瓶中，加50%甲醇適量，超聲處理20 min，放置至室溫，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾，即得。每個(gè)樣品平行3次。

對(duì)照品溶液的制備：精密稱取黃芩苷對(duì)照品20.20 mg，綠原酸對(duì)照品1.53 mg，分別置100 mL量瓶中，加50%甲醇定量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾，即得。

樣品含量測(cè)定：在上述色譜條件下，分別精密吸取對(duì)照品溶液和不同廠家供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀。

結(jié)果分析：根據(jù)對(duì)照品、供試品的峰面積，以外標(biāo)法計(jì)算樣品中黃芩苷、綠原酸的含量，用SPSS21.0進(jìn)行分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

1.2.2.2 連翹苷含量測(cè)定[1]色譜條件：Waters Symmetry? C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相∶乙腈∶水(25∶75)；檢測(cè)波長(zhǎng)278 nm；體積流量1.0 mL/min；柱溫:30 ℃；在上述色譜條件下，理論塔板數(shù)按連翹苷峰計(jì)算不應(yīng)低于6000。

供試品溶液的制備：分別精密量取18個(gè)廠家的雙黃連口服液1 mL，分別加在中性氧化鋁柱(100～12目，6 g，內(nèi)徑為1 cm)上，用70%乙醇40 mL洗脫，收集洗脫液，濃縮至干，殘?jiān)?0%甲醇適量，溫?zé)崾谷芙?，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾，即得。每個(gè)樣品平行3次。

對(duì)照品溶液的制備：精密稱取連翹苷對(duì)照品6.46 mg，置100 mL量瓶中，加50%甲醇定量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾，即得。

樣品含量測(cè)定：在上述色譜條件下，分別精密吸取對(duì)照品溶液和不同廠家供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，檢測(cè)。

結(jié)果分析：同1.2.2.1黃芩苷、綠原酸含量測(cè)定分析方法。

2 結(jié) 果

2.1 定性鑒別結(jié)果

2.1.1 黃芩苷、綠原酸定性鑒別結(jié)果 黃芩苷、綠原酸薄層色譜鑒別結(jié)果見圖1～圖7，供試品色譜中，樣品1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、12、13、14、15、18中的黃芩苷，樣品1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、12、13、15、16、18中的綠原酸在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上有相應(yīng)的斑點(diǎn)，而樣品8、9、14、15、17中的黃芩苷，樣品9、14、16、17中的綠原酸在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上無(wú)相應(yīng)的斑點(diǎn)。

圖1 1-3:雙黃連口服液樣品3.2.1；4:綠原酸對(duì)照品；5:黃芩苷對(duì)照品Fig 1 1-3: Shuanghuanglian oral liquid sample 3.2.1；4: Chlorogenic Acid reference substance；5: Baicalin reference substance

圖2 1-3:雙黃連口服液樣品6.5.4；4:綠原酸對(duì)照品；5:黃芩苷對(duì)照品Fig 2 1-3:Shuanghuanglian oral liquid sample 6.5.4；4:Chlorogenic Acid reference substance；5:Baicalin reference substance

圖3 1-3:雙黃連口服液樣品8.7.6；4:綠原酸對(duì)照品；5:黃芩苷對(duì)照品Fig 3 1-3: Shuanghuanglian oral liquid sample 8.7.6；4: Chlorogenic Acid reference substance；5: Baicalin reference substance

圖4 1-2:雙黃連口服液樣品10.9；3:綠原酸對(duì)照品；4:黃芩苷對(duì)照品Fig 4 1-2:Shuanghuanglian oral liquid sample 10.9；3:Chlorogenic Acid reference substance；4:Baicalinreference substance

圖5 1-3:雙黃連口服液樣品13.12.11；4:綠原酸對(duì)照品；5:黃芩苷對(duì)照品Fig 5 1-3:Shuanghuanglian oral liquid sample 13.12.11；4:Chlorogenic Acid reference substance；5:Baicalinreference substance

圖6 1-3:雙黃連口服液樣品16.15.14；4:綠原酸對(duì)照品；5:黃芩苷對(duì)照品Fig 6 1-3:Shuanghuanglian oral liquid sample 16.15.14；4: Chlorogenic Acid reference substance；5: Baicalinreference substance

圖7 1-2:雙黃連口服液樣品18.17；3:綠原酸對(duì)照品；4:黃芩苷對(duì)照品Fig 7 1-2:Shuanghuanglian oral liquid sample 18.17；4:Chlorogenic Acid reference substance；5:Baicalinreference substance

2.1.2 連翹苷定性鑒別結(jié)果 連翹苷薄層色譜鑒別結(jié)果見圖8～圖12，供試品色譜中，樣品1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、12、13中的連翹苷在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上有相應(yīng)的斑點(diǎn)，而樣品9、14、15、16、17、18中的連翹苷在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上無(wú)相應(yīng)的斑點(diǎn)。

圖8 1-4:雙黃連口服液樣品4.3.2.1；5:連翹苷對(duì)照品Fig 8 1-4:Shuanghuanglian oral liquid sample 4.3.2.1；5:Phillyrin reference substance

圖9 1-4:雙黃連口服液樣品8.7.6.5；5:連翹苷對(duì)照品Fig 9 1-4:Shuanghuanglian oral liquid sample 8.7.6.5；5:Phillyrin reference substance

圖10 1-2:雙黃連口服液樣品10.9；3:連翹苷對(duì)照品Fig 10 1-2:Shuanghuanglian oral liquid sample 10.9；3:Phillyrin reference substance

圖11 1-4:雙黃連口服液樣品14.13.12.11；5:連翹苷對(duì)照品Fig 11 1-4:Shuanghuanglian oral liquid sample14.13.12.11；5:Phillyrin reference substance

圖12 1-4:雙黃連口服液樣品18.17.16.15；5:連翹苷對(duì)照品Fig 12 1-4:Shuanghuanglian oral liquid sample18.17.16.15；5:Phillyrin reference substance

2.2 含量測(cè)定結(jié)果

2.2.1 黃芩苷、綠原酸含量測(cè)定結(jié)果 《中國(guó)獸藥典》二部規(guī)定：雙黃連口服液每1 mL含黃芩以黃芩苷計(jì)不得少于10.0 mg[1]。

雙黃連口服液黃芩苷含量測(cè)定結(jié)果見表2，樣品1、2、3、4、5、6、7、11、12、13、18中的黃芩苷含量均高于10.0 mg/mL，而樣品8、9、10、14、15、16、17中的黃芩苷含量均低于10.0 mg/mL。

表2 雙黃連口服液黃芩苷含量測(cè)定結(jié)果Tab 2 Determination of Baicalin in Shuanghuanglianoral liquid

《中國(guó)獸藥典》二部規(guī)定：雙黃連口服液每1 mL含金銀花以綠原酸計(jì)不得少0.60 mg[1]。

雙黃連口服液綠原酸含量測(cè)定結(jié)果見表3，樣品1、2、3、4、6、11中的綠原酸含量均高于0.60 mg/mL，而樣品5、7、8、9、10、12、13、14、15、16、17、18中的綠原酸含量均低于0.60 mg/mL。

表3 雙黃連口服液綠原酸含量測(cè)定結(jié)果Tab 3 Determination of Chlorogenic Acid inShuanghuanglian oral liquid

2.2.2 連翹苷含量測(cè)定結(jié)果 《中國(guó)獸藥典》二部規(guī)定：雙黃連口服液每1 mL含連翹以連翹苷計(jì)不得少于0.30 mg[1]。

雙黃連口服液連翹苷含量測(cè)定結(jié)果見表4，樣品1、2、3、4、6、7、11中的連翹苷含量高于0.30 mg/mL，而樣品5、8、9、10、12、13、14、15、16、17、18中的連翹苷含量低于0.30 mg/mL.

表4 雙黃連口服液連翹苷含量測(cè)定結(jié)果Tab 4 Determination of Phillyrin in Shuanghuanglianoral liquid

計(jì)算雙黃連口服液黃芩苷、綠原酸及連翹苷含量與含量限度的百分比見表5，黃芩苷含量與含量限度的百分比≥150%比例為22.22%、≤100%比例為38.89%。黃芩苷含量與含量限度的百分比最高為439.61%，而最低的為0.17%，相差很大。綠原酸含量與含量限度的百分比≥150%比例為16.67%、≤100%比例為66.67%。綠原酸含量與含量限度百分比最高為231.48%，而最低的為0.02%，相差較大。連翹苷含量與含量限度的百分比≥150%比例為38.89%、≤100%比例為61.11%，連翹苷含量與含量限度的百分比最高為341.87%，而最低的為0.46%，相差較大。

表5 雙黃連口服液黃芩苷、綠原酸及連翹苷含量與含量限度的百分比Tab 5 Content and limit of Baicalin, chlorogenicacid and Phillyrin in Shuanghuanglian oral liquid

3 討 論

在雙黃連口服液中，黃芩苷含量范圍為0.17%～439.61%、綠原酸含量范圍為0.02%～231.48%、連翹苷含量范圍為0.46%-341.87%，黃芩苷含量差別尤為突出。綠原酸、連翹苷含量與含量限度的百分比<100%比例分別為為66.67%、61.11%，綠原酸含量不合格是造成雙黃連口服液質(zhì)量問題的主要因素。各廠家藥材產(chǎn)地、來(lái)源不同對(duì)雙黃連口服液主要成分含量差異有很大影響。黃芩中黃芩苷含量一般在范圍7.95%～32.5%[9-10]，但大多在14. 1% ～32. 5%[11]，一些道地藥材中黃芩苷的含量略低于藥典中的9%；金銀花中綠原酸含量一般在范圍1.5%～4.60%[12-14]；連翹中連翹苷含量一般在0.15%～0.90%[15-16]，一般青翹中的連翹苷含量高于老翹。因此在選用藥材時(shí)，各廠家應(yīng)嚴(yán)格控制藥材質(zhì)量，不能只局限于道地藥材，應(yīng)從供給穩(wěn)定性和質(zhì)量穩(wěn)定性選擇優(yōu)質(zhì)的藥材。在生產(chǎn)質(zhì)量控制時(shí)，應(yīng)以臨床療效為導(dǎo)向，確定藥材來(lái)源，遵循“藥材好，藥才好”原理，從中藥材源頭全過(guò)程質(zhì)量控制。

中藥不同于化學(xué)藥，不僅其成分復(fù)雜，生產(chǎn)工藝也較難控制，并容易出現(xiàn)漏洞。各廠家生產(chǎn)工藝有所不同，也會(huì)造成制劑主要成分含量存在差異。因此各廠家不僅要加強(qiáng)生產(chǎn)過(guò)程監(jiān)管，在中藥制劑中更應(yīng)嚴(yán)格控制好工藝環(huán)節(jié)操作。從藥材的提取、萃取、干燥、混合制劑等過(guò)程中都會(huì)影響產(chǎn)品最終質(zhì)量。中藥制劑不是質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定出來(lái)的，也不是按照質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)出來(lái)的，而是生產(chǎn)出來(lái)的。生產(chǎn)工藝作為中藥制劑成為最終產(chǎn)品的一道工序, 對(duì)其質(zhì)量有著決定性的作用?；凇百|(zhì)量源于設(shè)計(jì)”理念，優(yōu)化建立雙黃連口服液的生產(chǎn)工藝，并對(duì)生產(chǎn)工藝過(guò)程中的各個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行調(diào)控,確保中藥制劑質(zhì)量控制穩(wěn)定性和有效成分的均一性，提升產(chǎn)品市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。

黃芩苷是一種相對(duì)不穩(wěn)定的化合物，遇光、熱易分解變化[10]；綠原酸是一種不穩(wěn)定的化合物，在室溫下或遇光易分解變化，尤其是在溶液狀態(tài)下穩(wěn)定性更差。雙黃連口服液在保存過(guò)程中綠原酸含量下降明顯[17],導(dǎo)致尚處于有效期內(nèi)的產(chǎn)品經(jīng)常出現(xiàn)質(zhì)量不合格的問題。氧化強(qiáng)度和酸堿度對(duì)連翹苷穩(wěn)定性影響較大[15]。因此嚴(yán)格控制雙黃連口服液的pH值，建議用棕色瓶保存生產(chǎn)后的雙黃連口服液，良好保存和使用，防止產(chǎn)品質(zhì)量下降。

4 建 議

在黃芩苷的薄層鑒別中，獸藥典要求雙黃連口服液含量不低于10.0 mg/mL[1]，但薄層鑒別中黃芩苷對(duì)照品濃度為0.1 mg/mL，結(jié)果中樣品斑點(diǎn)明顯大于對(duì)照品斑點(diǎn)，且對(duì)照品斑點(diǎn)較淡，建議薄層鑒別黃芩苷對(duì)照品濃度應(yīng)為1.0 mg/mL。建議展開劑用36%的醋酸，能使黃芩苷與綠原酸斑點(diǎn)良好的分離，方便鑒別。展開劑展開時(shí)，溫度不宜過(guò)高，不利于樣品中黃芩苷與綠原酸分離。制備黃芩苷標(biāo)品溶液時(shí)，因其不易溶解，本試驗(yàn)采用超聲的方法使其較快溶于甲醇。

pH值是影響綠原酸含量的敏感因素[17]，pH值越大，綠原酸含量下降越快。因此在生產(chǎn)過(guò)程中嚴(yán)格控制pH值，防止綠原酸含量下降。建議將雙黃連口服液的pH值范圍適當(dāng)降低。

2015版《中國(guó)獸藥典》(二部)未規(guī)定含量上限，黃芩苷含量范圍為0.17%～439.61%、綠原酸含量范圍為0.02%～439.61%、連翹苷含量范圍為0.46%～341.87%，雙黃連口服液主要成分的含量存在較大的差異，黃芩苷尤為突出，臨床實(shí)際給藥量會(huì)影響臨床療效。這一結(jié)果提示臨床，主要成分含量差異可能會(huì)造成各產(chǎn)品臨床療效存在顯著性差異，應(yīng)選用質(zhì)量穩(wěn)定、信譽(yù)度高的廠家生產(chǎn)的藥品。因此，建議藥典質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定含量上限，以此進(jìn)一步完善和提高質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)加強(qiáng)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究和控制。