酮洛芬注射液對(duì)靶動(dòng)物奶牛的安全性研究

寇賀紅，付良凱，焦曉軍，周淑貞，李成應(yīng)

(佛山市南海東方澳龍制藥有限公司，廣東佛山528234)

酮洛芬(ketoprofen)屬于芳基丙酸類(lèi)非甾體類(lèi)抗炎藥(non-steroids anti-inflammatory drugs，NSAIDs)，在水中幾乎不溶，極易溶于甲醇，易溶于乙醇、丙醇或乙醚，具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎的作用。它主要通過(guò)可逆性抑制環(huán)氧合酶(COXs)、促炎肽或脂氧化酶(LOXs) 的活性，從而抑制致炎性物質(zhì)前列腺素(PGs)、白三烯(LTs) 及血栓素(TXs) 的生物合成，使緩激肽釋放減少，進(jìn)而發(fā)揮其良好的抗炎、鎮(zhèn)痛和解熱作用。研究發(fā)現(xiàn)，酮洛芬的抗炎、鎮(zhèn)痛和解熱作用強(qiáng)于阿司匹林、萘普生、消炎痛、布洛芬、雙氯芬酸和炎痛喜康等藥物，抗炎作用比阿司匹林強(qiáng) 150 倍，解熱作用比消炎痛強(qiáng) 4 倍，毒性?xún)H為消炎痛的 1/20，且不良反應(yīng)與布洛芬相似且較輕[1]。酮洛芬于1967年首次合成，首個(gè)人藥制劑于1973年在法國(guó)上市。獸用制劑也在多個(gè)國(guó)家廣泛應(yīng)用，如西班牙輝瑞公司生產(chǎn)的 15%酮洛芬注射液(商品名：Danidol/Ederal)[2]，加拿大梅里亞公司生產(chǎn)的10%酮洛芬注射液(商品名：Anafen?)[3]，治療牛呼吸道感染、乳腺炎、乳腺水腫、躺臥母牛綜合征、內(nèi)毒血癥、關(guān)節(jié)炎和肌肉骨骼外傷等引發(fā)的發(fā)燒、疼痛和炎癥等相關(guān)疾病。目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)酮洛芬注射液對(duì)靶動(dòng)物奶牛安全性的相關(guān)研究。本試驗(yàn)選用健康泌乳奶牛進(jìn)行酮洛芬注射液的靶動(dòng)物安全性試驗(yàn)，以期為臨床用藥提供科學(xué)依據(jù)。

1 材 料

1.1 試驗(yàn)藥品 酮洛芬注射液，規(guī)格 100mL∶15g；批號(hào):20160503，由佛山市南海東方澳龍制藥有限公司提供。

1.2 儀器設(shè)備 全自動(dòng)動(dòng)物血細(xì)胞分析儀：XFA6130型，南京普朗醫(yī)用設(shè)備有限公司；全自動(dòng)生化分析儀：BS300，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；牛奶體細(xì)胞計(jì)數(shù)儀：MINI5700型，北京康達(dá)智信科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 20頭泌乳期健康荷斯坦奶牛(胎次:2～3胎)，體重為400～450 kg，由三門(mén)峽市合源奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)提供。按奶牛場(chǎng)常規(guī)飼養(yǎng)，試驗(yàn)期間奶牛不使用其他任何抗菌藥物、生殖激素等。

2 方 法

2.1 試驗(yàn)分組及給藥 20頭健康試驗(yàn)?zāi)膛ｋS機(jī)分為4組，每組5頭，設(shè)1倍推薦劑量(3 mg/kg·bw)、3倍推薦劑量(9 mg/kg·bw)、5倍推薦劑量(15 mg/kg·bw)3個(gè)受試藥物組(分別編號(hào)為1倍組、3倍組、5倍組)以及空白對(duì)照組(注射生理鹽水)。頸部肌肉注射，每日1次，連續(xù)給藥9 d。試驗(yàn)持續(xù)至末次給藥后第15天，試驗(yàn)期間按照牛場(chǎng)管理規(guī)程做好消毒防疫和防病工作，保證自由采食和飲水。

2.2 試驗(yàn)評(píng)價(jià)指標(biāo) 參照“VICH獸藥靶動(dòng)物安全性研究指導(dǎo)原則概述”[4]和“靶動(dòng)物安全試驗(yàn)指導(dǎo)原則(征求意見(jiàn)稿)”[5]，從臨床表現(xiàn)和健康狀況、直腸溫度、血液學(xué)檢測(cè)、血清生化學(xué)檢測(cè)等方面進(jìn)行觀察，判定結(jié)果。

2.2.1 臨床觀察 試驗(yàn)期間觀察動(dòng)物是否有與藥物相關(guān)的不良反應(yīng)，如行為異常、精神抑郁、呼吸加深加快及糞尿排泄異常等變化情況。

2.2.2 血液學(xué)檢測(cè) 分別于給藥前第0天和末次給藥后第1天、第7天、第15天的同一時(shí)間尾靜脈采集血液3～5 mL，加入EDTA-2K，制備抗凝血用于血常規(guī)檢查，檢查參數(shù)主要有：紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)、血紅蛋白(HGB)、紅細(xì)胞平均體積(MCV)、平均血紅蛋白含量(MCH)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、血小板計(jì)數(shù)(PLT)等指標(biāo)。

2.2.3 血清生化學(xué)檢測(cè) 分別于給藥前第0天和末次給藥后第1天、第7天、第15天的同一時(shí)間尾靜脈采集血液5～6 mL，制備非抗凝血，分離血清，進(jìn)行血清生化指標(biāo)測(cè)定，檢查參數(shù)有：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、乳酸脫氫酶(LDH)、肌酐(CREA)、尿素(Urea)、間接膽紅素(DBIL)、總膽固醇(TC)等指標(biāo)。

2.2.4 奶產(chǎn)量和乳汁體細(xì)胞數(shù) 分別于給藥前第0天和末次給藥后的第1天、第7天、第15天統(tǒng)計(jì)奶牛奶產(chǎn)量，并采集奶樣20～30 mL進(jìn)行乳汁體細(xì)胞數(shù)檢測(cè)。

2.2.5 直腸溫度 分別于給藥前第0天和末次給藥后的第1天、第7天、第15天，用電子體溫計(jì)檢測(cè)奶牛直腸溫度。

2.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 觀察記錄各劑量組和空白對(duì)照組試驗(yàn)?zāi)膛Ｓ盟幥昂蟮呐R床癥狀，記錄各試驗(yàn)組奶牛的血常規(guī)和血清生化指標(biāo)數(shù)值，使用 SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算各指標(biāo)的平均值與標(biāo)準(zhǔn)差，采用單因素方差分析，比較各組組內(nèi)給藥后不同時(shí)間點(diǎn)數(shù)據(jù)與給藥前第0天數(shù)據(jù)的差異性，如藥物產(chǎn)生不良反應(yīng)，對(duì)其原因進(jìn)行分析，并提出注意事項(xiàng)。

3 結(jié)果與分析

3.1 臨床癥狀變化 給藥期間各劑量組奶牛未表現(xiàn)異常反應(yīng)，如抵抗、興奮等。整個(gè)試驗(yàn)期間，各劑量組奶牛精神狀態(tài)、直腸溫度、呼吸、采食、飲水和糞尿排泄均正常，與對(duì)照組相比，未觀察到有不同臨床表現(xiàn)。整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程奶牛全部存活，且未觀察到任何不良反應(yīng)。

3.2 血液學(xué)檢測(cè) 分別于給藥前第0天和末次給藥后第1天、第7天、第15天的同一時(shí)間靜脈采集抗凝血，進(jìn)行血常規(guī)檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表1-表4。數(shù)據(jù)顯示，各指標(biāo)在給藥期間與給藥前相比差異不顯著(P>0.05)，均在文獻(xiàn)報(bào)道的范圍內(nèi)[6-13]，說(shuō)明酮洛芬注射液以推薦劑量(3 mg/kg·bw)至5倍推薦劑量(15 mg/kg·bw)應(yīng)用于奶牛對(duì)其血液指標(biāo)無(wú)明顯影響。

表1 空白對(duì)照組給藥前第0天和末次給藥后第1天、第7天、第15天的血常規(guī)檢測(cè)Tab 1 The hematology of the control group on day 0，1，7，15 after

表2 1倍組給藥前第0天和末次給藥后第1天、第7天、第15天的血常規(guī)檢測(cè)Tab 2 The hematology of the recommended dosage group on day 0,1,7,15 after

表3 3倍組給藥前第0天和末次給藥后第1天、第7天、第15天的血常規(guī)檢測(cè)Tab 3 The hematology of three times of recommended dosage group on day 0,1,7,15 after

表4 5倍組給藥前第0天和末次給藥后第1天、第7天、第15天的血常規(guī)檢測(cè)Tab 4 The hematology of five times of recommended dosage group on day 0,1,7,15 after

3.3 血清生化指標(biāo)檢查 分別于給藥前第0天和末次給藥后第1天、第7天、第15天的同一時(shí)間靜脈采集非抗凝血，分離血清，進(jìn)行血液生化指標(biāo)測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表5-表8。數(shù)據(jù)表明，1倍劑量組的TC濃度在末次給藥后第1天和第15天顯著低于給藥前水平(P≤0.05)；3倍劑量組的UREA濃度在末次給藥后第15天顯著低于給藥前水平(P≤0.05)；5倍劑量組的ALP濃度在末次給藥后第15天顯著低于給藥前水平(P≤0.05)；其余各指標(biāo)在給藥期間與給藥前相比差異不顯著(P>0.05)。雖然上述試驗(yàn)組的某些指標(biāo)在給藥后與給藥前第0天數(shù)據(jù)相比存在差異性改變，但所有檢測(cè)值均在文獻(xiàn)報(bào)道的正常范圍內(nèi)[6-13]。試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明酮洛芬注射液以推薦劑量(3 mg/kg·bw)至5倍推薦劑量(15 mg/kg·bw)應(yīng)用于奶牛對(duì)其血清生化指標(biāo)無(wú)明顯影響。

表5 空白對(duì)照組給藥前第0天和末次給藥后第1天、第7天、第15天的血清生化指標(biāo)Tab 5 The blood chemistry of the control group on day 0,1,7,15 after

表6 1倍組給藥前第0天和末次給藥后第1天、第7天、第15天的血清生化指標(biāo)Tab 6 The blood chemistry of the recommended group on day 0,1,7,15 after

表7 3倍組給藥前第0天和末次給藥后第1天、第7天、第15天的血清生化指標(biāo)Tab 7 The blood chemistry of three times of recommended dosage group on day 0,1,7,15 after

表8 5倍照組給藥前第0天和末次給藥后第1天、第7天、第15天的血清生化指標(biāo)Tab 8 The blood chemistry of five times of recommended dosage group on day 0,1,7,15 after

3.4 奶產(chǎn)量和乳汁體細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計(jì) 分別于給藥前第0天和末次給藥后的第1天、第7天、第15天統(tǒng)計(jì)奶牛奶產(chǎn)量，并采集奶樣20～30 mL進(jìn)行乳汁體細(xì)胞數(shù)檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表9和表10，各組受試奶牛在給藥前后日產(chǎn)奶量無(wú)明顯差異(P>0.05)，給藥前后受試奶牛的乳汁體細(xì)胞數(shù)均小于20萬(wàn)，各組受試奶牛在給藥前后乳汁體細(xì)胞數(shù)無(wú)顯著差異(P>0.05)，顯示酮洛芬注射液對(duì)泌乳期奶牛的產(chǎn)奶性能無(wú)影響。

表9 給藥前后奶牛日產(chǎn)量統(tǒng)計(jì)表Tab 9 Milk production of dairy cattles before and after dosing kg/d

表10 給藥前后奶牛乳汁體細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計(jì)表Tab 10 SCC of dairy cattles before and after dosing 10000/mL

3.5 直腸溫度 分別于給藥前第0天和末次給藥后的第1天、第7天、第15天，用電子體溫計(jì)檢測(cè)奶牛直腸溫度。奶牛正常體溫在37.5 ℃～39.5 ℃之間[11-13]。本試驗(yàn)中受試奶牛的直腸溫度檢查結(jié)果見(jiàn)表11，各試驗(yàn)組直腸溫度無(wú)明顯差異(P>0.05)，均在正常值范圍內(nèi)，表明酮洛芬注射液對(duì)泌乳期奶牛的體溫?zé)o明顯影響。

表11 給藥前后奶牛直腸溫度統(tǒng)計(jì)表Tab 11 The rectal temperature of dairy cattles before and after treatment ℃

4 小 結(jié)

靶動(dòng)物安全性試驗(yàn)是新獸藥臨床試驗(yàn)研究的重要內(nèi)容，主要用于研究受試藥物在治療范圍或治療范圍以上劑量時(shí)對(duì)生理功能潛在的不良影響[14]。本研究結(jié)果表明，酮洛芬注射液以推薦劑量(3 mg/kg·bw)至5倍推薦劑量(15 mg/kg·bw)

應(yīng)用于奶牛是安全的。鑒于目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)酮洛芬注射液在奶牛上使用的安全性研究，因此本試驗(yàn)為酮洛芬注射液在奶牛臨床中的使用提供了科學(xué)依據(jù)。