陽(yáng)離子交換皂石黏土在基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜分析中的應(yīng)用

丁宇琦，朱價(jià)，周霞，羅金文

（浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院，浙江杭州310012）

糖類化合物是自然界中分布很廣的一類重要化合物，在生命體的代謝組學(xué)和營(yíng)養(yǎng)學(xué)等中扮演著極其重要的角色，是一切生命體維持生命活動(dòng)所需能量的最主要來(lái)源[1]。 然而，持續(xù)的高血糖會(huì)導(dǎo)致多尿、多飲、多食和體重減輕等，最終造成各身體組織的慢性損害和功能障礙（糖尿病患者的主要癥狀）。 目前我國(guó)對(duì)糖尿病的診斷依據(jù)是1999 年世界衛(wèi)生組織頒布的標(biāo)準(zhǔn)，主要根據(jù)空腹和餐后的血糖量進(jìn)行綜合判定。 因此，快速準(zhǔn)確地測(cè)定血液和血漿中的糖類化合物（尤其是單糖）含量，對(duì)于精確診斷糖尿病有重要意義。

糖類化合物難揮發(fā)、熱不穩(wěn)定，其中多糖還具有相對(duì)分子質(zhì)量分布發(fā)散的性質(zhì)，其質(zhì)譜表征比較困難。為此，科研工作者做了大量研究[2]，現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的糖類檢測(cè)技術(shù)主要有：高效液相色譜法（HPLC）、離子色譜法（IC）、薄層色譜法（TLC）以及氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）等。例如LIU 等[3]利用親水液相色譜技術(shù)分離了地黃中的9 種糖類化合物；ZHANG 等[4]用苯硼酸解吸電噴霧離子化法檢測(cè)糖類；FUZFAI 等[5]將氣相色譜串聯(lián)離子阱質(zhì)譜技術(shù)用于各種糖類中的三甲基硅烷基及其肟衍生物的特征裂解規(guī)律分析。 以上技術(shù)雖然比較成熟，但均存在不足，例如：氣相色譜法需要對(duì)不易揮發(fā)的糖類進(jìn)行衍生化處理，費(fèi)時(shí)費(fèi)力；薄層色譜法分離效果差，操作時(shí)間長(zhǎng)，難以準(zhǔn)確定量；液相色譜法多采用示差折光檢測(cè)器，靈敏度低，易受環(huán)境影響，重復(fù)性差；而離子色譜法則需要高性能的陰離子交換柱。

MALDI-TOF-MS 是一種新型的軟電離技術(shù)，具有許多優(yōu)點(diǎn)。首先，檢測(cè)結(jié)果幾乎不受污染物和雜質(zhì)影響，由于離子化效率很高，可分析一些較難電離的樣品，得到完整的電離產(chǎn)物；其次，樣品前處理方法非常簡(jiǎn)單，甚至可以直接分析未處理的生物樣品，儀器操作也很容易。 相較傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)，MALDI-TOF-MS 技術(shù)具有分辨率高、操作簡(jiǎn)便、快速準(zhǔn)確、質(zhì)量分析范圍大、能夠直接分析非衍生化物質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)，并可測(cè)定精確分子量，定性準(zhǔn)確度高。 因此，該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于多肽、聚合物、聚核苷酸等生物大分子物質(zhì)分子量的測(cè)定及蛋白質(zhì)高通量的鑒定。 但將該技術(shù)應(yīng)用于糖類的研究報(bào)道較少，且主要集中于糖蛋白中的糖鏈分析、大分子多糖精確分子量的測(cè)定等[6-8]，對(duì)小分子糖類化合物的研究尚處于探索階段。 PARK 等[9]用常規(guī)有機(jī)基質(zhì)二羥基苯甲酸（DHBA）及MALDI-TOF-MS 技術(shù)分析了啤酒中的寡糖，結(jié)果表明，在溶劑中添加陽(yáng)離子化試劑有利于糖類的離子化，但未對(duì)離子化過(guò)程和基質(zhì)的工作原理進(jìn)行探討；NIMPTSCH 等[10]同樣將 DHBA 作為基質(zhì)，利用MALDI-TOF-MS 技術(shù)進(jìn)行了黏多糖和低聚糖硫酸鹽的檢測(cè)；劉悅玫等[11]利用MALDI-TOF-MS 技術(shù)進(jìn)行了復(fù)雜糖一致性研究；裴興麗等[12]以DHBA 為基質(zhì)，利用MALDI-TOF-MS 技術(shù)對(duì)大豆食品中寡糖成分進(jìn)行了成像分析。這些文獻(xiàn)僅提出寡糖類化合物的檢測(cè)方法，未涉及小分子糖類化合物，其主要原因是在解吸過(guò)程中同時(shí)發(fā)生基質(zhì)本身的離子化和碎裂，對(duì)圖譜的解析困難較大，難以判斷某個(gè)峰是來(lái)源于基質(zhì)還是分析物，從而大大限制了MALDI-TOF-MS技術(shù)在小分子糖類化合物領(lǐng)域的應(yīng)用，特別是針對(duì)未知化合物的分析。 因此，引入無(wú)基質(zhì)的激光解吸電離技術(shù)（matrix-free techniques）[13]、對(duì)傳統(tǒng)有機(jī)基質(zhì)進(jìn)行修飾（例如通過(guò)加入基質(zhì)添加物形成復(fù)合基質(zhì)）[14]、制備新型無(wú)機(jī)基質(zhì)（例如 Au，Ag 等納米材料）[15]等成為攻克上述難題的關(guān)鍵。

由于硅酸鹽層之間的相互作用力較弱，皂石黏土很容易在水中膨脹形成溶凝膠，另外，黏土還有較強(qiáng)的陽(yáng)離子交換和分子嵌入能力，在多個(gè)領(lǐng)域已有廣泛應(yīng)用[16-17]。 在化學(xué)領(lǐng)域主要作為催化劑[18]以及納米復(fù)合材料的載體[19]，在MALDI-TOF-MS 技術(shù)中尚未見(jiàn)應(yīng)用。 本文選取一種人工合成的蒙脫石皂石黏土，并將有機(jī)基質(zhì)THAP 成功嵌入經(jīng)陽(yáng)離子交換后的皂石黏土的晶面間隙中，形成復(fù)合基質(zhì)，用于糖類化合物的分析。結(jié)果表明，由于受該復(fù)合基質(zhì)晶面間距的限制，僅能使部分小分子糖類化合物離子化，具有小分子選擇性。方法操作簡(jiǎn)便、分析效率高、經(jīng)濟(jì)成本低。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器設(shè)備和試劑

MALDI-TOF-MS 配有 337 nm 波長(zhǎng)的氮?dú)饧す猓╓aters 公司）；黏土（Sumecton SA）由日本Kunimine 材料實(shí)業(yè)公司提供；2，4，6-三羥基苯乙酮（THAP，168 Da）、多肽物質(zhì) P（SubP）購(gòu)自德國(guó)CNW 公司；葡萄糖（D-glucose，Glu）、半乳糖（D-galactosel）、纖維二糖（D-cellobiose）、棉子糖（D-raffinose）、麥 芽 六 糖（Maltohexaose）、麥 芽 七 糖（Maltoheptaose）、環(huán)糊精（γ-cyclodextrin）均購(gòu)自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；乙腈（色譜純）購(gòu)自Merk 公司；試驗(yàn)用水為Milli-Q 超純水。

1.2 儀器參數(shù)

激光能量約8 μJ，激光射速10 Hz，正離子反射模式下加速電壓17 kV，延遲時(shí)間500 ns。

1.3 分析物前處理

Na+交換的黏土（NaSm）：將 0.1 mol CH3COONa 溶于50 mL 水中，待完全溶解后與500 mg 黏土混合形成懸濁液，在70℃下攪拌1 h，用0.2 μm 濾紙過(guò)濾，去除溶液；在沉淀物中再加入相同體積和濃度的CH3COONa 溶液，重復(fù)反應(yīng)3 次，將最終的沉淀物冷凍干燥過(guò)夜。

復(fù)合基質(zhì)：分別稱取4 mg THAP 基質(zhì)和一定量的 NaSm（THAP 和 NaSm 的質(zhì)量比分別為4∶0.25，4∶0.5，4∶1），加入體積比為 7∶3 的乙腈和水溶劑1 mL，保持每份溶液中THAP 的濃度為4 mg·mL-1，超聲溶解 15 min，并稱取 4 mg THAP 按上述方法配成純基質(zhì)溶液進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)。

分析物制樣：稱取分析物0.1 mg，用上述溶劑充分溶解并稀釋至濃度為1 μg·mL-1，分別移取相同體積的復(fù)合基質(zhì)溶液和分析物溶液，超聲混合30 min，取2 μL 混合液滴至不銹鋼樣品板上，置于空氣中使溶劑自然揮發(fā)，最后將樣品板置入MALDI儀器檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 Glu 質(zhì)譜分析結(jié)果

葡萄糖是自然界分布最廣且最為重要的一種單糖，是活細(xì)胞的能量來(lái)源和新陳代謝的中間產(chǎn)物，是生物的主要供能物質(zhì)。 由THAP 和NaSm 組成的復(fù)合基質(zhì)(THAP-NaSm)應(yīng)用于Glu 分析的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1 所示（縱坐標(biāo)為優(yōu)化后的相對(duì)強(qiáng)度，各質(zhì)譜圖相對(duì)強(qiáng)度的坐標(biāo)范圍一致，下同）。 由于Glu 極性較強(qiáng)，在常規(guī)質(zhì)譜條件下質(zhì)子化非常困難，因此無(wú)法觀察到[Glu+H]+峰，而Na+、K+等堿金屬離子與Glu 有較強(qiáng)的結(jié)合能力，使得Glu 的離子化峰可以以堿金屬加和峰形式呈現(xiàn)。 圖1(a) 為以THAP 單獨(dú)作為有機(jī)基質(zhì)測(cè)定的Glu 質(zhì)譜圖。 由圖1（a)知，僅以THAP 作為基質(zhì)對(duì)葡萄糖進(jìn)行檢測(cè)，基質(zhì)的Na+加和的離子化峰([THAP+Na]+)并不明顯，更無(wú)法觀察分析物的離子化峰（信噪比：S/N=6，R=0.25），說(shuō)明THAP 并不適合作為葡萄糖的分析基質(zhì)，而加入NaSm 形成復(fù)合基質(zhì)后，離子化峰有明顯增強(qiáng)。圖1(b)為用復(fù)合基質(zhì)（THAP 和NaSm 的質(zhì)量比為4∶0.25）后測(cè)得的質(zhì)譜圖，相較圖1(a)，分析物的離子化峰（[Glu+Na]+信號(hào)）強(qiáng)度增強(qiáng)了約35倍（S/N=210，R=0.63），分析物的離子化效率顯著增強(qiáng)，[THAP+Na]+信號(hào)的強(qiáng)度增強(qiáng)了約4 倍。當(dāng)繼續(xù)增加 THAP 和 NaSm 的質(zhì)量比至 4∶0.5 時(shí)，[Glu+Na]+的信號(hào)強(qiáng)度增強(qiáng)了約100 倍（S/N=590，R=0.83），并且可以清晰地觀察到[Glu-H+2Na]+峰，如圖1(c)所示。當(dāng)繼續(xù)提高THAP 和NaSm 的質(zhì)量比至4∶0.75 和4∶1 時(shí)，絕大部分化合物離子化峰的信號(hào)強(qiáng)度出現(xiàn)大幅下降，如圖1(d)和(e)所示，這是因?yàn)楫?dāng)混合過(guò)多的NaSm 后，激發(fā)區(qū)的基質(zhì)濃度被稀釋，從而導(dǎo)致離子化效率降低。 顯然，組成復(fù)合基質(zhì)的THAP 與NaSm 存在一個(gè)最優(yōu)的質(zhì)量比。

為了確定圖1(b)和(c)中峰信號(hào)的增強(qiáng)是由添加NaSm 所致，用 NaCl 取代NaSm，形成質(zhì)量比為4∶0.5 的 THAP-NaCl 復(fù)合基質(zhì)，再進(jìn)行葡萄糖質(zhì)譜分析，結(jié)果見(jiàn)圖1（f）。 相較圖1(c)，在圖1(f)中未見(jiàn)離子化峰信號(hào)增強(qiáng)，因此，推斷NaSm 不僅可以作為高效的Na+源，還可顯著促進(jìn)分析物和基質(zhì)的解吸效率。

2.2 多肽物質(zhì)P（Sub P）的質(zhì)譜分析結(jié)果

多肽物質(zhì)P 是一種廣泛分布于神經(jīng)纖維內(nèi)的神經(jīng)肽，隨著MALDI 技術(shù)的發(fā)展，包括THAP 在內(nèi)的各種常用有機(jī)基質(zhì)已廣泛應(yīng)用于多肽分析。由于多肽物質(zhì)P 比糖類物質(zhì)容易離子化，因此，即使不進(jìn)行基質(zhì)修飾，僅以THAP 作為基質(zhì)仍可觀察到非常明顯的離子化峰，如圖2(a)所示。然而，在混入NaSm形成復(fù)合基質(zhì)后，分析物的質(zhì)譜峰不僅沒(méi)有增強(qiáng)，反而顯著下降，如圖2(b)所示，說(shuō)明在對(duì)分子質(zhì)量較大的多肽物質(zhì)進(jìn)行分析時(shí)，復(fù)合基質(zhì)并沒(méi)有表現(xiàn)出類似于對(duì)糖類化合物分析時(shí)的卓越性能。基于以上分析，推測(cè)分析物的相對(duì)響應(yīng)值可能與分子大小有關(guān)；分子直徑大于THAP-NaSm 晶面間距的化合物無(wú)法有效進(jìn)入復(fù)合基質(zhì)的晶面間隙與分布在晶面內(nèi)的基質(zhì)接觸，使得其無(wú)法有效離子化，從而導(dǎo)致質(zhì)譜響應(yīng)大幅下降。因此，所提出的分析方法對(duì)糖類分子具有分子尺寸選擇性。

圖2 以THAP（a）和THAP-NaSm（b）作為基質(zhì)的多肽物質(zhì)P 的質(zhì)譜圖Fig.2 Mass spectra of Sub P measured with THAP（a）and THAP-NaSm（b）as the matrix

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

2.3.1 X 射線衍射（XRD）分析

粉末X 射線衍射（XRD）是評(píng)估基質(zhì)添加物內(nèi)部晶體結(jié)構(gòu)的重要表征手段，本研究測(cè)定了Sm，NaSm 和 THAP-NaSm 的 XRD 圖譜，分別計(jì)算了不同添加物的晶面間距，結(jié)果如表1 所示。顯然由于THAP 的嵌入，NaSm 的晶面間距變大了。

2.3.2 混合晶體制備方法對(duì)比

除了超聲攪拌混合制樣法外，還考察了另外2種混合制樣法，即將THAP-NaSm 與Glu 以機(jī)械攪拌的方式以及渦旋振蕩1 h 的方式分別進(jìn)行混合處理，之后制備樣品板（除混合方式不同外，其余步驟均相同），質(zhì)譜結(jié)果見(jiàn)圖3。對(duì)比圖3(a)和圖1(a)，兩者所有峰（[Glu+Na]+，S/N=12）的響應(yīng)都基本一致，可知以機(jī)械攪拌方式制備的復(fù)合基質(zhì)無(wú)任何效果；渦旋振蕩1 h 制備的復(fù)合基質(zhì)在離子化效率上有一定提升，分析物的質(zhì)譜峰（[Glu+Na]+，S/N=180）提升了約15 倍，大致相當(dāng)于圖1(b)的結(jié)果，僅相當(dāng)于圖1(c)分析物響應(yīng)的1/3。由于 THAP 主要嵌入NaSm 的晶面間隙內(nèi)，而機(jī)械攪拌和渦旋振蕩方式無(wú)法使Glu 有效進(jìn)入NaSm 的晶面間隙，因此用這2 種方式制備的復(fù)合基質(zhì)離子化效率較低。

表1 Sm，NaSm 和 THAP-NaSm 的 XRD 分析結(jié)果Table 1 XRD measurements for Sm，NaSm and THAPNaSm

2.3.3 不同分析物對(duì)比

為了驗(yàn)證對(duì)分子尺寸具有選擇性的假設(shè)，選擇了 6 種常見(jiàn)的碳水化合物：半乳糖（galactose， 單糖）、纖維二糖（cellobiose， 雙糖）、棉子糖（raffinose，三糖）、麥芽六糖（maltohexaose， 六糖）、麥芽七糖（maltoheptaose， 七糖）、γ-環(huán)糊精（cyclodextrin， 八糖）作為分析物，并用THAP-NaSm 作為復(fù)合基質(zhì)

進(jìn)行分析，質(zhì)譜結(jié)果如圖4 所示。所有圖譜中基質(zhì)的相關(guān)離子化峰的響應(yīng)幾乎一致，但是分析物相關(guān)離子化峰的響應(yīng)則隨單糖單元聚合數(shù)的增多而明顯降低，其中γ-環(huán)糊精擁有8 個(gè)單糖單元，其相關(guān)離子峰僅勉強(qiáng)可見(jiàn)。SUZUKI 等[20]采用THAP 和絲光沸石（LiM20）作為復(fù)合基質(zhì)，成功檢測(cè)出了麥芽六糖。 其結(jié)果顯示，分析物和基質(zhì)的相關(guān)離子化峰大致相當(dāng)，說(shuō)明不同糖類化合物之間的理化性質(zhì)差異并不是引起圖4 所示的分析物響應(yīng)下降的主要因素。由圖5 可知，化合物峰離子與基質(zhì)峰離子的豐度比（[M，analyte+Na]+/[matrix+Na]+）隨糖類化合物直徑（根據(jù)范德華假設(shè)計(jì)算）的增大呈指數(shù)下降，說(shuō)明大分子糖類化合物很難進(jìn)入復(fù)合基質(zhì)的晶面間隙，無(wú)法與THAP 充分接觸及相互作用，導(dǎo)致離子化效率降低。因此，糖類化合物的分子直徑大小是導(dǎo)致質(zhì)譜響應(yīng)值變化的主要因素。而THAPNaSm 復(fù)合基質(zhì)對(duì)小分子糖類化合物的檢測(cè)具有較強(qiáng)的選擇性。

圖3 分析物混合晶體的質(zhì)譜圖Fig.3 Mass spectra of Glu subjected to different analyte/matrix preparation methods

圖4 復(fù)合基質(zhì)測(cè)得的糖類化合物質(zhì)譜圖Fig.4 Mass spectra of various saccharides measured with THAP-NaSm

圖5 化合物峰離子與基質(zhì)峰離子豐度比隨糖類化合物直徑的變化曲線Fig.5 Relationship between peak intensity ratio（［M，analyte+Na］+ /［matrix+Na］+）and diameter of saccharides

3 結(jié) 論

將蒙脫石皂石黏土應(yīng)用于MALDI-TOF-MS技術(shù)，將傳統(tǒng)的有機(jī)基質(zhì)THAP 插入經(jīng)陽(yáng)離子交換后的皂石黏土晶面間隙中，制備成新型的復(fù)合基質(zhì)，并將其應(yīng)用于糖類化合物的檢測(cè)。由于受復(fù)合基質(zhì)晶面間距的限制，只有小分子糖類化合物能進(jìn)入晶面間隙充分接觸有機(jī)基質(zhì)并被離子化，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)小分子糖類化合物的選擇性檢測(cè)。