竹黃顆粒治療尋常型銀屑病的療效及對(duì)miRNA155-SOCS1軸調(diào)控Th17細(xì)胞因子的干預(yù)作用

★ 王丹 劉欽玲 鄭明明 鄒國明（1.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 南昌 330006；.江西中醫(yī)藥大學(xué) 南昌 330004；3.江西中醫(yī)藥大學(xué)歧黃國醫(yī)書院 南昌 330004）

銀屑病是一種臨床常見的以皮膚紅斑、丘疹上覆多層銀白色鱗屑為特征的慢性炎癥性皮膚病，其發(fā)病與易感基因遺傳及自身T細(xì)胞免疫密切相關(guān)，病理表現(xiàn)為角質(zhì)細(xì)胞的角化過度、角化不全及乳頭部毛細(xì)血管擴(kuò)張和真皮炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，在臨床上主要分為四型，而尋常型銀屑?。╬soriasis vulgaris，PV）占99%以上［1］。近年來本病的發(fā)病率逐年上升，已由1984年的0.123%，上升至2017年的0.5%［2-3］。目前全國約有650萬銀屑病患者，而其中的87.6%～93.4%反復(fù)發(fā)作。銀屑病病程長(zhǎng)，反復(fù)發(fā)作的皮疹影響患者的外貌美觀，損害患者身心健康，降低生活質(zhì)量，目前人類對(duì)本病尚未發(fā)現(xiàn)特效及根治的藥物和方法。為此大批國內(nèi)外學(xué)者投入了本病的研究，但至今仍未完全清楚其發(fā)病機(jī)理?，F(xiàn)有研究已經(jīng)證實(shí)Th17細(xì)胞在銀屑病的發(fā)病過程中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用，并成為了新的治療靶點(diǎn)［4-5］。諸多研究表明，miRNA對(duì)Th17細(xì)胞的作用可能是通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)其相關(guān)因子的表達(dá)與分泌，影響其分化與功能，進(jìn)而引起銀屑病等諸多自身免疫性疾病的發(fā)生，而其中miR-155是促使Th17細(xì)胞發(fā)揮效應(yīng)的一個(gè)重要調(diào)節(jié)因子。本課題組［6］前期研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-155在PV患者皮損及外周血清PBMCs以及CD4+T淋巴細(xì)胞中均有特異性表達(dá)，且在CD4+T淋巴細(xì)胞中上調(diào)最高，而SOCS1是miRNA-155重要的靶基因，miRNA-155可以直接作用于靶基因SOCS1，影響JAK/STAT信號(hào)傳導(dǎo)通路中STAT3的表達(dá)，從而調(diào)控Th17細(xì)胞的分化與功能及其炎性細(xì)胞因子的分泌，進(jìn)而參與銀屑病發(fā)病的免疫機(jī)制。所以筆者選擇從miRNA155-SOCS1軸調(diào)控Th17細(xì)胞及相關(guān)因子角度進(jìn)一步探索PV的發(fā)病機(jī)制，通過檢測(cè)PV患者皮損中及內(nèi)服竹黃顆粒前后外周血PMBC中miR-155、SOCS1、RORγt、IL-17mRNA和Th17細(xì)胞及相關(guān)因子水平， 觀察竹黃顆粒治療PV的臨床療效及對(duì)其的干預(yù)作用，探討miRNA155-SOCS1軸調(diào)控Th17細(xì)胞因子參與PV的發(fā)病機(jī)制，探索中醫(yī)藥治療PV的作用新靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年12月—2019年12月江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科門診及住院PV患者40例為觀察對(duì)象，其中男23例、女17例，年齡18～60歲，平均（37.25±10.76）歲，病程1個(gè)月～20年。同時(shí)對(duì)照組選擇體檢健康人群15例，其中女6例、男9例，年齡18～60歲，平均（38.26±11.45）歲。兩組年齡、性別具有可比性。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) （1）西醫(yī)診斷參照《中國臨床皮膚病學(xué)》第二版［1］中PV的診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）中醫(yī)診斷依照《中醫(yī)病證診斷療效標(biāo)準(zhǔn)》［7］中白疕（血熱證）的診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn) （1）符合中醫(yī)白疕（血熱證）診斷標(biāo)準(zhǔn)和西醫(yī)PV診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）年齡范圍18～60歲；（3）4周內(nèi)無光療及系統(tǒng)用藥史（包括免疫抑制劑、激素類、維甲酸類），2周內(nèi)無外用制劑使用史。（4）無心肝肺腎血液等系統(tǒng)性疾病及其他皮膚病。（5）簽署知情同意書。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) 妊娠、哺乳期婦女及藥物過敏者。

1.5 治療方法 觀察組：口服竹黃顆粒。竹黃顆粒由江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院顆粒劑藥房提供，主要藥物有竹葉、黃連、梔子、黃柏、水牛角、石膏、漏蘆、麥冬、黨參、山藥、三七等。每次1包，每天3次，開水沖服。4周為一療程，連續(xù)治療2個(gè)療程。觀察期間停止其他治療方法。對(duì)照組：不給予任何藥物和治療。

1.6 觀察指標(biāo) （1）用ELISA法檢測(cè)血清中IL-17、IL-6、IL-23的含量。分別采集對(duì)照組及觀察組治療前后空腹外周血5 mL，2 000 r/min，離心5 min，收集上層血清標(biāo)本檢驗(yàn)，操作嚴(yán)格按照ELISA試劑盒 （美國R&D公司） 要求進(jìn)行。（2）實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)觀察組治療前后及健康對(duì)照組外周血PMBC及皮膚組織中miR-155、SOCS1、RORγt及IL-17的mRNA表達(dá)水平，流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血PBMC中Th17細(xì)胞比例，其中5例重度PV患者，與其簽署知情同意書后，分別于皮損區(qū)及皮損周圍組織切取直徑約3 mm皮膚標(biāo)本，5例正常皮膚組織標(biāo)本均來自我院普外科。

1.7 療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn) 以PASI積分為療效評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。痊愈：PASI評(píng)分下降≥90%；顯效：90%＞PASI評(píng)分下降≥60%；有效：60%＞PASI評(píng)分下降≥20%；無效：PASI評(píng)分下降＜20%。總有效率=（痊愈例數(shù)+顯效例數(shù)）/總病例數(shù)×100%。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)用SPSS l7.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均以（）表示，設(shè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。外周血中各指標(biāo)比較采取獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)；用單因素方差分析皮膚組織中各指標(biāo)表達(dá)水平比較，組間比較用LSD法；線性相關(guān)分析檢測(cè)各指標(biāo)之間的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 兩組IL-17、IL-6和IL-23含量比較 見表1。PV患者血漿中IL-17、IL-6和IL-23含量明顯高于正常人，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.2 兩組miR-155、SOCS1、RORγt及IL-17mRNA基因表達(dá)水平比較 見表2。PV患者皮損區(qū)、皮損周圍組織與健康正常皮膚組織miR-155、SOCS1、RORγt及IL-17mRNA基因表達(dá)水平比較，存在顯著差異（P＜0.01）。

2.3 兩組外周血PBMC中相關(guān)因子基因表達(dá)水平及Th17細(xì)胞比例比較 見表3。PV患者外周血PBMC中miR-155、RORγt、IL-17mRNA的 基 因表達(dá)水平及Th17細(xì)胞比例較健康對(duì)照者顯著升高（P＜0.01），而SOCS1顯著降低（P＜0.01）。

表1 兩組Th17細(xì)胞及相關(guān)因子表達(dá)水平比較（） pg/mL

表1 兩組Th17細(xì)胞及相關(guān)因子表達(dá)水平比較（） pg/mL

?

表2 兩組miR-155、SOCS1、RORγt及IL-17mRNA基因表達(dá)水平比較（）

表2 兩組miR-155、SOCS1、RORγt及IL-17mRNA基因表達(dá)水平比較（）

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表3 兩組外周血PBMC中相關(guān)因子基因表達(dá)水平及Th17細(xì)胞比例比較（）

表3 兩組外周血PBMC中相關(guān)因子基因表達(dá)水平及Th17細(xì)胞比例比較（）

組別 n miR-155 SOCS1 RORγt IL-17 Th17細(xì)胞比例觀察組 40 5.71±1.30 0.15±0.05 6.50±1.63 7.77±1.61 3.81±1.32對(duì)照組 15 1.78±0.43 0.84±0.24 1.39±0.40 1.53±0.40 1.15±0.72 t-11.418 -10.666 -11.942 -14.760 -7.375 P＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.4 治療前后血漿IL-17、IL-6、IL-23表達(dá)水平比較 見表4。竹黃顆粒治療后患者血漿IL-6、IL-23含量無明顯下降（P＞0.05），IL-17含量顯著下調(diào)，與治療前比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表4 治療前后血漿IL-17、IL-6、IL-23表達(dá)水平比較（，n=40） pg/mL

表4 治療前后血漿IL-17、IL-6、IL-23表達(dá)水平比較（，n=40） pg/mL

時(shí)間 IL-17 IL-6 IL-23治療前 625.38±166.28 3944.87±515.60 240.01±102.38治療后 254.10±61.32 3737.94±499.18 200.42±89.94 t-13.208 -1.842 -1.837 P＜0.01 0.072 0.070

2.5 治療前后外周血PBMC中相關(guān)因子基因表達(dá)水平及Th17細(xì)胞比例比較 見表5。竹黃顆粒治療后患者外周血PBMC中miR-155、IL-17mRNA的基因表達(dá)水平及Th17細(xì)胞比例較治療前顯著下降，而SOCS1上升（P＜0.01），RORγt無顯著變化（P＞0.05）。

2.6 治療前、治療第4周、第8周PASI積分比較 見表6。觀察組分別在竹黃顆粒治療前、治療第4周、第8周對(duì)患者病情嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)分，再依據(jù)PASI評(píng)分變化來判定療效，其中痊愈10例， 顯效25例，有效5例，總有效率為87.5%。治療后PASI評(píng)分較治療前顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明竹黃顆粒治療尋常型銀屑病療效確切。

表5 治療前后外周血PBMC中相關(guān)因子基因表達(dá)水平及Th17細(xì)胞比例比較（，n=40）

表5 治療前后外周血PBMC中相關(guān)因子基因表達(dá)水平及Th17細(xì)胞比例比較（，n=40）

時(shí)間 miR-155 SOCS1 RORγt IL-17 Th17細(xì)胞比例治療前 5.71±1.30 0.15±0.05 6.5±1.63 7.77±1.61 3.81±1.32治療后 1.22±0.48 0.48±0.25 5.83±1.45 2.69±1.43 1.71±0.78 t-20.492 -6.205 -1.942 -14.920 -8.663 P＜0.01 ＜0.01 0.0557 ＜0.01 ＜0.01

表6 治療前、治療第4周、第8周PASI積分比較（）分

表6 治療前、治療第4周、第8周PASI積分比較（）分

注：經(jīng)配對(duì)t檢驗(yàn)，治療前后患者PASI評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-10.912，P=0.00）。

n 治療前 治療第4周 治療第8周40 26.53±9.76 17.34±7.05 7.53±5.10

2.7 外周血PBMC及皮損組織中 miR-155與相關(guān)因子基因表達(dá)水平等的相關(guān)性 PV患者外周血PBMC及皮損組織中 miR-155與RORγt、IL-17mRNA水平均呈正相關(guān)，且與PASI 評(píng)分呈正相關(guān)，而與SOCS1呈負(fù)相關(guān)，血漿中IL-17、IL-6、IL-23水平也與miR-155水平及 PASI評(píng)分呈正相關(guān)。

2.8 不良反應(yīng) 觀察組有2人服藥初期出現(xiàn)惡心和輕度胃部不適，反應(yīng)較輕微、能耐受，沒有影響繼續(xù)治療。治療結(jié)束后未見明顯血、尿常規(guī)及肝腎功能異常。

3 討論

銀屑病是一種常見慢性、紅斑鱗屑性、炎癥性皮膚病，中醫(yī)稱“白疕”。本病發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，臨床上缺乏特效和徹底的治療方法。西醫(yī)多采用免疫抑制劑、激素類、維甲酸類等藥物或光療治療本病，可以控制皮疹，但復(fù)發(fā)也較快，而且存在不同程度的副作用，所以如何控制銀屑病的復(fù)發(fā)成為本病治療的難點(diǎn)與關(guān)鍵。目前臨床上大多是通過延長(zhǎng)緩解期來減少復(fù)發(fā)，而諸多研究表明，中醫(yī)藥在銀屑病的治療尤其是控制復(fù)發(fā)及藥物安全性上具有明顯優(yōu)勢(shì)。

銀屑病發(fā)病機(jī)制中重要的三個(gè)中心環(huán)節(jié)是炎癥反應(yīng)、表皮細(xì)胞過度增殖、免疫學(xué)異常。研究表明，miRNAs可以通過促進(jìn)炎癥反應(yīng)、調(diào)控細(xì)胞增殖分化以及影響基因甲基化等方面參與皮膚的生理病理，從而參與炎癥性疾病的發(fā)病過程［8］?，F(xiàn)有研究已經(jīng)證實(shí)，Th17細(xì)胞及IL-23/IL-17軸在銀屑病的發(fā)病過程中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用，并成為了新的治療靶點(diǎn)［4-5］。在中國已經(jīng)上市的生物制劑烏司奴單抗和司庫奇尤單抗、依奇珠單抗，就是分別靶向中和IL-12和IL-23的共同亞單位p40和IL-17A的人源化IgG單克隆抗體，通過阻斷幼稚T淋巴細(xì)胞向Th1及Th17分化，高度選擇性抑制IL-17A激活角質(zhì)形成細(xì)胞與產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，而在銀屑病的治療中取得較好的療效。Th17細(xì)胞及相關(guān)因子在銀屑病患者的外周血PBMC和皮損中均存在高表達(dá)水平，RORγt是控制Th17分化的特征性轉(zhuǎn)錄因子［9］，Th17細(xì)胞被活化后釋放的IL-17、IL-22、IL-23、IFN-α等細(xì)胞因子，可刺激上皮角質(zhì)形成細(xì)胞，使其產(chǎn)生炎性增殖，從而促進(jìn)銀屑病病程發(fā)展［10］。越來越多的研究表明，miR-155是促使Th17細(xì)胞發(fā)揮效應(yīng)的一個(gè)重要調(diào)節(jié)因子。Hu等［11］研究顯示，miR-155通過促進(jìn)Th17細(xì)胞相關(guān)效應(yīng)基因表達(dá)的方式潛在地參與實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎的發(fā)病機(jī)制。Rui等［12］研究發(fā)現(xiàn)，SOCS1作為JAK/STAT信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控因子，鼠脾臟的CD4+T細(xì)胞中miR-155可以抑制靶基因SOCS1的表達(dá)，從而起到促進(jìn)Th17細(xì)胞分化的作用。另有研究發(fā)現(xiàn)，在miR-155缺陷的Th17細(xì)胞中，Ets-1水平存在高表達(dá)，可以促進(jìn)IL-23與其受體相結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化［13］。這表明在自身免疫病中miR-155可以促進(jìn)Th17分化，并且調(diào)節(jié)其功能，是Th17細(xì)胞增殖分化及功能的一個(gè)重要調(diào)節(jié)因子。據(jù)此推測(cè)，miRNA可能通過調(diào)控Th17而影響銀屑病的發(fā)病。本課題組［6，14］既往諸多研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-155在PV患者皮損及外周血清PBMCs、CD4+T淋巴細(xì)胞中存在特異性表達(dá)，而miRNA-155可以直接作用于靶基因SOCS1，影響JAK/STAT信號(hào)傳導(dǎo)通路中STAT3的表達(dá)，從而調(diào)控Th17細(xì)胞的分化及相關(guān)因子的表達(dá)，進(jìn)而參與銀屑病的發(fā)病機(jī)制。本研究結(jié)果表明，PV患者外周血PMBC中miR-155、RORγt、IL-17mRNA基因表達(dá)、及Th17細(xì)胞比例、血漿中IL-17、IL-6和IL-23含量顯著高于健康人群，SOCS1低于正常人；PV患者皮損組織中的miR-155、RORγt及IL-17mRNA基因表達(dá)＞皮損周圍組織＞健康正常皮膚組織，SOCS1反之；PV 患者外周血PBMC中miR-155與RORγt、IL-17mRNA、Th17細(xì)胞相關(guān)因子均呈正相關(guān)，與PASI 評(píng)分呈正相關(guān)，與SOCS1負(fù)相關(guān)，血漿中IL-17、IL-6、IL-23水平也與miR-155水平及 PASI評(píng)分呈正相關(guān)。證實(shí)了在PV患者疾病過程中，miRNA155-SOCS1軸通過調(diào)控Th17細(xì)胞相關(guān)因子的分化及功能，從而參與PV的發(fā)病，促進(jìn)PV病情進(jìn)展。

臨床上PV進(jìn)展期以血熱證型最為多見。歐陽恒教授根據(jù)銀屑病“血熱毒滯”這一病機(jī)而創(chuàng)立的竹黃湯，在數(shù)十年的臨床運(yùn)用中已被證實(shí)療效顯著且安全性高。竹黃顆粒是由竹黃湯化裁而來，由竹葉、黃連、梔子、黃柏、水牛角、石膏、麥冬、黨參、漏蘆、山藥、三七等組成，具有清熱解毒、活血涼血、益氣養(yǎng)陰之功效。經(jīng)竹黃顆粒治療后，PV患者PASI評(píng)分明顯下降，療效顯著，且研究顯示治療后PV患者miR-155、IL-17mRNA、Th17細(xì)胞比例及血漿中IL-17含量顯著下調(diào)，SOCS1上調(diào)。其可能是通過調(diào)節(jié)miRNA155-SOCS1軸的表達(dá)，減少Th17細(xì)胞分化，降低PV患者Th17細(xì)胞相關(guān)因子水平，從而發(fā)揮治療作用。

綜上所述，本研究顯示miRNA155-SOCS1軸與Th17細(xì)胞及其相關(guān)因子均參與了銀屑病的發(fā)病過程，且在其中發(fā)揮重要作用。應(yīng)用竹黃顆粒治療PV療效顯著，可調(diào)節(jié)miRNA155、SOCS1、Th17細(xì)胞比例及IL-17等相關(guān)因子的表達(dá)水平，為銀屑病的中醫(yī)藥治療及新藥研發(fā)提供相關(guān)理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。由于經(jīng)費(fèi)、實(shí)驗(yàn)條件等多方面的限制，未能進(jìn)行miRNA155-SOCS1軸調(diào)控Th17細(xì)胞的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及靶基因的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，有待今后進(jìn)一步研究。