固定化尿苷-胞苷激酶和聚磷酸激酶偶聯(lián)催化制備5′-胞苷酸

吳思佳，李杰，胡晨龍，田俊宇，張通，陳寧，范曉光

天津科技大學 生物工程學院，天津 300457

5′-胞苷酸 (簡稱胞苷酸) 是一種重要的核苷酸產(chǎn)品，可作為食品添加劑、藥品以及藥物前體應用于不同領(lǐng)域[1]。胞苷酸是制備核苷酸衍生物的重要中間體，可作為原材料生產(chǎn)胞苷三磷酸、阿糖胞苷酸、胞二磷膽堿和聚肌胞苷酸等[2]。胞苷酸在成年人、嬰幼兒和哺乳動物的免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用[3-5]，含有胞苷酸的嬰幼兒奶粉功效更接近于母乳，能顯著提高嬰幼兒免疫力[6-7]。

工業(yè)上常用核酸水解法生產(chǎn)胞苷酸，通常是提取酵母細胞中的核糖核酸，經(jīng)核酸酶水解得到4種核苷單磷酸 (腺苷酸、鳥苷酸、胞苷酸和尿苷酸) 混合物后，再經(jīng)過離子交換法分離精制得到胞苷酸[8-9]。核酸水解法具有原料來源廣泛和反應條件溫和的優(yōu)點，但是生產(chǎn)周期較長、分離精制工序復雜且加工成本較高?；瘜W法生產(chǎn)胞苷酸[10-11]，通常是用磷酸或者焦磷酸的活性衍生物與核苷進行磷酸化反應，反應步驟繁瑣、所用試劑昂貴且含有毒試劑，因此只適用于小規(guī)模生產(chǎn)且產(chǎn)品無法在食品領(lǐng)域中應用。

尿苷-胞苷激酶 (Uridine-cytidine kinase, UCK)是一種嘧啶核糖核苷激酶，廣泛存在于微生物、動物體和人體內(nèi)，是核苷酸代謝補償途徑中一種重要的催化劑[12-15]。UCK可以催化尿苷和胞苷磷酸化成為尿苷酸和胞苷酸[16]，但需要NTP作為磷酸供體。已有研究發(fā)現(xiàn)大腸桿菌、保加利亞乳桿菌、枯草芽孢桿菌來源的UCK均需要以GTP作為磷酸供體，但由于GTP原料成本過高，難以工業(yè)化放大[17-18]。

嗜熱棲熱菌Thermus thermophilusHB8來源的尿苷-胞苷激酶具有對胞苷的高度專一性，其Km值為72 μmol/L，只能夠催化胞苷到胞苷酸的反應[19]。我們對其進行了生物信息學分析發(fā)現(xiàn)其蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域中含有3個ATP結(jié)合位點、6個嘧啶堿基特異性位點和3個核糖特異性位點，因此推測其能夠以ATP作為磷酸供體完成催化反應。為了降低反應中ATP的消耗量，我們使用類球紅細菌Rhodobacter sphaeroides來源的聚磷酸激酶(Polyphosphate kinase, PPK) 以ADP和六偏磷酸鈉為底物催化生成ATP[20]，從而實現(xiàn)ATP的循環(huán)再生。為了增加酶的利用率，我們根據(jù)親和層析的原理，使用D403金屬螯合樹脂吸附Ni2+形成固定化載體，由于Ni2+能與重組蛋白攜帶的組氨酸標簽進行配位結(jié)合[21]，因此固定化載體能夠選擇性地吸附重組蛋白，從而在純化重組蛋白的同時將其固定于樹脂表面。使用上述固定化酶用于胞苷酸的制備，并對反應條件進行了系統(tǒng)優(yōu)化，為大規(guī)模生產(chǎn)胞苷酸提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌Escherichia coliDH5α、BL21(DE3)以及質(zhì)粒pET-28a均由本實驗室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB (Luria-Bertani) 培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0–7.2，121 ℃滅菌20 min。

TB (Terrific肉湯) 培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，甘油4 mL/L，KH2PO42.31 g/L，K2HPO412.54 g/L，pH 7.0–7.2，KH2PO4和K2HPO4與其他成分分開滅菌，121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 試劑

限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、ExTaqDNA聚合酶均購自TaKaRa公司；PCR產(chǎn)物回收及質(zhì)粒提取試劑盒購自北京博大泰克生物基因有限責任公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；胞苷標品、CMP標品、ATP購于美國Sigma公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 UCK蛋白的生物信息學分析

使用ExPASy服務器 (http://web.expasy.org/protparam/) 的ProtParam分析UCK蛋白的理化性質(zhì)。使用NCBI CD search (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/) 分析UCK蛋白的保守結(jié)構(gòu)域。使用在線程序ProtScale (https://web.expasy.org/protscale/)、TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)和SignalP4.1服務器 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) 分析UCK蛋白的親疏水性、跨膜區(qū)、信號肽等功能區(qū)。

1.3 重組菌株的構(gòu)建及重組酶的制備

1.3.1 質(zhì)粒pET-28a-uck的構(gòu)建

根據(jù)UCK蛋白的編碼基因序列 (GenBank登錄號3168643)，對其進行密碼子優(yōu)化，以大腸桿菌常見密碼子替換其稀有密碼子，使其可在大腸桿菌中高效表達，將優(yōu)化后的序列送至金唯智公司進行合成，獲得攜帶UCK編碼基因的重組質(zhì)粒pUC57-uck。使用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和Hind Ⅲ雙酶切pET-28a質(zhì)粒載體以及pUC57-uck。獲得線性化的pET-28a載體和uck基因片段，在T4 DNA連接酶的作用下連接載體與片段，將其轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α，再使用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，獲得pET-28a-uck質(zhì)粒。

1.3.2 質(zhì)粒pET-28a-ppk的構(gòu)建

以Rhodobacter sphaeroides基因組為模板，根據(jù)PPK蛋白的編碼基因序列 (GenBank登錄號3720266，設(shè)計帶有酶切位點EcoRⅠ和HindⅢ的上下游引物。使用引物及Ex-TaqPCR試劑盒擴增得到聚磷酸激酶編碼基因ppk。使用限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ對pET-28a質(zhì)粒載體以及ppk基因片段進行消化，在T4 DNA連接酶的作用下連接載體與片段，將其轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α，再使用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，獲得pET-28a-ppk質(zhì)粒。引物序列如表1所示。

1.3.3 重組菌株的構(gòu)建

取適宜濃度的質(zhì)粒pET-28a-uck和pET-28appk分別化轉(zhuǎn)至E.coliBL21(DE3) 感受態(tài)細胞中，在SOC培養(yǎng)基中活化后涂布于含硫酸卡那霉素(50 μg/mL) 的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃倒置培養(yǎng)12 h。挑取單菌落經(jīng)菌落PCR篩選出符合要求的陽性克隆菌株，將陽性菌株接入含有硫酸卡那霉素(50 μg /mL) 的LB液體培養(yǎng)基中，經(jīng)37 ℃振蕩培養(yǎng)12 h后，保存至甘油管保菌管中，于-80 ℃冰箱保藏。

1.3.4 重組酶的制備

將重組菌株從甘油保菌管中以1% (V/V) 的接種量接種至5 mL含有硫酸卡那霉素 (50 μg /mL)的LB液體培養(yǎng)基搖管中，于37 ℃、200 r/min活化培養(yǎng)12 h；以1% (V/V) 接種量轉(zhuǎn)接至30 mL含有硫酸卡那霉素 (50 μg /mL)的LB液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)10 h，再按2% (V/V) 接種量轉(zhuǎn)接至100 mL含有硫酸卡那霉素 (50 μg /mL) 的TB液體培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，37 ℃、200 r/min繼續(xù)培養(yǎng)；培養(yǎng)至OD600達到1.8–2.4時添加終濃度為0.2 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG)，25 ℃、200 r/min過夜培養(yǎng)誘導表達蛋白。培養(yǎng)結(jié)束后，將發(fā)酵液于4 ℃、8 000 r/min離心10 min收集菌體。使用PBS緩沖液 (pH 7.4) 或生理鹽水重懸清洗菌體細胞2–3次，再用30 mL裂解緩沖液 (50 mmol/L Na2HPO4、300 mmol/L NaCl，用NaOH調(diào)pH至8.0) 重懸均勻后，使用高壓勻漿細胞破碎儀 (上海永聯(lián)生物) 破碎細胞，6 ℃、80 MPa破碎5 min，細胞破碎液經(jīng)13 000 r/min離心20 min后取上清液，即為含有重組酶的粗酶液。

表1 ppk基因擴增引物Table 1 Primers for ppk gene amplification

1.4 固定化載體的制備

1.4.1 樹脂活化

取適量D403金屬螯合樹脂 (江蘇蘇青)，用去離子水沖洗后浸泡20 min，重復5次，清洗干凈后填入親和層析柱。用4% HCl溶液過柱活化樹脂直至流出液pH至1–2，靜置浸泡6 h，再用去離子水洗至中性。用4% NaOH溶液過柱活化樹脂直至流出液pH至13–14，靜置浸泡6 h，再用去離子水洗至中性待用。

1.4.2 固定化載體的制備

將100 mmol/L的硫酸鎳溶液泵入到層析柱中，流速為1 mL/min，使鎳離子吸附在樹脂上。流出液可以循環(huán)泵入到層析柱中，吸附2 h后用去離子水清洗樹脂，即制成鎳離子型金屬螯合樹脂，即固定化載體。

1.4.3 制備固定化酶

取制備好的固定化載體填于2根層析柱中，每根填量20 g，用裂解緩沖液平衡固定化載體。將提前準備好的UCK粗酶液和PPK粗酶液分別泵入到2根層析柱中，流速為1 mL/min。重組蛋白攜帶的組氨酸標簽與鎳離子進行配位結(jié)合從而特異性吸附在固定化載體上。將流出液循環(huán)泵入到層析柱中，循環(huán)吸附3次，即制得固定化酶。

1.5 固定化酶催化反應體系

使用50 mmol/L、Tris-HCl緩沖液 (pH 8.0)為溶劑，準確稱取不同濃度的胞苷和六偏磷酸鈉，40 mmol/L MgSO4·7H2O和0.5 mmol/L ATP充分溶解，加入1% (V/V) 的溴麝香草酚藍指示劑，用NaOH溶液調(diào)節(jié)初始pH值后用容量瓶定容至200 mL。

取20 mL配制好的反應液于100 mL三角瓶中，加入固定化UCK的濕樹脂6 g、固定化PPK的濕樹脂4 g，在200 r/min的恒溫水浴搖床中反應6 h，反應過程中根據(jù)反應液顏色變化調(diào)節(jié)pH值保持恒定。

酶活力單位定義：在標準酶活測定條件下，1 min催化底物胞苷生成1 μmol /L胞苷酸所需的酶量定義為一個酶活力單位，即1 U。

1.6 分析檢測方法

使用高效液相色譜 (HPLC) 檢測反應液中的胞苷和胞苷酸。色譜柱為SepaxHP-C18 (4.6 mm×250 mm，直徑5 μm)，紫外檢測器，檢測波長為280 nm，流動相為0.6%磷酸 (用三乙胺調(diào)pH 6.6)，柱溫30 ℃，流速1 mL/min。如圖1所示，胞苷的保留時間為20.9 min，胞苷酸的保留時間為17.4 min。按公式1計算胞苷酸的摩爾得率，按公式2計算固定化載體對蛋白的負載量。

圖1 胞苷和胞苷酸標品液相色譜圖Fig.1 High performance liquid chromatography of cytidine and CMP standards.

2 結(jié)果與分析

2.1 UCK蛋白的生物信息學分析

使用ExPASy Protemics Server提供的在線工具ProtParam對UCK蛋白的理化性質(zhì)進行分析預測。推測分子式為C1066H1720N302O292S7，相對分子質(zhì)量26.6 kDa，理論等電點 (pI) 為9.30，負電荷氨基酸殘基 (Asp和Glu) 總數(shù)為26，正電荷氨基酸殘基(Arg和Lys) 總數(shù)為30。不穩(wěn)定指數(shù)為47.73 (＞40)，表明UCK蛋白為不穩(wěn)定蛋白，親水性總平均指數(shù)為-0.086 (＜0)，表明UCK蛋白為親水性蛋白。

利用NCBI CD search分析UCK蛋白質(zhì)序列保守結(jié)構(gòu)域。UCK蛋白屬于NK超家族，PRK05480家族，無多重結(jié)構(gòu)域，含有3個ATP結(jié)合位點，6個嘧啶堿基特異性位點和3個核糖特異性位點。SignalP 4.1 server預測UCK蛋白不含信號肽，為非分泌型蛋白。TMHMM server預測該蛋白不含跨膜區(qū)，為非跨膜蛋白。ProtScale預測UCK蛋白的親疏水性，結(jié)果表明肽鏈中的第112位氨基酸疏水性最強，第95位氨基酸親水性最強，整條肽鏈中疏水性氨基酸總數(shù)少于親水性氨基酸總數(shù)，進一步證明該蛋白為可溶性親水蛋白。

2.2 UCK蛋白的重組表達及酶學性質(zhì)初探

為了獲得更多的UCK蛋白，我們使用大腸桿菌蛋白表達系統(tǒng)，以pET-28a質(zhì)粒作為表達載體。根據(jù)GenBank中的UCK蛋白編碼基因序列，經(jīng)密碼子優(yōu)化和人工合成后連接到pET-28a質(zhì)粒上，獲得重組質(zhì)粒pET-28a-uck。對重組質(zhì)粒進行酶切驗證，如圖2A所示。以限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ單酶切重組質(zhì)粒，在6 000 bp左右出現(xiàn)與預期大小一致的條帶。以EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切重組質(zhì)粒，分別在5 300 bp和700 bp附近出現(xiàn)與空質(zhì)粒和目的基因大小一致的條帶，證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖2 UCK蛋白的重組表達驗證Fig.2 Recombinant expression validation of protein UCK.(A) Restriction map of the recombinant plasmid.M: DNA marker; 1: EcoRⅠ single enzyme digestion of pET-28a; 2: EcoRⅠ and Hind Ⅲ double enzyme digestion of pET-28a; 3:target gene fragment; 4: EcoRⅠ single enzyme digestion of pET-28a-uck; 5: EcoRⅠ and Hind Ⅲ double enzyme digestion of pET-28a-uck.(B) SDS-PAGE analysis of recombinant proteins.M: protein marker; 1: supernatant samples in the cell lysates of E.coli pET-28a; 2: precipitation samples in the cell lysates of E.coli pET-28a; 3: supernatant samples in the cell lysates of E.coli pET-28a-uck; 4: precipitation in the cell lysates of E.coli pET-28a-uck.

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至宿主菌E.coliBL21 (DE3)感受態(tài)細胞后，接種于含有硫酸卡那霉素的TB培養(yǎng)基中，通過IPTG誘導表達目的蛋白。收集菌體細胞進行高壓勻漿破碎，對破碎后的上清液和沉淀分別進行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖2B所示。上清液在27 kDa附近出現(xiàn)明顯的條帶，與UCK蛋白的相對分子質(zhì)量一致，說明該蛋白能夠在大腸桿菌中可溶性表達。

為了驗證UCK的催化效果，配制催化反應體系，加入總蛋白濃度1.9 mg/mL的UCK粗酶液、30 mmol/L胞苷、30 mmol/L六偏磷酸鈉以及30 mmol/L ATP，在pH 8.0、30 ℃的條件下反應6 h，使用HPLC檢測發(fā)現(xiàn)有胞苷酸的特征峰，說明UCK能夠以ATP作為磷酸供體催化胞苷到胞苷酸的反應。

2.3 PPK蛋白的重組表達及酶學性質(zhì)初探

用于ATP再生的酶主要為激酶，通常這類酶的作用是將ATP或其他核苷酸上的γ-磷酸基團轉(zhuǎn)移至受體分子。該過程的逆反應常被用于將ADP復磷酸化為ATP。激酶是否適用于ATP再生系統(tǒng)的主要影響因素在于成本和穩(wěn)定性。近年來應用和研究最多的磷酸轉(zhuǎn)移酶是PPK，該酶能夠催化γ-磷酸鹽從ATP轉(zhuǎn)移到無機多聚磷酸(PolyP) 的可逆反應。由于PolyP低廉的價格，不同微生物來源的PPK在ATP再生反應中有著巨大的潛力[22-23]。

根據(jù)GenBank上的PPK蛋白編碼基因序列，經(jīng)基因組擴增后連接到pET-28a質(zhì)粒上，獲得重組質(zhì)粒pET-28a-ppk。對重組質(zhì)粒進行酶切驗證，如圖3A所示。以限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ單酶切重組質(zhì)粒，在6 300 bp左右出現(xiàn)與預期大小一致的條帶。以EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切重組質(zhì)粒，分別在5 300 bp和1 000 bp附近出現(xiàn)與空質(zhì)粒和目的基因大小一致的條帶，證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至宿主菌E.coliBL21 (DE3)感受態(tài)細胞后，接種于含有硫酸卡那霉素的TB培養(yǎng)基中，通過IPTG誘導表達目的蛋白。收集菌體細胞進行高壓勻漿破碎，對破碎后的上清液和沉淀分別進行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖3A所示。上清液在44 kDa附近出現(xiàn)明顯的條帶，與PPK蛋白的相對分子質(zhì)量一致，說明該蛋白能夠在大腸桿菌中可溶性表達。

圖3 PPK蛋白的重組表達驗證Fig.3 Recombinant expression validation of protein PPK.(A) Restriction map of the recombinant plasmid.M: DNA marker; 1: EcoRⅠ single enzyme digestion of pET-28a; 2: EcoRⅠ and Hind Ⅲ double enzyme digestion of pET-28a; 3:target gene fragment; 4: EcoRⅠ single enzyme digestion of pET-28a-ppk; 5: EcoRⅠ and Hind Ⅲ double enzyme digestion of pET-28a-ppk.(B) SDS-PAGE analysis of recombinant proteins.M: protein marker; 1: supernatant samples in the cell lysates of E.coli pET-28a; 2: precipitation samples in the cell lysates of E.coli pET-28a; 3: supernatant samples in the cell lysates of E.coli pET-28a-ppk; 4: precipitation in the cell lysates of E.coli pET-28a-ppk.

為了驗證雙酶偶聯(lián)的催化效果，配置催化反應體系，加入總蛋白濃度1.9 mg/mL UCK粗酶液和總蛋白濃度1.3 mg/mL PPK粗酶液，30 mmol/L胞苷、30 mmol/L六偏磷酸鈉以及0.5 mmol/L ATP，在pH 8.0、30 ℃的條件下反應6 h，使用HPLC檢測發(fā)現(xiàn)有胞苷酸的特征峰，說明Rhodobacter sphaeroides來源的PPK能夠有效催化ATP的再生反應，顯著降低ATP的使用量。

2.4 固定化酶的制備及催化反應條件的優(yōu)化

2.4.1 固定化酶的制備原理

使用pET-28a質(zhì)粒表達蛋白時，會在蛋白表面攜帶6個組氨酸分子組成的標簽。由于組氨酸含有的咪唑基團可以提供電子與金屬離子進行配位結(jié)合，因此含有這些氨基酸殘基的蛋白會特異性吸附在含有金屬離子的固定化載體上。D403金屬螯合樹脂是在大孔隙交聯(lián)結(jié)構(gòu)的聚苯乙烯共聚球體上引入亞胺基二乙酸螯合基團形成的離子交換樹脂，可以選擇性地交換吸附二價金屬離子。如圖4所示，使用D403樹脂吸附Ni2+形成固定化載體，再用于重組蛋白的特異性吸附，即可實現(xiàn)從粗酶液中原位純化固定化重組蛋白。將固定化酶用于胞苷酸的催化合成反應，對反應條件進行單因素優(yōu)化實驗。

圖4 固定化酶催化反應示意圖Fig.4 Schematic diagram of catalytic reaction of immobilized enzymes.

根據(jù)公式2計算固定化載體對蛋白的負載量，經(jīng)計算得固定化載體對UCK的負載量為330 μg/g，固定化載體對PPK的負載量為210 μg/g。固定化前后UCK的酶活損失為3%，PPK的酶活損失為5%。

2.4.2 pH值對固定化酶催化反應的影響

按照1.5的方法配制催化反應體系，考察底物胞苷和六偏磷酸鈉的加入量分別為30 mmol/L和15 mmol/L，用NaOH調(diào)節(jié)反應過程中的pH值，考察pH值對固定化酶催化反應的影響。如圖5所示，當pH值在 6.0–10.0范圍內(nèi)變化時，產(chǎn)物胞苷酸濃度呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，當pH值為8.0時，胞苷酸濃度達到最大，胞苷到胞苷酸的摩爾得率為96%。結(jié)果表明，堿性條件下兩種固定化酶的催化活力明顯高于酸性條件。

2.4.3 溫度對固定化酶催化反應的影響

按照1.5的方法配制催化反應體系，底物胞苷和六偏磷酸鈉的加入量分別為30 mmol/L和15 mmol/L，調(diào)節(jié)不同的反應溫度，考察溫度對固定化酶催化反應的影響。如圖6所示，當溫度在25–37 ℃范圍內(nèi)變化時，產(chǎn)物胞苷酸濃度呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，當溫度為30 ℃時，胞苷酸濃度達到最大，胞苷到胞苷酸的摩爾得率為95%。雖然UCK來源于Thermus thermophilusHB8，可以在高溫下保持酶的活力，但反應中另一種酶PPK來源于Rhodobacter sphaeroides，當溫度超過30 ℃時，該酶的催化活力會有所下降，從而導致固定化酶催化反應效率的降低。

圖5 pH值對固定化酶催化反應的影響Fig.5 Effect of pH value on the catalytic reaction of immobilized enzymes.

圖6 溫度對固定化酶催化反應的影響Fig.6 Effect of temperature on the catalytic reaction of immobilized enzymes.

2.4.4 底物濃度對固定化酶催化反應的影響

按照1.5的方法配制催化反應體系，考察底物胞苷和六偏磷酸鈉的加入量對固定化酶催化反應的影響。如表2所示，考察底物胞苷濃度在30–150 mmol/L范圍內(nèi)固定化酶的催化效率。從表中可以看出當?shù)孜锇諠舛仍?0–60 mmol/L之間時，胞苷酸的摩爾得率維持在96%的水平，當?shù)孜锇諠舛瘸^60 mmol/L時，固定化酶催化反應的產(chǎn)物摩爾得率逐漸下降。此外，提升六偏磷酸鈉的濃度對固定化酶催化反應影響不大。

2.5 利用固定化酶多批次催化制備胞苷酸

使用優(yōu)化后的反應條件，進行多批次催化反應制備胞苷酸。如表3所示，隨著反應次數(shù)的增多，固定化酶的催化反應效率逐漸降低。前5批次反應胞苷酸的摩爾得率能夠維持在80%以上，平均摩爾得率為91.2%，第6批次反應胞苷酸的摩爾得率降至52%。通過BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測反應液中游離蛋白的濃度變化發(fā)現(xiàn)，在反應過程中，部分重組酶會從固定化載體上脫落，從而導致固定化載體上的載酶量逐漸下降。這一方面是由于反應過程中其他離子會競爭性地替換Ni2+，另一方面則是由于反應過程中樹脂之間或樹脂與瓶壁之間的摩擦引起的固定化載體破碎。

表2 底物濃度對固定化酶催化反應的影響Table 2 Effect of substrate concentration on the catalytic reaction of immobilized enzymes

表3 利用固定化酶多批次催化反應制備胞苷酸Table 3 Production of CMP by multiple batch reaction using immobilized enzymes

3 結(jié)論

胞苷酸是一種重要的核苷酸產(chǎn)品，可作為食品添加劑、藥品以及藥物前體應用于不同領(lǐng)域。現(xiàn)有的胞苷酸生產(chǎn)方法主要包括核酸水解法和化學合成法，但生產(chǎn)過程繁瑣且非環(huán)境友好。酶催化法具有反應條件溫和、底物特異性強的優(yōu)勢，已逐步取代傳統(tǒng)方法用于胞苷酸的制備。已有研究表明，核苷酸代謝補償途徑中存在的UCK可以催化尿苷和胞苷磷酸化成為尿苷酸和胞苷酸，但反應過程需要NTP作為磷酸供體。Qian等[17-18]研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌和保加利亞乳桿菌來源的UCK催化胞苷酸合成時需要使用GTP作為磷酸供體，為了降低GTP的使用量，可以使用乙酸激酶催化乙酰磷酸和GDP生成GTP。使用上述體系反應6 h可以催化30 mmol/L的胞苷和0.5 mmol/L的GTP生成29.1 mmol/L的胞苷酸，摩爾轉(zhuǎn)化率達到97%。但上述偶聯(lián)反應中用于GTP再生的乙酰磷酸屬于極易分解的化合物，難以長時間貯存且使用量大 (與胞苷的摩爾比為1.5∶1)，嚴重影響大規(guī)模生產(chǎn)的穩(wěn)定性。

本研究使用Thermus thermophilusHB8來源的UCK用于胞苷酸的催化合成，證實了該酶可以以ATP作為磷酸供體，與GTP相比更為廉價。使用Rhodobacter sphaeroides來源的PPK催化六偏磷酸鈉和ADP生成ATP，證實了該酶可以高效保障偶聯(lián)反應中ATP的循環(huán)再生。六偏磷酸鈉是常見的磷酸鹽，穩(wěn)定性強且使用量較少 (與胞苷的摩爾比為0.5∶1)。

為了增加酶的重復利用率，本研究利用親和層析的原理，使用Ni2+活化的金屬螯合樹脂為固定化載體特異性吸附重組蛋白，在純化重組蛋白的同時實現(xiàn)了固定化，與常規(guī)的海藻酸鈣包埋法相比，操作更為簡單且固定化酶的比活力更高。在優(yōu)化的反應條件下，使用固定化酶以60 mmol/L胞苷和0.5 mmol/L ATP為底物，可實現(xiàn)5批次的高效連續(xù)催化反應，胞苷酸平均摩爾得率達到91.2%。為了進一步提高固定化酶的使用率，后期可以選擇其他類別的金屬螯合樹脂或者金屬離子，也可以調(diào)整重組蛋白上攜帶的標簽數(shù)量，提升固定化載體與重組蛋白結(jié)合的牢固程度。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本研究開發(fā)的固定化酶制備胞苷酸的方法具有反應成本低、操作性強、反應周期短、環(huán)境友好等特點，具有較好的工業(yè)應用潛質(zhì)。