大豆花葉病毒半夏分離物侵染性克隆構(gòu)建及鑒定

張麗，王德富，裴燕妮，咸珅，牛顏冰

山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 晉中 030801

植物病毒病俗稱植物“癌癥”，是危害糧食作物、蔬菜水果、觀賞植物、中藥材等的重要病原物，在世界范圍內(nèi)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。1915年，Clinton 從大豆植株上發(fā)現(xiàn)大豆花葉病毒(Soybean mosaic virus，SMV)，Gardner和Kendrick在1921年為其正式命名[1]。SMV是馬鈴薯Y病毒屬 (Potyvirus) 成員。SMV的宿主范圍非常窄，除大豆外，自然侵染西番蓮屬、半夏屬[2]等，其基因組為正義單鏈RNA，長約10 kb，被1個外殼蛋白包裹著。5′-末端共價結(jié)合基因組連接蛋白(Viral protein genome-linked，VPg)，3′-末端為多聚腺苷酸尾[3]。SMV基因組編碼一個大型開放閱讀框 (Open reading frame，ORF)，翻譯后的多聚蛋白經(jīng)病毒編碼的蛋白酶處理，產(chǎn)生一系列成熟蛋白，包括P1、HC-Pro、P3、P3-PIPO、6K1、CI、6K2、NIa-VPg、NIa-Pro、NIb和CP[2]。

侵染性克隆是指為了實現(xiàn)對病毒進行遺傳操作，將其病毒全長基因組序列構(gòu)建在質(zhì)粒載體上，且具有感染宿主的功能。由于RNA病毒在其基因組RNA水平難以利用常規(guī)的遺傳學(xué)手法進行研究[4]，構(gòu)建RNA病毒基因組全長cDNA侵染性克隆是進行反向遺傳研究的關(guān)鍵[5]。傳統(tǒng)的侵染性克隆構(gòu)建方法依賴于限制性內(nèi)切酶消化，這通常需要繁瑣的亞克隆步驟[1]，這些步驟可能會受到插入物和載體共用限制位點的局限進而改變病毒生存能力和傳染性。1984年首次獲得植物RNA病毒雀麥花葉病毒 (Brome mosaic virus，BMV)全長cDNA侵染性克隆，但馬鈴薯Y病毒屬病毒的體內(nèi)轉(zhuǎn)錄侵染性克隆成功構(gòu)建面臨的重要問題是較大病毒基因組cDNA組裝及其在大腸桿菌中的不穩(wěn)定性，導(dǎo)致構(gòu)建侵染性克隆費時費力，且成功率較低[6]。為了避免這些問題使侵染性克隆構(gòu)建方法簡單化，本研究采用Gibson組裝法成功組裝了SMV-SXBX全長cDNA侵染性克隆，實現(xiàn)了基因片段的精確快速組裝，這對SMV-SXBX致病機制的研究、病毒開發(fā)利用和基因功能的研究具有重要意義[7]。

Gibson組裝法又被稱為“Gibson等溫一步拼接法”，該方法不用考慮片段的長度或末端的互補性，即可利用T5核酸外切酶、Phusion聚合酶及TaqDNA連接酶的協(xié)同作用，在體外將多個帶有末端重疊序列的 DNA片段在單溫反應(yīng)管內(nèi)實現(xiàn)片段的連接組裝。其中T5核酸外切酶具有5′→3′核酸外切酶活性，能夠從5′端切割有重疊區(qū)的DNA片段，使其產(chǎn)生3′突出末端，且不與Phusion聚合酶競爭。該單鏈DNA的重疊序列在50 ℃特異性退火，并使外切酶逐漸熱失活[8]。由Phusion聚合酶和TaqDNA連接酶修復(fù)連接，而形成完整的雙鏈DNA分子，從而實現(xiàn)無痕拼接，這種穩(wěn)健的一步DNA組裝方法簡單、高效，適用于不依賴于限制性內(nèi)切酶位點的快速插入[9]。

在本研究中利用Gibson體外重組系統(tǒng)對3個重疊長距離PCR片段進行組裝，用含有病毒基因組的根癌農(nóng)桿菌克隆體通過農(nóng)桿菌浸潤法接種健康半夏的方法進行SMV-SXBX侵染性克隆構(gòu)建，進一步采用機械傳代、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR) 證實了由侵染性克隆產(chǎn)生的后代病毒具有侵染性，獲得穩(wěn)定侵染性克隆。SMV-SXBX侵染性克隆可以對SMV 序列進行有目的、精確的定位誘變，進而確定SMV的感病基因，分析病毒復(fù)制、運動、癥狀發(fā)展、宿主范圍和病毒與宿主的相互作用，以期為防御和控制SMV提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料

自山西省半夏主要種植區(qū)采集檢測具有大豆花葉病毒的半夏植株將其種植于試驗田中獲得大豆花葉病毒侵染的半夏病株，作為毒源植株。半夏脫毒幼苗由作者實驗室保存。本試驗所用質(zhì)粒pGreen II-35S為中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所庹德財老師惠贈、根癌農(nóng)桿菌菌株GV3101(pSoup) 購自上海唯地生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 酶與試劑

PrimeSTAR?GXL DNA Polymerase、pMD 18-T購自TaKaRa公司；Trizol試劑購自Invitrogen公司；Gibson Assembly Master Mix購自NEB公司；TaqDNA polymerse、TransScript?first-stand cDNA Synthesis SuperMix、大腸桿菌DH5α、pEASY?-Blunt Cloning Kit購自TransGen公司；Gel Extraction Kit和Plasmid Mini KitⅠ試劑盒購自O(shè)MEGA公司。

1.2 方法

1.2.1 提取總RNA、合成cDNA

用Trizol 試劑從SMV侵染的半夏葉片中提取總RNA，-80 ℃?zhèn)溆?。利用TransScript?firststand cDNA Synthesis SuperMix將SMV-SXBX的RNA轉(zhuǎn)化為cDNA。

1.2.2 引物設(shè)計

利用 Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物。其中pGreen SMV1F與SMV1R、SMV2F 與pGreen SMV2R (pGreen SMV2R′) 兩對特異引物分別用于擴增大片段SMV-SXBX1和A尾28 nt (56 nt)的大片段SMV-SXBX2 (圖1A)；pGr35S-SMVF(pGreen SMVF′)和pGr35S-SMVR用于質(zhì)粒載體線性化；SMV3F和SMV3R用于驗證SMV-SXBX全長的有效性。在引物設(shè)計時，pGreen SMV1F與pGr35S-SMVR、pGr35S-SMVF (pGr35SSMVF′) 與pGreen SMV2R (pGreen SMV2R′)、SMV1R與SMV2F之間都分別有25–30 bp的重疊序列，以便于完成Gibson組裝。引物均由生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成 (表1)。

1.2.3 目的基因獲取及載體制備

以1.2.1得到的cDNA為模板，利用兩對特異引物pGreen SMV1F與SMV1R、SMV2F與pGreen SMV2R (pGreen SMV2R′) 對SMV-SXBX基因組進行大片段擴增。以pGreen II-35S質(zhì)粒為模板，利用特異引物pGr35S-SMVF (pGr35S-SMVF′) 和pGr35S-SMVR采用反向PCR的方法使載體線性化。

1.2.4 Gibson組裝

通過NanoDrop分光光度計對回收產(chǎn)物檢測濃度后，按照Gibson Assembly Master Mix說明書計算兩個SMV-SXBX大片段和線性化載體加入量并對其進行組裝 (圖1B–D)。

1.2.5 農(nóng)桿菌化學(xué)轉(zhuǎn)化

將1.2.4組裝質(zhì)粒凍融轉(zhuǎn)化進農(nóng)桿菌GV3101(pSoup) 菌株，28 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)2–3 h，使其活化，活化菌液涂于含有卡那霉素 (Kanamycin，Kan) 和利福平 (Rifampicin，Rif) 的Luria Bertani(LB) 平板上，28 ℃培養(yǎng)2–4 d。

1.2.6 克隆鑒定

隨機挑選白色單菌落，28 ℃下于含有Kan和Rif液體LB中培養(yǎng)2–3 h，利用特異引物SMV3F和SMV3R (表1) 進行菌落PCR鑒定。鑒定為陽性的菌落，提取農(nóng)桿菌質(zhì)粒，然后再利用pGreen SMV1F與SMV1R、SMV2F與pGreen SMV2R進行SMV-SXBX全長的鑒定，鑒定為全長的質(zhì)粒，命名為pGreen-SMV-SXBX。以包含質(zhì)粒pGreen-SMV-SXBX農(nóng)桿菌菌液為模板分片段PCR鑒定全長cDNA侵染性克隆。

1.2.7 農(nóng)桿菌浸潤接種

測序正確克隆接種于含有Kan和Rif固體LB培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)，菌落長出后挑單克隆于含有相同抗生素和200 μmol/L乙酰丁香酮的LB液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，10 μL培養(yǎng)物在相同條件下至菌液OD600為0.7左右，隨后吸取1 mL菌液離心，收集菌體，無菌去離子水洗滌菌體，再次離心收集菌體[10]，用細(xì)胞懸浮緩沖液 (200 μmol/L乙酰丁香酮，10 mmol/L MES，pH 5.7，10 mmol/L MgCl2) 重懸并在室溫下避光處理2–3 h。使用1 mL注射器，無針頭真空浸潤法將重懸液輕輕接種到健康幼苗葉片背面，以pGreen II-35S空載質(zhì)粒的農(nóng)桿菌作為陰性對照。每個克隆接種5株，接種植株置于光照培養(yǎng)箱中，25 ℃、16 h光照下培養(yǎng)，接種1–2周后觀察統(tǒng)計發(fā)病情況。

1.2.8 機械摩擦接種

SMV-SXBX病毒接種液的制備：取1.2.7農(nóng)桿菌浸潤接種半夏的病癥葉片，稱重，置于在冰上預(yù)冷的滅菌研缽中，按1︰10配比加入同樣預(yù)冷的PBS緩沖液 (pH 7.2)，迅速研磨成漿液，用無菌紗布過濾掉葉片殘渣獲得病毒接種液備用。通過摩擦接種法將病毒接種液接種于脫毒半夏幼苗，接種后半夏保存于人工氣候室。

1.2.9 RT-PCR法檢測SMV-SXBX

以提取接種半夏的總RNA為模板，用引物SMV4F、SMV4R進行RT-PCR擴增檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 SMV-SXBX的全長cDNA克隆與組裝

以cDNA第一鏈為模板，利用3對特異引物pGreen SMV1F與SMV1R、SMV2F與pGreen SMV2R、SMV2F與pGreen SMV2R′擴增分別得到長度為6 627 bp和2 960 bp的SMV-SXBX基因組大片段Ⅰ和Ⅱ；以pGreenⅡ-35S質(zhì)粒為模板利用特異引物pGr35S-SMVF和pGr35S-SMVR、pGr35S-SMVF′和pGr35S-SMVR采用反向PCR的方法得到線性化載體3 233 bp，cDNA均得到預(yù)期大小的清晰條帶 (圖2A，2C)。

2.2 SMV-SXBX侵染性克隆鑒定

將3個純化的重疊片段Ⅰ、Ⅱ和載體在Gibson反應(yīng)中進一步組裝，重組產(chǎn)物凍融轉(zhuǎn)化進農(nóng)桿菌GV3101 (pSoup) 感受態(tài)細(xì)胞，并挑取單克隆菌落，抽提質(zhì)粒進行陽性克隆鑒定，結(jié)果表明，挑取的4個菌落為陽性 (圖2D)，通過用特異引物SMV3F、SMV3R進行菌落PCR鑒定，得到預(yù)期大小的清晰條帶 (圖2E)，經(jīng)測序分析確定為SMV。由于農(nóng)桿菌質(zhì)粒提取拷貝數(shù)低，故以農(nóng)桿菌菌液為模板，采用分片段PCR鑒定全長cDNA侵染性克隆。

表1 引物序列Table 1 The primer sequences

圖1 SMV基因組結(jié)構(gòu)及其SMV-SXBX全長不同長度A尾cDNA克隆構(gòu)建示意圖Fig.1 Schematic representation genome organization of soybean mosaic virus and construction of full-length cDNA clone of SMV-SXBX with different lengths of poly(A).(A) Schematic illustration of the genome organization of SMV and SMV-SXBX full-length cDNA clones with different lengths of poly(A).Filled blue boxes represent poly(A) with different lengths.The large ORF are shown as white filled boxes and PIPO are shown as line-box.Boxes represent encoded mature protein in the polyproteins: P1, HC-Pro, P3, P3-PIPO, 6K1, CI, 6K2, NIa-VPg, NIa-Pro, NIb and CP.The 5′- and 3′-untranslated regions indicated with black and blue boxes.(B) Digestion of vector with primer pGr35s-SMVF/F′ and pGr35s-SMVR to produce linearized vector.(C) Two overlapping SMV-SXBX cDNA fragments(1: 6 627 bp; 2: 2 960 bp).(D) Construct viral genome-encoding plasmids in vitro by one-step Gibson assembly.The overlapping regions are depicted by green, blue and grey shadow boxes, pink lines with the number of overlapping nucleotides indicated.Note that all of the fragments in the figure are not drawn exactly to scale.

圖2 SMV-SXBX侵染性克隆構(gòu)建電泳圖Fig.2 Electropherogram of construction full-length infectious cDNA clone of SMV-SXBX.(A) PCR product of pGreen SMV1F and SMV1R.(B) PCR product of SMV2F and pGreen SMV2R, SMV2F and pGreen SMV2R′.(C)pGr35S-SMVF and pGr35S-SMVR, pGr35S-SMVF′ and pGr35S-SMVR.M: DL 5000TM DNA marker.(D) Plasmid extraction result.(E) PCR product of colony PCR.Lane 1–4: infected plant; CK: healthy plant.

2.3 SMV-SXBX侵染性克隆活性檢測

2.3.1 體內(nèi)轉(zhuǎn)錄SMV-SXBX侵染性克隆注射接種半夏的病癥表現(xiàn)

體內(nèi)轉(zhuǎn)錄SMV-SXBX侵染性克隆農(nóng)桿菌注射接種半夏的結(jié)果表明：SMV-SXBX(56A) 侵染性克隆接種半夏植株的癥狀表現(xiàn)與野生SMV引起的癥狀相同，接種7 d時，同株珠芽新生非接種葉片在7 d時，具有典型癥狀，花葉、葉脈開始褪綠及黃化 (圖3A)，12 d時，隨著癥狀的嚴(yán)重，會出現(xiàn)葉片完全退化整個植株出現(xiàn)壞死，受侵染的植株在14 d時死亡。而SMV-SXBX(28A)侵染性克隆農(nóng)桿菌接種半夏植株、轉(zhuǎn)化空載體pGreenⅡ-35S的農(nóng)桿菌陰性對照組在接種半夏植株7 d后仍未表現(xiàn)出任何病癥。

2.3.2 機械接種檢測侵染性

為了驗證侵染性cDNA克隆產(chǎn)生后代病毒的生物學(xué)活性，將病毒接種液摩擦接種半夏健康植株。10 d機械接種植物也出現(xiàn)了同樣的癥狀，證明該接種方法效果穩(wěn)定，可以此為標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用于后續(xù)實驗。證明了病毒的后代在植物體內(nèi)有系統(tǒng)地運動，表明構(gòu)建侵染性克隆具有穩(wěn)定性和侵染性。

2.3.3 RT-PCR檢測

接種一周后從接種半夏珠芽新生非接種葉中抽提RNA，分別用引物SMV4F、SMV4R進行RT-PCR檢測，檢測結(jié)果顯示以待測半夏cDNA作為模板的泳道在相應(yīng)位置均出現(xiàn)單一明亮條帶(圖3B)，證明SMV-SXBX(56A) 接種半夏均被SMV-SXBX成功侵染，而轉(zhuǎn)化空載體pGreenⅡ-35S、SMV-SXBX(28A) 的農(nóng)桿菌注射接種的陰性對照組未檢測到，表明注射接種含空載體、SMV-SXBX(28A)的農(nóng)桿菌不能侵染半夏植株，同時RT-PCR產(chǎn)物測序結(jié)果顯示，均為SMV-SXBX病毒基因組序列。經(jīng)機械接種摩擦接種、病癥觀察及RT-PCR檢測均表明本實驗中利用Gibson系統(tǒng)構(gòu)建的適用農(nóng)桿菌注射接種的體內(nèi)轉(zhuǎn)錄侵染性克隆具有侵染性，能成功侵染半夏，對RT-PCR產(chǎn)物進行測序，并確認(rèn)SMV感染，說明SMV-SXBX侵染性克隆構(gòu)建成功。

圖3 不同長度A尾SMV-SXBX全長cDNA克隆接種半夏再生葉7 d后的癥狀示意圖 (A) 及RT-PCR檢測SMV-SXBX侵染性克隆農(nóng)桿菌注射接種半夏CP基因電泳圖 (B)Fig.3 Schematic representation symptoms of different lengths poly(A) SMV-SXBX full-length cDNA clones inoculated after 7 days of regeneration in Pinellia ternata and RT-PCR analysis of Pinellia ternata agroinoculated with full-length infectious cDNA clone of SMV-SXBX to detect the CP-coding regions.(A) Pinellia ternata plants systemically infected with the poly(28A), poly(56A) or pGeenⅡ-35S SMV-SXBX infectious clone and were photographed at 7 days post infiltration.Healthy; infected plant.(B) RT-PCR using primer pairs of SMV 4F/SMV 4R to detect the partial of CP-coding regions.lane 2–4: Pinellia ternata inoculated with Agrobacterium carrying the empty vector pGreenII-35S for PCR; lane 6–8: Pinellia ternata inoculated with Agrobacterium carrying the clone of pGreenⅡ- 35S-SXBX-56A for PCR;lane 10–12: Pinellia ternata inoculated with Agrobacterium carrying the clone of pGreenⅡ- 35S-SXBX-28A for PCR;lane 14–16: SMV of wild-type for PCR; lane 5, 13: DNA marker DL 2 000; lane 1: 9 ,17, 18: CK: healthy plant.

3 討論

構(gòu)建全長侵染性克隆對于反向遺傳學(xué)研究病毒生物學(xué)、病理學(xué)和病毒載體構(gòu)建必不可少，由于RNA基因組難以保存和操作，而克隆可用于穩(wěn)定地維持RNA病毒分子特征[11]，所以構(gòu)建cDNA侵染性克隆對于研究RNA病毒分子的生物學(xué)特性及其基因功能具有重要意義。2009年Gibson等描述的裝配法因其不需要酶或共同的限制位點故迄今為止最受歡迎，該裝配法是基于將重疊的PCR擴增的DNA片段在一個等溫步驟中組裝而成[12]，簡化了侵染性克隆的裝配，從而減少了植物病毒學(xué)的主要技術(shù)限制。Gibson組裝已被成功應(yīng)用于構(gòu)建Tymovirus、Carlavirus、Comovirus、Potyvirus、Polerovirus、Benyvirus成員侵染性克隆[13]。然而在先前的研究報道中，許多病毒全長克隆在細(xì)菌繁殖過程中可能會發(fā)生序列改變，如點突變和缺失[14]，尤其是基因組較大的PVY屬RNA病毒全長cDNA克隆在利用大腸桿菌構(gòu)建時由于其自身編碼的病毒蛋白會對宿主菌產(chǎn)生很強的毒性作用[15-17]，從而導(dǎo)致非特異性重組，難以或甚至不可能在大腸桿菌中進行繁殖。為了克服病毒基因序列在大腸桿菌中的不穩(wěn)定性，故構(gòu)建侵染性克隆時通常采用低拷貝載體、降低培養(yǎng)溫度、接種前進行體外連接、插入內(nèi)含子等方式減輕質(zhì)粒不穩(wěn)定性而獲得穩(wěn)定的侵染性克隆[18]，近年來更高效、更方便的策略是構(gòu)建穿梭質(zhì)粒，利用放射桿菌對植物病毒侵染性克隆進行克隆和接種，繞過了大腸桿菌克隆的要求，避免了不穩(wěn)定性[1]。

Poly(A) 尾在真核生物mRNA翻譯以及從細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)的運動中起著重要作用[19]，許多病毒的RNA具有3′ poly(A) 尾，對于陽性RNA病毒，poly(A) 尾與RNA的穩(wěn)定、翻譯和復(fù)制有關(guān)[20]。據(jù)報道，在一些病毒中poly(A) 尾對病毒侵染性具有重要作用，poly(A) 尾的長度也可能影響病毒的復(fù)制[21]，poly(A) 長度因病毒而異，病毒poly(A) 尾存在一個閾值，在低于閾值時會嚴(yán)重影響病毒的侵染性，尤其是對于PVY屬病毒，這種現(xiàn)象更為明顯，如TVMV需要37個或96個A[22]、PPV需要100個A[23]，ZYMV需要66個A[24]，TEV需要70–75個A[25]。幾種病毒poly(A) 尾長度與病毒侵染性呈正相關(guān)，包括竹花葉病毒 (Bamboo mosaic virus，BaMV)、白三葉草花葉病毒 (White clover mosaic virus，WCLMV)、豇豆花葉病毒 (Cowpea mosaic virus，CPMV)等。BaMV中一條足夠長的poly(A) 與上游二級結(jié)構(gòu)元素相互作用形成假結(jié)結(jié)構(gòu)，這種相互作用減少了病毒的積累，此外BaMV等幾種陽性RNA病毒的3′ poly(A) 尾序列與病毒RNA復(fù)制所需的宿主蛋白之間會發(fā)生相互作用[26]。其他植物病毒如馬鈴薯Y病毒的3′末端poly(A) 尾，也通過與許多宿主蛋白相互作用發(fā)揮重要作用[27]，木槿潛伏新加坡病毒 (Hibiscus latent singapore virus，HLSV) poly(A) 尾長度為78–96 nt，當(dāng)poly(A) 尾長度小于24 nt時，HLSV不能復(fù)制，因此24 nt poly(A) 尾是HLSV在煙草中進行復(fù)制所需的最小長度，其長度影響著HLSV的病毒復(fù)制效率[28]。故本研究推測28 nt poly(A) 還沒有達到SMV復(fù)制在半夏中所需的最小長度，而56 nt poly(A) 達到或已超過SMV復(fù)制在半夏中所需的最小長度，具體SMV復(fù)制在半夏中所需的最小長度還有待于進一步研究，本文為SMV侵染性克隆構(gòu)建研究奠定理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究基于Gibson體外組裝策略快速高效構(gòu)建具有生物活性的SMV-SXBX農(nóng)桿菌侵染性克隆，由侵染性克隆產(chǎn)生的病毒汁液接種半夏引起了典型的SMV感染癥狀，并被穩(wěn)定地機械傳播給后代。我們發(fā)現(xiàn)SMV侵染性與其3′末端poly(A) 尾長度相關(guān)，構(gòu)建了28 nt和56 nt poly(A)尾的SMV-SXBX侵染性克隆，結(jié)果表明，SMV-SXBX(28) 侵染植株無癥狀而SMV-SXBX(56) 具有侵染性，接種葉片壞死，致死癥狀嚴(yán)重。本文高效便捷的構(gòu)建方法及poly(A) 尾對病毒侵染性的影響也為構(gòu)建其他PVY屬病毒或基因組較大的RNA病毒提供了新的借鑒和思路。