一種真核細(xì)胞分泌型重組融合蛋白rPC的構(gòu)建、表達(dá)與純化

李春春，謝雨瓊，曹江，邵吉民

1 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院 附屬第二醫(yī)院臨床研究中心，浙江 杭州 310009

2 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院 病理學(xué)與病理生理學(xué)系，浙江 杭州 310058

惡性腫瘤是危及人類生命的重大疾病，而免疫檢查點(diǎn)異常是導(dǎo)致其發(fā)生和進(jìn)展的重要因素之一。抑制性免疫檢查點(diǎn)蛋白通過與各自配體結(jié)合而抑制免疫功能，腫瘤組織中兩個(gè)抑制性免疫檢查點(diǎn)程序性細(xì)胞死亡蛋白 (Programmed cell death protein 1，PD-1) 和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4 (Cytotoxic T lymphocyte associated antigen 4，CTLA-4) 是目前腫瘤治療中的重要靶點(diǎn)，已有相應(yīng)的抗體藥物應(yīng)用于臨床，可以通過封閉并阻斷相應(yīng)受體-配體的結(jié)合而解除腫瘤組織的免疫抑制狀態(tài)，發(fā)揮抗腫瘤作用[1-3]。但是由于腫瘤組織中通常有多種免疫檢查點(diǎn)的異常，因此會(huì)對單一靶點(diǎn)的藥物產(chǎn)生耐藥，多靶點(diǎn)同時(shí)封閉可避免這一問題，提高療效[4-5]。對靶點(diǎn)蛋白的封閉可以利用特異性抗原/抗體的競爭性結(jié)合，也可以利用特異性受體/配體的競爭性結(jié)合。對多靶點(diǎn)同時(shí)封閉可以通過基因工程手段構(gòu)建雙靶向重組抗體或由不同受體結(jié)合域組成的重組融合蛋白實(shí)現(xiàn)。

人體內(nèi)除了在T細(xì)胞表面有PD-1和CTLA-4等免疫檢查點(diǎn)受體蛋白表達(dá)外，還存在著相應(yīng)的游離的可溶性受體，即sPD-1和sCTLA-4等，協(xié)調(diào)機(jī)體免疫調(diào)節(jié)[6-8]。因此我們采用特異性受體/配體競爭性結(jié)合策略，利用PD-1和CTLA-4的胞外功能域設(shè)計(jì)了一個(gè)全新的重組融合蛋白，可結(jié)合到表達(dá)PD-L1、PD-L2、CD80和CD86等任何一種PD-1或CTLA-4配體的細(xì)胞表面，從而封閉這些配體，使之無法與T細(xì)胞表面的PD-1或CTLA-4結(jié)合而抑制T細(xì)胞活性。在本工作中我們設(shè)計(jì)了一個(gè)含有人的PD-1和CTLA-4兩個(gè)受體功能域的重組融合蛋白rPC (Recombinant PD-1-CTLA-4) 編碼序列，并成功獲得了由哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的重組融合受體蛋白，并對該蛋白的結(jié)合能力等作了初步鑒定。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料

人胚腎細(xì)胞HEK293、人肺鱗癌細(xì)胞NCI-H226、人肺腺癌細(xì)胞A549、人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、人肝癌細(xì)胞HEPG2購自ATCC；人乳腺癌細(xì)胞Bcap-37、人胃腺癌細(xì)胞SGC7901購自上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫；人胃印戒細(xì)胞癌GCSR1-6由本課題組建系[9]；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自北京康為世紀(jì)生物有限公司；DNA marker 1 kb ladder plus購自廣州東盛生物科技有限公司；RPMI1640培養(yǎng)液、DMEM高糖培養(yǎng)液購自武漢博士德生物工程有限公司；胎牛血清 (FBS) 購自Biological Industries公司；LB培養(yǎng)基購自生工生物工程 (上海) 股份有限公司；限制性內(nèi)切酶KpnⅠ、NotⅠ購自New England Biolabs公司；瓊脂糖、RNA提取試劑Trizol購自Invitrogen公司；蛋白預(yù)染marker購自Thermo公司；考馬斯亮藍(lán)快速染色液購自碧云天生物技術(shù)公司；BCA蛋白定量試劑盒購自Pierce公司；Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate購 自Merck Millipore公司；HRP標(biāo)記的GAPDH抗體購自上?？党捎邢薰?；HRP標(biāo)記的6×His Tag抗體購自華安生物有限公司；DyLight650標(biāo)記的6×His tag抗體購自Abcam公司；細(xì)胞核染料Hochest33342購自Sigma公司；轉(zhuǎn)染試劑Attractene Transfection Reagent、親和層析用Ni-NTA Agarose、切膠回收試劑盒Gel Extraction Kit均購自QIAGEN公司；細(xì)胞活性檢測試劑Cell Counting Kit 8購自Dojindo公司；質(zhì)粒提取試劑盒Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System、逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs、RNA酶抑制劑、T4 DNA Ligase、熒光定量試劑盒GoTaq qPCR Master購自Promega公司。

1.2 重組融合蛋白rPC的設(shè)計(jì)與表達(dá)載體的構(gòu)建

包含有人PD-1和CTLA-4的重組融合蛋白rPC的設(shè)計(jì)如圖1所示，該重組蛋白N端為Gaussia熒光素酶的分泌型信號(hào)肽，PD-1和CTLA-4兩個(gè)功能域之間由人IgG鉸鏈區(qū)連接，C端為6×His標(biāo)簽。其中Gaussia熒光素酶信號(hào)肽序列為pSF-CMV-Puro-NH2-GAUS-Gaussia (Luciferase)分泌型質(zhì)粒 (Sigma-Aldrich，OGS1498) 的nt 882–929，PD-1功能域序列為GenBank數(shù)據(jù)庫中人PD-1 mRNA序列(NM_005018) 的nt 117–566，CTLA-4功能域序列為GenBank數(shù)據(jù)庫中人CTLA-4 mRNA序列 (NM_001037631) 的nt 278–694。人IgG的鉸鏈區(qū)序列為GenBank數(shù)據(jù)庫人免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)mRNA序列(MG815646) 的nt 298–366。該序列兩端引入NotⅠ酶切位點(diǎn)，并在起始密碼子前增加Kozak序列 (GCCACC)。

上述重組融合蛋白編碼核苷酸序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，合成的序列連接在pUC57的質(zhì)粒載體上(pUC57-rPC)。用NotⅠ酶將rPC編碼序列從pUC57-rPC上切下，用NotⅠ酶將pLVX-IRES-ZsGreen1載體酶切后用堿性磷酸酶處理以防自身環(huán)化，將二者切膠回收，16 ℃連接過夜，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)菌，挑取克隆，提取質(zhì)粒，用NotⅠ酶切鑒定是否有片段插入，用KpnⅠ酶切進(jìn)一步確定rPC編碼序列插入方向，正向插入的質(zhì)粒命名為pLVX-IRESZsGreen1-rPC。

1.3 穩(wěn)定表達(dá)rPC融合蛋白的HEK293細(xì)胞系的建立

HEK293細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液中。取生長狀態(tài)良好的HEK293細(xì)胞，以5×105個(gè)接種于φ35 mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)16–18 h用于轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染操作按照試劑說明進(jìn)行：取1 μg pLVX-IRES-ZsGreen1-rPC質(zhì)粒稀釋于DMEM培養(yǎng)液中，終體積為100 μL，加入4.5 μL Attractene 轉(zhuǎn)染試劑，輕輕混勻，于室溫靜置15 min以形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。吸去φ35 mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)液，加入1 mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，將準(zhǔn)備好的轉(zhuǎn)染復(fù)合物均勻地滴加到培養(yǎng)皿中，輕輕混勻，培養(yǎng)6 h后加入2 mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。采用有限稀釋法進(jìn)行單克隆細(xì)胞培養(yǎng)：用胰酶消化細(xì)胞后計(jì)數(shù)，取適量細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液懸浮至10個(gè)細(xì)胞/mL，以每孔100 μL加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)10–14 d后在熒光顯微鏡下觀察，對有綠色熒光的細(xì)胞孔再次做單克隆化培養(yǎng)，獲得穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞克隆，擴(kuò)增培養(yǎng)。

圖1 重組融合蛋白rPC設(shè)計(jì)示意圖Fig.1 Illustration for the design of recombinant fusion protein rPC.

1.4 Western blotting分析

收集能穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞克隆，以未轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞作為對照，用三去污裂解液(0.5 mol/L Tris-HCl，pH 8.0，0.15 mol/L NaCl，0.2 g/L疊氮鈉，1 g/L SDS，100 mg/L苯甲基黃酰氟，1 mg/L抑肽酶，1 mL/L Nonidet P-40，5 g/L 去氧膽酸鈉)冰上裂解提取總蛋白，利用BCA蛋白定量試劑盒定量，取10 μg總蛋白熱變性后進(jìn)行10%SDS-PAGE檢測，20 mA電泳1.5 h，250 mA轉(zhuǎn)膜2 h，轉(zhuǎn)膜后的PVDF膜用10%脫脂奶粉室溫封閉30 min，用HRP標(biāo)記的anti-6×His tag抗體以1∶3 000的稀釋濃度室溫結(jié)合1 h，用TBST緩沖液洗膜3次后，加入化學(xué)發(fā)光底物顯帶。內(nèi)參檢測使用有HRP標(biāo)記的GAPDH抗體(1∶5 000)室溫結(jié)合1 h，同樣在TBST洗滌后，加入化學(xué)發(fā)光底物顯帶，鑒定rPC的表達(dá)并篩選出rPC表達(dá)量相對較高的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆，并將此克隆命名為HEK293/rPC。

1.5 rPC融合蛋白的純化

HEK293/rPC細(xì)胞傳代培養(yǎng)16–18 h后換液，將胎牛血清濃度由10%降至2.5%，培養(yǎng)72 h、收集培養(yǎng)上清。收集的培養(yǎng)上清經(jīng)3 000 r/min、4 ℃離心10 min，收集上清，真空冷凍干燥，少量無菌水重新溶解后以PBS作為緩沖液進(jìn)行透析(截留分子量3 000 Da)后用于純化。Ni-NTA瓊脂糖凝膠懸液用結(jié)合緩沖液 (50 mmol/L NaH2PO4，500 mmol/L NaCl，10 mmol/L咪唑，pH 8.0) 平衡，將透析后的濃縮培養(yǎng)上清加NaCl至500 mmol/L，加咪唑至10 mmol/L，調(diào)pH值至8.0后與已平衡的Ni-NTA瓊脂糖凝膠混勻，于4 ℃結(jié)合16–18 h。2 000 r/min 離心1 min，棄上清，依次以洗滌緩沖液Ⅰ(50 mmol/L NaH2PO4，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L咪唑，pH 8.0) 和洗滌緩沖液Ⅱ(50 mmol/L NaH2PO4，500 mmol/L NaCl，40 mmol/L咪唑，pH 8.0) 各洗2次，最后用洗脫液 (50 mmol/L NaH2PO4，500 mmol/L NaCl，250 mmol/L咪唑，pH 8.0) 洗脫，得到純化的蛋白溶液。使用Merck Millipore超濾離心管Amicon?Ultra-4 (4 mL/10 kDa，UFC801096) 去除咪唑，并利用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。純化的rPC融合蛋白經(jīng)10%SDS-PAGE檢測，用考馬斯亮藍(lán)快速染色液染色，并用上述Western blotting方法鑒定。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測腫瘤細(xì)胞配體表達(dá)

將NCI-H226、A549、Bcap-37、SGC7901、GCSR1-6細(xì)胞培養(yǎng)在含1 0%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，MCF-7、HepG2培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液中，待細(xì)胞生長匯合度達(dá)到80%–90%，分別收集細(xì)胞，利用Trizol試劑提取各細(xì)胞總RNA，使用美國Denovix公司的超微量核酸測定儀 (DS-11) 進(jìn)行定量，各取2 μg RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，體系為：0.4 mmol/L oligo(dT) 18，0.8 mmol/L dNTPs，200 U M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，25 U RNA酶抑制劑，DEPC-H2O，總體積25 μL，42 ℃反應(yīng)1 h。取2 μL上述逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為：2 μL cDNA，400 nmol/L各上下游引物，10 μL GoTaq qPCR Master Mix，用Nuclease-free water補(bǔ)至總體積20 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性2 min；擴(kuò)增程序95 ℃，15 s，60 ℃，45 s，共40個(gè)循環(huán)。特異性上下游引物見表1，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。對PD-L1、PD-L2、CD80、CD86進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，以GAPDH為內(nèi)參，根據(jù)各細(xì)胞的PD-L1、PD-L2、CD80、CD86的Ct值，再以2-ΔCt作為各基因的相對表達(dá)量(ΔCt＝Ct目的基因－CtGAPDH)，挑選表達(dá)量相對較高的腫瘤細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光染色檢測。

1.7 重組融合蛋白rPC與腫瘤細(xì)胞的結(jié)合

取6×104個(gè)生長狀態(tài)良好的細(xì)胞接種于24孔板中，培養(yǎng)16–18 h。吸去培養(yǎng)液，以預(yù)冷的PBS清洗3次，每次5 min。用4% 多聚甲醛固定NCI-H226細(xì)胞20 min，PBS清洗3次后，用5% BSA封閉1 h后，對照組加入5% BSA，實(shí)驗(yàn)組加入5 μg/mL用5% BSA稀釋的rPC蛋白，4 ℃結(jié)合過夜，以PBS清洗3次，每次5 min，加入1∶1 000稀釋的以DyLight650標(biāo)記的6×His tag抗體，室溫避光結(jié)合2 h，以PBS清洗3次，每次5 min，最后用100 ng/mL的Hochest33342進(jìn)行細(xì)胞核染色，染色后PBS清洗3次，每次5 min。倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。以PBS代替rPC蛋白作為陰性對照。

1.8 重組融合蛋白rPC對NCI-H226細(xì)胞增殖的影響

取生長狀態(tài)良好的NCI-H226細(xì)胞，胰酶消化并計(jì)數(shù)，以8 000個(gè)/孔細(xì)胞接種于96孔板中，培養(yǎng)16–18 h，加入純化的rPC蛋白至終濃度分別為20、10、5、2.5、1.25、0.625、0 μg/mL每個(gè)濃度5 個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，吸去上清液，加入10 μL CCK-8，培養(yǎng)2 h后測OD450，分析融合蛋白對細(xì)胞生長的影響。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測用引物序列Table 1 Primer sequences for real-time fluorescent quantitative PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 pLVX-IRES-ZsGreen1-rPC表達(dá)載體的鑒定

將重組表達(dá)載體 pLVX-IRES-ZsGreen1-rPC用NotⅠ酶切和KpnⅠ酶切兩種酶切方法進(jìn)行鑒定。如圖2所示，用NotⅠ酶切得到大小約為1 030 bp和8 204 bp兩條帶，表明rPC片段已經(jīng)插入pLVXIRES-ZsGreen1載體中；用KpnⅠ酶切來確定片段插入的方向，正向插入可得到1 281 bp、1 567 bp和6 386 bp三個(gè)條帶，表明目的基因片段rPC成功正向插入到pLVX-IRES-ZsGreen1-rPC載體上。

2.2 穩(wěn)定表達(dá)rPC蛋白的HEK293/rPC細(xì)胞系的建立及鑒定

提取轉(zhuǎn)染pLVX-IRES-ZsGreen1-rPC重組載體的HEK293細(xì)胞克隆和未轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞總蛋白，利用Western blotting檢測rPC表達(dá)水平，結(jié)果見圖3。由圖中可以看出，所有細(xì)胞克隆均表達(dá)rPC蛋白，將表達(dá)較高的H克隆定為HEK293/rPC，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。圖4為熒光顯微鏡下觀察該細(xì)胞克隆中綠熒光蛋白的表達(dá)情況。

圖2 pLVX-IRES-ZsGreen1-rPC質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.2 Characterization of plasmid pLVX-IRESZsGreen1-rPC by restriction endonuclease digestion.M:1 kb DNA ladder; 1: pLVX-IRES-ZsGreen1-rPC digested by NotⅠ; 2: pLVX-IRES-ZsGreen1-rPC digested by KpnⅠ.

2.3 重組融合蛋白rPC的純化及鑒定

圖3 Western blotting檢測rPC的表達(dá)Fig.3 Detection of rPC expression by Western blotting.M: protein molecular weight standard; A–H: different clones of pLVX-IRES-ZsGreen1-rPC transfected HEK293 cells; Ctrl: non-transfected HEK293 as negative control.

圖4 熒光顯微鏡下觀察HEK293/rPC細(xì)胞中綠熒光蛋白的表達(dá)Fig.4 Expression of green fluorescent protein in HEK293/rPC cells observed under fluorescent microscope.(A)Bright-field observation.(B) Fluorescence observation.

圖5 重組融合蛋白rPC的純化與鑒定Fig.5 Purification and characterization of recombinant fusion protein rPC.(A) 10% SDS-PAGE followed by Coomassie Brilliant Blue staining.M: protein molecular weight standard; 1: purified rPC; 2: crude sample.(B) Western blotting for rPC.M: protein molecular weight standard; 1: purified rPC.

HEK293/rPC H克隆培養(yǎng)液上清中rPC蛋白經(jīng)純化定量后，進(jìn)行10% SDS-PAGE檢測，考馬斯亮藍(lán)快速染色結(jié)果見圖5A。由圖中可見，純化前的培養(yǎng)液上清中的目的蛋白含量很少，主要為培養(yǎng)液中的牛血清白蛋白之類的其他蛋白成分，親和純化后的樣品經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色顯示為單一條帶。純化后的樣品經(jīng)Western blotting鑒定也僅顯示一條特異性條帶，表明純化成功 (圖5B)。

2.4 rPC與腫瘤細(xì)胞結(jié)合

為了驗(yàn)證上述重組融合蛋白rPC是否可以有效地與細(xì)胞表面的相應(yīng)配體結(jié)合，我們先對一些腫瘤細(xì)胞中的配體表達(dá)情況進(jìn)行了檢測。對NCI-H226、A549、Bcap-37、MCF-7、HepG2、SGC7901、GCSR1-6細(xì)胞提取總RNA后，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測了PD-1配體PD-L1和PD-L2、CTLA-4的配體CD80、CD86以及內(nèi)參GAPDH的表達(dá)。上述腫瘤細(xì)胞各種配體基因相對表達(dá)量見圖6，其中CD80的表達(dá)在各細(xì)胞中基本上都較少，NCI-H226細(xì)胞的PD-L1、PD-L2、CD86三個(gè)配體基因表達(dá)比其余腫瘤細(xì)胞的表達(dá)量均高一些，因此我們選擇了NCI-H226細(xì)胞，利用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)，檢測重組融合蛋白rPC與腫瘤細(xì)胞的結(jié)合能力。從圖7的結(jié)果可以看出，在相同曝光時(shí)間下，對照組NCI-H226細(xì)胞沒有顯示出熒光信號(hào)，而以純化的rPC結(jié)合的NCI-H226細(xì)胞可以在熒光顯微鏡下看到紅色熒光，說明rPC蛋白可以與NCI-H226細(xì)胞有效地特異性結(jié)合。

圖6 腫瘤細(xì)胞中PD-L1、PD-L2、CD80和CD86的相對表達(dá)量Fig.6 Relative expression level of PD-L1, PD-L2,CD80 and CD86 in cancer cells.

圖7 重組融合蛋白rPC與NCI-H226細(xì)胞的結(jié)合實(shí)驗(yàn)Fig.7 Binding assay of recombinant fusion protein rPC with NCI-H226 cells.

2.5 融合蛋白對腫瘤細(xì)胞增殖的影響

圖8 rPC對NCI-H226細(xì)胞生長的影響Fig.8 Effect of rPC on the growth of NCI-H226 cells.

圖8為CCK-8法檢測不同濃度的重組融合蛋白rPC對NCI-H226細(xì)胞生長的影響。從圖中可看出，重組蛋白rPC對NCI-H226生長沒有明顯的直接促進(jìn)或抑制作用。

3 討論

免疫逃避是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要原因，而免疫檢查點(diǎn)的異常則是免疫逃避的機(jī)制之一。腫瘤細(xì)胞會(huì)通過T細(xì)胞PD-1、CTLA4等抑制性免疫檢查點(diǎn)相關(guān)通路來逃避免疫系統(tǒng)，以抗體阻斷這些通路可對惡性腫瘤起到治療作用[10-11]。目前針對免疫檢查點(diǎn)PD1/PD-L1和CTLA-4的藥物已用于臨床[12-15]，但是也存在著應(yīng)答率低和耐藥的問題，而腫瘤組織中多個(gè)免疫檢查點(diǎn)異常是導(dǎo)致這些問題的重要原因之一，采用多個(gè)單一靶點(diǎn)藥物聯(lián)合使用可以提高療效[4,16]，而研發(fā)多靶點(diǎn)藥物將能夠同時(shí)封閉多個(gè)免疫檢查點(diǎn)，更好地解除T細(xì)胞的抑制，發(fā)揮更強(qiáng)的抗腫瘤效應(yīng)。已有報(bào)道顯示一種重組PD-1蛋白具有很好的免疫調(diào)節(jié)作用[17]。因此，本研究設(shè)計(jì)了重組融合蛋白rPC，含有PD-1和CTLA-4兩個(gè)檢查點(diǎn)蛋白的胞外功能域，不僅能與PD-1的配體PD-L1和PD-L2結(jié)合，而且也能與CTLA-4的配體B7-1和B7-2結(jié)合，因此能夠同時(shí)封閉并阻斷腫瘤細(xì)胞表面和抗原遞呈細(xì)胞表面的PD-LI、PD-L2、B7-1和B7-2等配體對T細(xì)胞表面的PD-1和CTLA-4的結(jié)合，發(fā)揮雙靶點(diǎn)解除免疫抑制的作用，體現(xiàn)出比單一靶點(diǎn)藥物更好的療效。

由于哺乳動(dòng)物細(xì)胞有能夠使蛋白質(zhì)正確折疊所必需的各種分子伴侶以及輔助因子和翻譯后修飾，保證蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，在表達(dá)外源蛋白時(shí)相對原核細(xì)胞有一定的優(yōu)勢，因此目前重組抗體藥物均使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行生產(chǎn)。中國倉鼠卵巢(CHO)和人胚腎(HEK 293)細(xì)胞是常用于生產(chǎn)重組蛋白的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。HEK 293細(xì)胞具有轉(zhuǎn)染效率高、易于培養(yǎng)的特點(diǎn)[18]，因此我們在工作中選擇了HEK293作為表達(dá)系統(tǒng)開展研究。

我們在序列的設(shè)計(jì)方面，在起始密碼子前加上Kozak序列有助于真核細(xì)胞中的翻譯；在N端使用的Gaussia熒光素酶信號(hào)肽為相對效率較高的分泌型信號(hào)肽[19-20]；PD-1和CTLA-4功能域之間采用天然的IgG重鏈的鉸鏈區(qū)來連接，可以使得兩個(gè)功能域更好地獨(dú)立發(fā)揮作用而減少相互干擾；6×His序列為相對較小的標(biāo)簽，對重組蛋白的功能影響不大，而且有助于檢測和分離純化。

在成功獲得穩(wěn)定表達(dá)重組融合蛋白rPC的細(xì)胞克隆后我們進(jìn)行了rPC的分離純化。由于rPC是分泌到培養(yǎng)液中的，因此我們在細(xì)胞培養(yǎng)中采用2.5%的低血清濃度，一方面可以使細(xì)胞生長不會(huì)因?yàn)樯L過快頻繁傳代導(dǎo)致上清中的rPC積累過少，另一方面也可以盡量減少血清中各種蛋白濃度過高對后續(xù)純化的干擾(從圖5A可以看出，即使采用了低血清濃度培養(yǎng)，培養(yǎng)上清中主要的蛋白質(zhì)還是高豐度的白蛋白)。根據(jù)一級(jí)結(jié)構(gòu)計(jì)算得到的重組融合蛋白rPC的理論分子量應(yīng)為37.8 kDa，但我們在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)rPC的表觀分子量大于理論分子量，表明rPC重組融合蛋白可能在翻譯后有一定的修飾，因?yàn)镻D-1和CTLA-4兩個(gè)功能域均為胞外段，可能發(fā)生不同程度的糖基化[21]。

PD-1的配體PD-L1、PD-L2可表達(dá)于腫瘤細(xì)胞，而CTLA-4的配體CD80、CD86較多表達(dá)在抗原遞呈細(xì)胞，但腫瘤細(xì)胞也會(huì)有少量表達(dá)。為了驗(yàn)證rPC是否具有與相應(yīng)配體結(jié)合的生物活性，我們挑選了PD-L1和PD-L2都有較高表達(dá)且CD80和CD86也有一定表達(dá)的人肺癌NCI-H226細(xì)胞進(jìn)行了結(jié)合實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明我們得到的rPC純化蛋白可以有效地與該細(xì)胞結(jié)合，具有生物活性。另外，我們還用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)排除了rPC對腫瘤細(xì)胞生長具有促進(jìn)作用的風(fēng)險(xiǎn)。

為了實(shí)驗(yàn)方便本研究中我們采用的是C端6×His Tag標(biāo)簽，證明了由PD-1和CTLA-4相應(yīng)功能域拼合的重組融合蛋白rPC具有結(jié)合表達(dá)相應(yīng)受體的腫瘤細(xì)胞的能力。后續(xù)工作我們將考慮改用人免疫球蛋白的Fc結(jié)構(gòu)域，F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域的應(yīng)用一方面能夠使得融合蛋白在體內(nèi)有較好的穩(wěn)定性，另一方面還可以研究由不同受體結(jié)合域組成的融合蛋白是否能和抗體一樣發(fā)揮一定的抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用 (Antibodydependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)，在對相應(yīng)配體的靶點(diǎn)進(jìn)行封閉的同時(shí)還可以對腫瘤細(xì)胞或抑制性T細(xì)胞進(jìn)行殺傷 (除了封閉靶點(diǎn)作用，臨床上CTLA-4抗體的治療作用更多的是以這一方式體現(xiàn)[22-23])。

本研究已經(jīng)成功得到一種新型重組融合蛋白rPC蛋白，并證實(shí)其能與腫瘤細(xì)胞結(jié)合，但不刺激腫瘤細(xì)胞生長，為進(jìn)一步研究該蛋白體內(nèi)外各種功能以及作為一種新型蛋白藥物研發(fā)打下了基礎(chǔ)，并將為今后利用重組融合受體靶向腫瘤免疫檢查點(diǎn)這一思路進(jìn)行腫瘤治療的嘗試提供經(jīng)驗(yàn)。后續(xù)我們將采用各種方法和手段，對rPC與相應(yīng)配體分子 (PD-L1/PD-L2和C80/CD86) 的直接結(jié)合作用、rPC對T細(xì)胞的體外殺傷腫瘤細(xì)胞的作用、體內(nèi)抑瘤作用以及相應(yīng)的機(jī)制進(jìn)行驗(yàn)證和深入研究，為今后嘗試?yán)弥亟M融合蛋白靶向多個(gè)腫瘤免疫檢查點(diǎn)這一策略進(jìn)行腫瘤治療提供參考。