亮氨酸脫氫酶偶聯(lián)NADH再生體系合成L-2-氨基丁酸

張利坤，肖延銘，楊衛(wèi)華，華超，王云，李敬亞，楊套偉

1 長(zhǎng)興制藥股份有限公司 工業(yè)生物催化與轉(zhuǎn)化浙江省工程研究中心，浙江 長(zhǎng)興 313100

2 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122

L-2-氨基丁酸 (L-2-aminobutyric acid，L-ABA)是抑制人體神經(jīng)信息傳遞、促進(jìn)腦細(xì)胞代謝的一種非天然手性氨基酸，也是一種重要的手性醫(yī)藥中間體，通過對(duì)其末端羧基還原可用于制備抗結(jié)核藥物鹽酸乙胺丁醇[1]，也可通過酰胺化制備抗癲癇藥物左乙拉西坦及布瓦西坦[2-3]。目前，L-2-氨基丁酸的合成方法包括化學(xué)法和生物法?；瘜W(xué)法包括以氨化水解法、丁酮酸還原法、脫硫法等[4]，但化學(xué)合成反應(yīng)條件苛刻、易生成副產(chǎn)物和消旋產(chǎn)物、產(chǎn)物分離困難、立體選擇性差、工業(yè)生產(chǎn)成本高、對(duì)環(huán)境污染大。生物法包括微生物發(fā)酵法和酶催化法，發(fā)酵法易伴隨副產(chǎn)物生成，產(chǎn)物分離提取較困難。酶催化法具有反應(yīng)條件溫和、立體選擇性高、環(huán)境污染少等優(yōu)點(diǎn)。目前酶催化法制備L-2-氨基丁酸主要有兩種：一是對(duì)消旋DL-氨基丁酸進(jìn)行拆分[5-7]，理論轉(zhuǎn)化為50%；二是通過轉(zhuǎn)氨酶[8-10]或脫氫酶[11-14]以2-丁酮酸(2-ketobutyric acid，2-KBA) 為底物進(jìn)行不對(duì)稱合成，該方法常偶聯(lián)蘇氨酸脫氨酶 (Threonine deaminase，L-TD) 將廉價(jià)L-蘇氨酸 (L-Threonine，L-Thr) 轉(zhuǎn)化為2-丁酮酸，理論轉(zhuǎn)化可達(dá)100%。由于利用轉(zhuǎn)氨酶合成需要引入新氨基酸為氨基供體，反應(yīng)過程較為復(fù)雜，且易伴隨副產(chǎn)物生成，產(chǎn)率不理想，工業(yè)化較難。目前，比較常用的是用亮氨酸脫氫酶 (Leucine dehydrogenase，LDH)[15]以還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 (還原型輔酶Ⅰ，NADH) 作為輔酶，耦合輔酶再生體系用于L-2-氨基丁酸制備。

輔酶再生體系可選用以葡萄糖脫氫酶(Glucose dehydrogenase，GDH) 催化葡萄糖、甲酸脫氫酶 (Formate dehydrogenase，F(xiàn)DH) 催化甲酸銨[16]、醇脫氫酶(Alcohol dehydrogenase，ADH)催化異丙醇用于NADH的循環(huán)再生[17]。葡萄糖脫氫酶的NADH再生系統(tǒng)由于伴有大量葡萄糖酸鹽副產(chǎn)物的生成，產(chǎn)物分離純化較難，工業(yè)化難度大；基于甲酸脫氫酶的NADH再生系統(tǒng)所產(chǎn)生的副產(chǎn)物為CO2，對(duì)產(chǎn)物后分離無影響，盡管反應(yīng)結(jié)束后殘留部分甲酸鹽，但較前者而言產(chǎn)物分離較易；基于醇脫氫酶NADH再生系統(tǒng)的副產(chǎn)物為丙酮，較前兩者更易分離除去。本文將LDH基因分別與FDH基因和ADH基因通過質(zhì)粒pRSFDuet-1構(gòu)建pRSFDuet-ldh-fdh及pRSFDuet-ldh-adh，進(jìn)而利用重組菌串聯(lián)表達(dá)LDH-FDH及LDH-ADH，分別偶聯(lián)L-TD制備L-2氨基丁酸，并對(duì)上述兩種工藝進(jìn)行探究 (圖1)[11,17]，提供一條底物轉(zhuǎn)化率高、生產(chǎn)成本低且易于工業(yè)化的L-2-氨基丁酸生產(chǎn)工藝。

圖1 生物催化合成L-2-氨基丁酸[11,17]Fig.1 Enzyme catalysis L-2-aminobutyric acid[11,17].

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒與菌株

大腸桿菌E.coliDH5α、E.coliBL21(DE3)、質(zhì)粒pET28a(+)-ldh、pET28a(+)-adh、pET28a(+)-fdh、pRSFDuet-1與L-TD (GenBank登錄號(hào)APK04219.1) 粗酶液 (酶活力2 000 U/mL) 均由長(zhǎng)興制藥研發(fā)中心分子實(shí)驗(yàn)平臺(tái)構(gòu)建保存。

1.2 培養(yǎng)基

發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，NaCl 5 g/L。調(diào)節(jié)pH至7.2，121 ℃滅菌20 min。向滅菌后的培養(yǎng)基中添加事先配制成一定濃度過濾除菌的卡那霉素，使其終質(zhì)量濃度為50 μg/mL。

固體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂20 g/L，調(diào)節(jié)pH至7.2，121 ℃滅菌20 min。向滅菌后的培養(yǎng)基中添加事先配制成一定濃度過濾除菌的卡那霉素，使其終質(zhì)量濃度為50 μg/mL。

1.3 主要試劑

限制性內(nèi)切核酸酶、TaqDNA聚合酶、PrimeSTAR DNA聚合酶和T4 DNA連接酶購(gòu)于TaKaRa；基因組提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、DNA清潔試劑盒購(gòu)于生工生物工程 (上海) 股份有限公司；L-蘇氨酸、2-丁酮酸、甲酸銨、L-2-氨基丁酸購(gòu)于阿拉??；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 (輔酶Ⅰ，NAD+) 購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其他常規(guī)試劑均為市售分析純。

1.4 重組載體誘導(dǎo)表達(dá)

1.4.1 重組載體串聯(lián)構(gòu)建

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中亮氨酸脫氫酶基因ldh序列 (GenBank登錄號(hào)CP034551.1)、醇脫氫酶ADH序列 (GenBank登錄號(hào)KDE12735.1) 以及甲酸脫氫酶基因fdh序列 (GenBank登錄號(hào)AB091484.1) 設(shè)計(jì)引物，如表1所示。分別以質(zhì)粒pET28a(+)-ldh、pET28a(+)-adh、pET28a(+)-fdh為模板，使用表1中對(duì)應(yīng)的引物進(jìn)行PCR，分別擴(kuò)增得到ldh、adh、fdh基因片段，將上述三者DNA片段經(jīng)瓊脂糖凝膠回收后，用對(duì)應(yīng)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，隨后使用DNA清潔試劑盒進(jìn)行DNA純化獲得酶切產(chǎn)物。fdh或adh基因片段與經(jīng)同樣雙酶切處理的線性質(zhì)粒pRSFDuet-1混勻，用T4 DNA連接酶16 ℃過夜連接，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布到固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)18 h，通過菌落PCR將篩選陽性克隆子接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min培養(yǎng)8 h，使用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，對(duì)重組質(zhì)粒用NdeⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證。獲得的重組質(zhì)粒pRSFDuet-fdh或pRSFDuet-adh用NcoⅠ和NotⅠ進(jìn)行雙酶切，經(jīng)純化后與經(jīng)同樣雙酶切處理的ldh基因片段混勻，重復(fù)上述操作分別獲得重組質(zhì)粒pRSFDuet-ldh-fdh和pRSFDuetldh-adh，并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

表1 本實(shí)驗(yàn)用到的引物Table 1 Primers used in this experiment

1.4.2 重組載體串聯(lián)表達(dá)及粗酶液制備

將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE3) 感受態(tài)細(xì)胞中，分別獲得E.coliBL21(DE3)/pRSFDuetldh-fdh和E.coliBL21(DE3)/pRSFDuet-ldh-adh。將上述兩種重組菌接種至固體培養(yǎng)基斜面，37 ℃培養(yǎng)12 h，獲得斜面菌體；用無菌水洗下培養(yǎng)好的斜面菌體接入裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，37 ℃、150 r/min培養(yǎng)6–8 h后，IPTG誘導(dǎo)量0.3 mmol/L，25 ℃、150 r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)10–12 h。將發(fā)酵液離心 (8 000 r/min，10 min) 收集沉淀菌體。用100 mmol/L磷酸鉀緩沖液 (pH 7.0) 懸浮菌體，使菌體終質(zhì)量濃度為200 g/L，超聲破碎 (冰浴，功率400 W，工作5 s，間隔5 s)20 min，4 ℃、6 000 r/min離心25 min，保留上清分別得到LDH-FDH和LDH-ADH粗酶液。

1.5 酶活測(cè)定

本文通過串聯(lián)表達(dá)獲得LDH-FDH或LDH-ADH，若單獨(dú)測(cè)LDH、FDH、ADH酶活不具代表性，將串聯(lián)表達(dá)酶當(dāng)作整體，以L-2-氨基丁酸生成量為衡量標(biāo)準(zhǔn)更加直觀。

LDH-FDH酶活測(cè)定：反應(yīng)體系包括：100 mmol/L 2-丁酮酸，0.2 mmol/L NAD+，120 mmol/L甲酸銨，100 mmol/L NH3/NH4Cl 緩沖液 (pH 7.5)，1 mL LDH-FDH粗酶液，總體積為10 mL。35 ℃反應(yīng)10 min，強(qiáng)酸終止反應(yīng)，液相檢測(cè)L-2-氨基丁酸生成量。酶活定義：上述反應(yīng)條件下，1 min產(chǎn)生1 μmol L-2-氨基丁酸所需的酶量定義為1個(gè)酶活單位，即1 U。

LDH-ADH酶活測(cè)定：反應(yīng)體系包括：100 mmol/L 2-丁酮酸，0.2 mmol/L NAD+，120 mmol/L異丙醇，100 mmol/L 磷酸鉀緩沖液(pH 8.0)，1 mL LDH-ADH粗酶液，總體積為10 mL。35 ℃反應(yīng)10 min，強(qiáng)酸終止反應(yīng)，液相檢測(cè)L-2-氨基丁酸生成量。酶活定義：上述反應(yīng)條件下，1 min產(chǎn)生1 μmol L-2-氨基丁酸所需的酶量定義為1個(gè)酶活單位，即1 U。

1.6 催化反應(yīng)條件優(yōu)化

為了探索催化反應(yīng)的最佳反應(yīng)條件，提高L-2-氨基丁酸產(chǎn)量，分別對(duì)甲酸銨工藝 (LDH-FDH工藝) 和醇脫氫酶工藝 (LDH-ADH工藝) 條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.6.1 L-蘇氨酸一次性投加催化體系

LDH-FDH 500 mL催化體系為：40 g/L L-蘇氨酸，15 g/L甲酸銨，0.3 g/L NAD+，用氨水調(diào)節(jié)反應(yīng)pH至7.5，加入10% LDH-FDH粗酶液 (V/V)和7 500 U/L的L-TD酶液，機(jī)械攪拌。反應(yīng)條件：35 ℃、150 r/min，反應(yīng)過程中用40%甲酸維持pH 7.5左右，液相監(jiān)測(cè)反應(yīng)過程。

LDH-ADH 500 mL催化體系為：40 g/L L-蘇氨酸，4%異丙醇 (V/V)，0.3 g/L NAD+，磷酸鉀緩沖液 (100 mmol/L，pH 8.0)。用氨水調(diào)節(jié)反應(yīng)pH至8.0，加入10% LDH-ADH粗酶液 (V/V) 及7 500 U/L的L-TD酶液，機(jī)械攪拌。反應(yīng)條件：35 ℃、150 r/min，液相監(jiān)測(cè)反應(yīng)過程。

1.6.2 L-蘇氨酸分批投加催化體系

LDH-FDH 500 mL催化體系為：10 g/L L-蘇氨酸，50 g/L甲酸銨，0.3 g/L NAD+，用氨水調(diào)節(jié)反應(yīng)pH至7.5，加入10% LDH-FDH粗酶液 (V/V)和7 500 U/L的L-TD酶液，機(jī)械攪拌，后續(xù)每隔20–40 min補(bǔ)加10 g/L L-蘇氨酸，根據(jù)體系中2-丁酮酸殘留量調(diào)整L-蘇氨酸補(bǔ)加時(shí)間間隔，使體系2-丁酮酸濃度小于15 g/L。反應(yīng)條件：35 ℃、150 r/min，反應(yīng)過程中用40%甲酸維持pH 7.5左右，液相監(jiān)測(cè)反應(yīng)過程。

LDH-ADH 500 mL催化體系為：10 g/L L-蘇氨酸，0.8%異丙醇 (V/V)，0.3 g/L NAD+，用氨水調(diào)節(jié)反應(yīng)pH至8.0，加入10% LDH-ADH粗酶液(V/V) 及7 500 U/L的L-TD酶液，機(jī)械攪拌，后續(xù)每隔20–40 min補(bǔ)加10 g/L L-蘇氨酸及1.2倍摩爾量異丙醇，根據(jù)體系中2-丁酮酸殘留量調(diào)整L-蘇氨酸補(bǔ)加時(shí)間間隔，使體系2-丁酮酸濃度小于15 g/L。反應(yīng)條件：35 ℃、150 r/min，用氨水維持pH 8.0左右，液相監(jiān)測(cè)反應(yīng)過程。

1.7 分析方法

L-蘇氨酸、2-丁酮酸和L-2-氨基丁酸的含量均由HPLC測(cè)定，L-蘇氨酸、L-2-氨基丁酸分析條件：流動(dòng)相為0.05 mmol/L醋酸鈉溶液∶甲醇=7∶3，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)紫外波長(zhǎng)為334 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL，色譜柱為Agilent XDB-C8 (150 mm×4.6 mm)。

進(jìn)樣前樣品需衍生，衍生劑配制：稱取0.343 g鄰苯二甲醛和0.147 g N-乙酰半胱氨酸，置于50 mL容量瓶中，加5 mL無水乙醇，用0.1 mmol/L硼酸緩沖液 (pH 9.5) 定容。2-丁酮酸分析條件：流動(dòng)相為6 mmol/L硫酸溶液，流速為0.55 mL/min，檢測(cè)紫外波長(zhǎng)為202 nm，柱溫為35 ℃，進(jìn)樣量為10 μL，色譜柱為Aminex HPX-87H (300 mm×7.8 mm)。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組酶的表達(dá)及酶活檢測(cè)

重組質(zhì)粒pRSFDuet-ldh-fdh和pRSFDuet-ldhadh經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證無突變，分別轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE3)中按照1.4.2方法制備LDH-FDH和LDH-ADH粗酶液均在E.coli中實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá)，結(jié)果如圖2所示。SDS-PAGE圖中LDH、FDH和ADH的理論分子量分別為39.4、43.9和35.2 kDa，與氨基酸序列計(jì)算的值一致，表明重組菌能正常串聯(lián)表達(dá)LDH-FDH和LDH-ADH。按1.5方法測(cè)定酶活，LDH-FDH粗酶液酶活為72.8 U/mL，LDH-ADH粗酶液酶活為65.1 U/mL。

2.2 pH對(duì)催化反應(yīng)影響

圖2 重組酶的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of recombinant enzymes.1: control of E.coli BL21(DE3)/pRSFDuet-ldh-fdh or E.coli BL21(DE3)/pRSFDuet-ldh-adh which is not induced; 2: E.coli BL21(DE3)/pRSFDuet-ldh-adh after induction; 3: E.coli BL21(DE3)/pRSFDuet-ldh-fdh after induction; M: protein marker.

甲酸脫氫酶和醇脫氫酶工藝均同時(shí)涉及3種酶，因此有必要對(duì)催化反應(yīng)的最適pH進(jìn)行探索。但由于L-TD作為本企業(yè)已商品化的酶，在pH 7.0–8.5均表現(xiàn)為較高酶活，且該酶用量較少，工業(yè)化生產(chǎn)成本所占比重較低，因此本文主要考察pH對(duì)LDH-FDH和LDH-ADH酶活影響。不同pH下，分別測(cè)定LDH-FDH和LDH-ADH的酶活，以最高酶活為100%，結(jié)果如圖3所示。LDH-FDH最適pH為7.5，且在pH 7.0–8.0范圍內(nèi)相對(duì)酶活均大于90%；LDH-ADH最適pH為8.5，且在pH 7.5–8.5范圍內(nèi)相對(duì)酶活均大于90%。

2.3 溫度對(duì)催化反應(yīng)的影響

L-TD在30–40 ℃均表現(xiàn)出較高酶活，因此本文主要考察溫度對(duì)LDH-FDH和LDH-ADH酶活影響。由于2-丁酮酸對(duì)溫度較敏感、不穩(wěn)定，因此為了確定反應(yīng)最佳溫度，同時(shí)檢測(cè)酶活測(cè)量體系中2-丁酮酸的濃度。不同溫度下，分別測(cè)定LDH-FDH的酶活及體系中L-氨基丁酸與2-丁酮酸含量，結(jié)果如圖4A、B所示。LDH-FDH最適溫度為35 ℃，此時(shí)反應(yīng)液中L-2-氨基丁酸濃度為72.8 mmol/L，2-丁酮酸濃度為25.1 mmol/L，物料基本守恒，40–45 ℃時(shí)，2-丁酮酸剩余量小于理論剩余量，物料表現(xiàn)不平衡，因此選用35 ℃作為L(zhǎng)DH-FDH最適催化溫度。不同溫度下LDH-ADH的酶活及體系中L-2-氨基丁酸與2-丁酮酸含量，結(jié)果如圖4C、D所示。LDH-ADH最適溫度為40 ℃，此時(shí)反應(yīng)液中L-2-氨基丁酸濃度為65.1 mmol/L，2-丁酮酸濃度為21.9 mmol/L，盡管該溫度下L-2-氨基丁酸濃度達(dá)最高，但2-丁酮酸濃度為21.9 mmol/L，約為2-丁酮酸理論剩余量的60%，表明該溫度會(huì)導(dǎo)致2-丁酮酸變質(zhì)或形成其他副產(chǎn)物，因此選用35 ℃作為L(zhǎng)DH-ADH最適催化溫度。

圖3 pH對(duì)催化反應(yīng)影響Fig.3 Effect of pH on the reaction.

圖4 溫度對(duì)催化反應(yīng)的影響Fig.4 Effect of pH on the reaction.(A) Effect of temperature on LDH-FDH activity.(B) L-ABA and 2-KBA concentration in different temperature reaction systems of LDH-FDH.(C) Effect of temperature on LDH-ADH activity.(D) L-ABA and 2-KBA concentration in different temperature reaction systems of LDH-ADH.

2.4 L-蘇氨酸濃度對(duì)催化反應(yīng)影響

按照1.6.1方法，保持其他條件不變，添加不同濃度L-蘇氨酸，反應(yīng)24 h檢測(cè)L-2-氨基丁酸生成量及2-丁酮酸殘留量，考察L-蘇氨酸濃度對(duì)催化反應(yīng)影響。LDH-FDH催化體系結(jié)果如圖5A、B所示，隨著L-蘇氨酸濃度增加，L-2-氨基丁酸產(chǎn)率逐漸下降，2-丁酮酸殘留量逐步上升。當(dāng)L-蘇氨酸濃度在40–60 g/L范圍時(shí)，2-丁酮酸殘留量較少，隨著底物濃度增加，L-2-氨基丁酸生成量呈線性增長(zhǎng)，產(chǎn)率均大于95%。當(dāng)L-蘇氨酸濃度增加至80–120 g/L，2-丁酮酸積累嚴(yán)重，而L-2-氨基丁酸生成量卻未有明顯增長(zhǎng)，表明體系中積累2-丁酮酸會(huì)抑制LDH-FDH的活性。LDH-ADH催化體系結(jié)果如圖5C、D所示，與LDH-FDH結(jié)果相似。以上兩種工藝制備L-2-氨基丁酸最高濃度均小于60 g/L，且NAD+利用率較低。

2.5 2-丁酮酸濃度對(duì)催化反應(yīng)影響

按照1.6.1方法，維持其他條件不變，將底物L(fēng)-蘇氨酸更換為2-丁酮酸，反應(yīng)1 h，考察不同濃度2-丁酮酸對(duì)LDH-FDH及LDH-ADH催化反應(yīng)影響，結(jié)果如圖6所示。當(dāng)2-丁酮酸濃度在5–15 g/L范圍時(shí)，LDH-FDH及LDH-ADH轉(zhuǎn)化體系中L-2-氨基丁酸產(chǎn)率均大于99%，且L-2-氨基丁酸濃度隨著底物濃度增加線性上升，當(dāng)2-丁酮酸濃度為20 g/L，產(chǎn)物濃度達(dá)到最大，后隨著2-丁酮酸濃度增加L-2-氨基丁酸產(chǎn)率和轉(zhuǎn)化率均呈下降趨勢(shì)。表明當(dāng)2-丁酮酸濃度大于20 g/L時(shí)，對(duì)LDH-FDH及LDH-ADH開始出現(xiàn)抑制作用，因此為了盡可能降低2-丁酮酸抑制作用，應(yīng)控制反應(yīng)體系中2-丁酮酸濃度小于15 g/L。

圖5 L-蘇氨酸濃度對(duì)催化反應(yīng)影響Fig.5 Effect of the concentration of L-Thr on the reaction.(A) Effect of the concentration of L-Thr on the yield of L-ABA in LDH-FDH process.(B) The concentration of L-ABA and 2-KBA with different concentrations of L-threonine after 24 h reaction in LDH-FDH process.(C) Effect of the concentration of L-Thr on the yield of L-ABA in LDH-ADH process.(D) The concentration of L-ABA and 2-KBA with different concentrations of L-threonine after 24 h reaction in LDH-ADH process.

2.6 分批補(bǔ)加L-蘇氨酸催化工藝

為了提高上述兩種工藝產(chǎn)物濃度及NAD+利用率，本文嘗試選用分批補(bǔ)加L-蘇氨酸，使生成的2-丁酮酸及時(shí)轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-2-氨基丁酸，解除2-丁酮酸對(duì)酶活性的抑制。按照1.6.2方法，LDH-FDH工藝催化反應(yīng)進(jìn)程如圖7A所示。整個(gè)反應(yīng)過程2-丁酮酸濃度均控制在12 g/L以下，反應(yīng)28 h基本結(jié)束，此時(shí)L-2氨基丁酸濃度達(dá)161.8 g/L，產(chǎn)率大于97%。按照1.6.2方法，LDH-ADH工藝催化反應(yīng)進(jìn)程如圖7B所示。反應(yīng)8 h 2-丁酮酸開始有積累趨勢(shì)，10 h已停止補(bǔ)加L-蘇氨酸，反應(yīng)10–18 h L-2-氨基丁酸濃度幾乎沒有增長(zhǎng)，而L-蘇氨酸濃度一直維持較低水平，表明L-TD活性沒有受到抑制；2-丁酮酸消耗速率較慢，表明LDH-ADH活性受到抑制，但整個(gè)進(jìn)程2-丁酮酸未大量積累，排除2-丁酮酸抑制作用，可能是異丙醇生成丙酮抑制LDH-ADH活性。該工藝反應(yīng)18 h，L-2氨基丁酸濃度達(dá)75.7 g/L，產(chǎn)率79%，轉(zhuǎn)化體系仍殘留17.3 g/L 2-丁酮酸。

2.7 LDH-ADH工藝進(jìn)一步優(yōu)化

添加不同濃度丙酮，按1.5方法檢測(cè)LDHADH酶活，結(jié)果如表2所示。當(dāng)丙酮濃度在1%–3%范圍時(shí)，對(duì)LDH-ADH活性抑制作用較小，當(dāng)丙酮濃度大于4%，開始出現(xiàn)明顯抑制作用。由圖6B可知反應(yīng)4 h 2-丁酮酸未開始積累，表明LDH-ADH活性未受到抑制，此時(shí)體系中L-2-氨基丁酸濃度為46.5 g/L，丙酮含量約3%。為了解除丙酮抑制作用，仍按照1.6.2的催化工藝進(jìn)行，每生成約40 g/L的L-2-氨基丁酸，對(duì)反應(yīng)體系抽真空，35 ℃維持1 h以去除部分丙酮后，需繼續(xù)補(bǔ)加L-蘇氨酸，反應(yīng)進(jìn)程如圖8所示。反應(yīng)24 h基本結(jié)束，此時(shí)L-2氨基丁酸濃度達(dá)119.6 g/L，產(chǎn)率大于98%。

圖6 2-丁酮酸濃度對(duì)催化反應(yīng)影響Fig.6 Effect of the concentration of 2-KBA on the reaction.(A) Effect of the concentration of 2-KBA on the yield of L-ABA in two processes.(B) The concentration of L-ABA with different concentrations of 2-KBA after 1 h reaction in two process.

圖7 兩種工藝催化反應(yīng)進(jìn)程Fig.7 Reaction process of two processes.The concentration of L-threonine, 2-ketobutyric acid and L-2-aminobutyric acid was determined by HPLC at different time points.(A) LDH-FDH process.(B) LDH-ADH process.

3 討論

本文將ldh與fdh或adh進(jìn)行串聯(lián)共表達(dá)獲得LDH-FDH和LDH-ADH，并結(jié)合L-TD對(duì)LDHFDH工藝和LDH-ADH工藝進(jìn)行對(duì)比優(yōu)化，合成L-2-氨基丁酸。LDH-FDH工藝的最適反應(yīng)pH為7.5，最適反應(yīng)溫度為35 ℃，通過加入50 g/L甲酸銨、0.3 g/L NAD+、10% LDH-FDH粗酶液 (V/V)和7 500 U/L的L-TD酶液，分批補(bǔ)加L-蘇氨酸，控制2-丁酮酸濃度小于15 g/L，反應(yīng)28 h，實(shí)現(xiàn)了L-2-氨基丁酸的產(chǎn)量為161.8 g/L，產(chǎn)率97%。LDH-ADH工藝的最適pH為8.0，最適反應(yīng)溫度為35 ℃，通過加入0.3 g/L NAD+、10% LDH-ADH粗酶液 (V/V) 及7 500 U/L的L-TD酶液，分批補(bǔ)加L-蘇氨酸及1.2倍摩爾量異丙醇，控制2-丁酮酸濃度小于15 g/L，且每生成約40 g/L的L-2-氨基丁酸，抽真空去除丙酮，反應(yīng)24 h，實(shí)現(xiàn)了L-2-氨基丁酸的產(chǎn)量為119.6 g/L，產(chǎn)率98%。

表2 丙酮濃度對(duì)LDH-ADH酶活影響Table 2 Effect of acetone concentration on LDH-ADH activity

圖8 優(yōu)化后的LDH-ADH工藝催化反應(yīng)進(jìn)程Fig.8 Reaction process of the reaction by optimizing the process of LDH-ADH.

Tao等[11]利用甲酸脫氫酶的NADH再生系統(tǒng)工藝，在30 L反應(yīng)體系中一次性添加L-蘇氨酸，底物濃度達(dá)到1 mol/L，產(chǎn)物得率97.3%。Wang等[16]通過提高L-蘇氨酸脫氨酶的熱穩(wěn)定性以提高L-2-氨基丁酸產(chǎn)量和NADH循環(huán)使用次數(shù)，產(chǎn)物濃度達(dá)0.993 mol/L。目前相較于甲酸脫氫酶的NADH再生系統(tǒng)工藝的報(bào)道，本研究考察了不同2-丁酮酸濃度對(duì)L-2-氨基丁酸轉(zhuǎn)化體系中酶活力的影響，采用分批補(bǔ)加L-蘇氨酸方式降低了2-丁酮酸對(duì)轉(zhuǎn)化體系中酶活力抑制作用，促使L-2-氨基丁酸產(chǎn)量進(jìn)一步提高，產(chǎn)物濃度可達(dá)1.57 mol/L，產(chǎn)物得率97%，工業(yè)化潛力極大。目前利用基于醇脫氫酶NADH再生系統(tǒng)工藝生產(chǎn)L-2-氨基丁酸報(bào)道較少，且產(chǎn)量普遍較低，難以工業(yè)化。劉珊等[17]通過優(yōu)化酶催化條件，采用異丙醇為底物實(shí)現(xiàn)NADH再生，產(chǎn)物濃度達(dá)43 g/L，產(chǎn)物得率99%。本研究從降低2-丁酮酸與丙酮對(duì)酶活力抑制作用著手，采用分批補(bǔ)加L-蘇氨酸及反應(yīng)過程中抽真空去除丙酮的方式，使L-2-氨基丁酸產(chǎn)量顯著提高，產(chǎn)物濃度達(dá)1.16 mol/L，產(chǎn)物得率98%，使得該工藝表現(xiàn)出一定的工業(yè)化潛力。

筆者對(duì)上述兩種工藝分別進(jìn)行3 000 L中試放大，均獲得良好效果。LDH-FDH工藝獲得L-2-氨基丁酸的產(chǎn)量高，NAD+利用率高，但轉(zhuǎn)化結(jié)束后，反應(yīng)體系中會(huì)殘留約80 g/L甲酸鹽，產(chǎn)物分離純化需進(jìn)行脫鹽處理，進(jìn)而再次回收利用甲酸鹽。小試轉(zhuǎn)化反應(yīng)過程中產(chǎn)生的CO2對(duì)反應(yīng)進(jìn)程幾乎無影響，中試放大過程中需對(duì)反應(yīng)體系通空氣以去除產(chǎn)生的CO2，若CO2積累濃度過高會(huì)抑制L-TD活性。LDH-ADH工藝獲得L-2-氨基丁酸的產(chǎn)量低于LDH-FDH工藝，且NAD+利用率低，設(shè)備要求高，反應(yīng)過程中需抽真空除去丙酮，但產(chǎn)物分離純化無需除鹽，較為簡(jiǎn)單。本文為生物催化制備L-2-氨基丁酸工業(yè)化生產(chǎn)提供了直接的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持，從生產(chǎn)成本、設(shè)備要求等方面考慮，筆者認(rèn)為L(zhǎng)DH-FDH工藝更適合工業(yè)化。