靶向GPC3的第四代嵌合抗原受體T細(xì)胞 (分泌IL-7和CCL19) 的構(gòu)建以及功能

黃婉莉，劉宇，胡耀狄，高基民

溫州醫(yī)科大學(xué) 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 溫州 325035

肝細(xì)胞癌 (Hepatocelluar carcinoma，HCC)是一種侵略性癌癥，也是全球范圍內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，占原發(fā)性肝癌約90%[1]。目前手術(shù)切除、肝移植和肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù) (Transarterial chemoembolization，TACE) 是治療早期HCC患者的主要策略[2-3]，但是大多數(shù)肝細(xì)胞癌患者確診時(shí)已是晚期，這些治療并沒(méi)有產(chǎn)生顯著的效果。索拉替尼、雷戈非尼、樂(lè)伐替尼等是美國(guó)食品藥品監(jiān)管局 (Food and drug administration，F(xiàn)DA) 批準(zhǔn)的治療晚期HCC的一線或二線藥物，其臨床療效存在一定的局限性[4-7]。因此迫切需要開(kāi)發(fā)新的策略治療晚期HCC患者。

嵌合抗原受體 (Chimeric antigen receptor，CAR) 修飾的T細(xì)胞免疫療法已被證實(shí)是一種非常有希望的腫瘤治療策略[8]，其可以特異性識(shí)別腫瘤相關(guān)抗原，并以非主要組織相容復(fù)合物 (Major histocompatibility complex，MHC) 限制的方式消除腫瘤細(xì)胞[9-10]。CAR主要由識(shí)別并結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面抗原的胞外單鏈抗體可變片段 (Single chain antibody fragment，scFv)、跨膜段和胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)/激活域組成。第二代/第三代CAR-T細(xì)胞在第一代的基礎(chǔ)之上加入一個(gè)/兩個(gè)共刺激分子如CD28、4-1BB等從而增強(qiáng)了CAR-T細(xì)胞活化、增殖和生存能力。第四代CAR-T (又被稱為“TRUCK”) 則在傳統(tǒng)的CAR載體上增加了編碼細(xì)胞因子的基因，其可以分泌IL-12、IL-15等細(xì)胞因子，從而改善CAR-T細(xì)胞的擴(kuò)增和持久性，提升其對(duì)于免疫抑制腫瘤微環(huán)境的抵抗力[11]。

磷脂酰肌醇蛋白聚糖3 (Glypican-3，GPC3)是硫酸乙酰肝素蛋白聚糖Glypican家族成員的一種，其通過(guò)糖基磷酰肌醇 (Glycosylphosphatidylinositol，GPI) 錨定在細(xì)胞表面。GPC3核心蛋白由580個(gè)氨基酸組成，大小為70 kDa。其已被證明在HCC中高表達(dá)，而在大多數(shù)健康的成年器官中無(wú)法檢測(cè)到[12-15]，GPC3對(duì)于HCC來(lái)說(shuō)是一種有意義的診斷、治療和預(yù)后評(píng)估的生物標(biāo)志物。因此它可以作為有希望的腫瘤相關(guān)抗原，用于構(gòu)建靶向HCC的CAR-T細(xì)胞。事實(shí)上，已有研究者構(gòu)建了靶向GPC3的第二/三代CAR-T細(xì)胞，并在動(dòng)物體內(nèi)驗(yàn)證了其對(duì)于細(xì)胞株或患者來(lái)源的GPC3陽(yáng)性肝細(xì)胞癌移植瘤的治療效果[16-17]。

雖然CAR-T療法在治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤中取得了重大突破，比如2017年靶向CD19的兩種CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品Kymriah和Yescarta被FDA分別批準(zhǔn)為治療復(fù)發(fā)/難治性急性B淋巴細(xì)胞白血病和難治性大B細(xì)胞淋巴瘤的首選治療方式[18-19]，但是目前CAR-T細(xì)胞對(duì)實(shí)體瘤的療效依然有限。原因是多方面的：實(shí)體瘤表面往往表達(dá)多種不同的抗原，因此缺乏腫瘤特異性靶標(biāo)；腫瘤免疫微環(huán)境的存在可以抑制CAR-T細(xì)胞活性；CAR-T細(xì)胞體內(nèi)的存活時(shí)間短等。

本研究中我們構(gòu)建了一種靶向GPC3的第四代CAR-T細(xì)胞 (分泌IL-7和CCL19)。其中IL-7是T細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)節(jié)因子，可以促進(jìn)T細(xì)胞擴(kuò)增，對(duì)維持體內(nèi)T細(xì)胞存活及持久性具有重要作用[20-21]。CCL19屬于CC類趨化因子，可以募集T細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞 (Dendritic cell，DC) 浸潤(rùn)到腫瘤發(fā)生部位[22-23]。本研究通過(guò)體外比較第四代GPC3 CAR-T細(xì)胞 (GPC3-BBZ-7×19) 與第二代GPC3 CAR-T細(xì)胞 (GPC3-BBZ) 在增殖、遷移、亞型和殺傷等功能方面的差異，以及體內(nèi)觀察GPC3-BBZ-7×19 CAR-T細(xì)胞對(duì)免疫缺陷小鼠體內(nèi)HCC移植瘤的作用效果，期望為GPC3陽(yáng)性的肝細(xì)胞癌提供新的治療策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

慢病毒載體pLenti-T2A-Luc-GFP、包裝質(zhì)粒pLP1、pLP2和pMD2G由本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建并保存。靶向GPC3的單克隆抗體可變區(qū) (4A11) 從專利[24]獲取。IL-7和CCL19基因片段由蘇州金唯智科技有限公司合成。人腎上皮細(xì)胞系HEK293T和人急性T細(xì)胞白血病細(xì)胞系Jurkat購(gòu)于美國(guó)菌種保藏中心 (American type culture collection，ATCC)。人肝癌細(xì)胞系Huh7、Hep3B和HepG2由中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)提供。無(wú)特定病原體 (Specific pathogen-free，SPF) 級(jí)雄性、4–6周齡的 NCG(NOD/ShiLtJGpt-Prkdcem26Cd52 Il2rgem26Cd22/Gpt)小鼠購(gòu)自南京集萃藥康生物科技有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK (蘇) 2019-0009。小鼠飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室，動(dòng)物飼養(yǎng)許可證號(hào)為SYXK (浙) 2015-0009。本研究中動(dòng)物實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照溫州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)制定的動(dòng)物倫理?xiàng)l例進(jìn)行相關(guān)操作。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

TransStbl3感受態(tài)購(gòu)于上海桑尼生物技術(shù)公司；DNA膠回收試劑盒購(gòu)于美國(guó)Axygen公司；限制性內(nèi)切酶購(gòu)于美國(guó)New England BioLabs公司；無(wú)縫克隆試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技公司；質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司；PE抗人CD3抗體、APC抗人CD45RA抗體、FITC抗人CD45RO抗體、PB抗人CD62L抗體、APC抗人IFN-γ抗體均購(gòu)自美國(guó)BioLegend公司；鼠抗人GPC3單克隆抗體和FITC標(biāo)記的驢抗鼠IgG(H+L) 抗體、PE標(biāo)記的鏈親和素 (PE-SA) 購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher 公司；生物素標(biāo)記的F(ab′)2片段化羊抗人IgG購(gòu)于美國(guó)eBioscience公司；FITC標(biāo)記的人GPC3蛋白購(gòu)自美國(guó)AcroBiosystems公司；IL-7和GM-CSF細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；CCL19細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒購(gòu)自欣博盛生物科技有限公司；重組人IL-2購(gòu)于美國(guó)Prprotech公司。D-(-)-熒光素購(gòu)自上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司；聚凝胺 (polybrene)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；聚乙酰亞胺 (Polyetherimide，PEI) 購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。細(xì)胞培養(yǎng)基以及添加劑均購(gòu)于美國(guó)Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1 慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及其包裝

GPC3 CAR由靶向GPC3的4A11單克隆抗體的單鏈可變區(qū)與人CD8α、4-1BB和CD3ζ組成。設(shè)計(jì)引物 (表1) 對(duì)GPC3 CAR片段和人源IL-7-CCL19片段進(jìn)行PCR，再通過(guò)重疊延伸PCR將IL-7-CCL19片段與GPC3 CAR片段連接 (3個(gè)片段中間以2A自剪切肽隔開(kāi))，以MluⅠ和EcoRⅠ限制性酶切位點(diǎn)酶切慢病毒表達(dá)載體pLenti-T2ALuc-GFP，通過(guò)無(wú)縫克隆將GPC3 CAR片段和GPC3 CAR-IL-7-CCL19片段分別插入載體中構(gòu)建第二代CAR慢病毒載體GPC3-BBZ和第四代CAR慢病毒載體GPC3-BBZ-7×19。

質(zhì)粒通過(guò)第三代慢病毒包裝系統(tǒng)進(jìn)行病毒包裝：準(zhǔn)備EP管，并加入適量的PBS，在第1管PBS中分別加入一定量的目的質(zhì)粒GPC3-BBZ/GPC3-BBZ-7×19與包裝質(zhì)粒pLP1、pLP2、pMD2G；在第2管PBS中加入PEI，室溫孵育5 min；將第2管混合物加入第1管中，輕柔混勻并室溫孵育20 min，形成質(zhì)粒-PEI復(fù)合物；將該復(fù)合物加入細(xì)胞密度為70%–80%的293T細(xì)胞培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后收集上清，用0.45 μm濾膜過(guò)濾病毒原液并超速離心獲得病毒濃縮液。

1.2.2 健康人外周血CAR-T細(xì)胞的制備及鑒定

利用外周血淋巴細(xì)胞分離液Ficoll提取健康人外周血中單個(gè)核細(xì)胞 (Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，按照T細(xì)胞與磁珠數(shù)量之比為1︰1加入α-CD3/α-CD28抗體包被的磁珠分離人T細(xì)胞，并置于含10%血清和100 μg/mL IL-2的AIM-V培養(yǎng)基中培養(yǎng)。24 h后，計(jì)數(shù)活化的人CD3+T細(xì)胞，于每個(gè)孔加入0.1×106個(gè)T細(xì)胞和感染復(fù)數(shù) (Multiplicity of infection，MOI)=10的病毒濃縮液 (GPC3-BBZ或GPC3-BBZ-7×19)，培養(yǎng)基補(bǔ)齊至200 μL，并于每孔加入聚凝胺(1︰2 000)，1 200 r/min離心90 min，然后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，4 h后換液。離心換液后繼續(xù)培養(yǎng)，每隔2–3 d補(bǔ)充培養(yǎng)基或者傳代。制備的CAR-T細(xì)胞分別命名為GPC3-BBZ CAR-T細(xì)胞和GPC3-BBZ-7×19 CAR-T細(xì)胞，將未經(jīng)病毒感染的人T細(xì)胞 (non-CAR-T) 作為陰性對(duì)照。

取轉(zhuǎn)導(dǎo)5 d后的T細(xì)胞，用FACS (由50 mL PBS加1 mL胎牛血清配制而成) 洗滌細(xì)胞，離心棄上清液；加入100 μL FITC標(biāo)記的人GPC3蛋白 (工作濃度為3 μg/mL) 重懸細(xì)胞，4 ℃孵育60 min，然后用FACS洗滌3次，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)T細(xì)胞表面CAR的表達(dá)情況。

1.2.3 熒光素酶生物發(fā)光法檢測(cè)CAR-T細(xì)胞的體外殺傷活性

使用鼠抗人GPC3單克隆抗體和FITC標(biāo)記的驢抗鼠IgG (H＋L) 抗體 (二抗) 對(duì)實(shí)驗(yàn)室中4種肝癌細(xì)胞株Sk-hep1、HepG2、Huh7和Hep3B進(jìn)行染色。用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其GPC3表達(dá)水平。將pLenti-T2A-Luc-GFP慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)上述GPC3表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞，然后通過(guò)流式分選GFP陽(yáng)性細(xì)胞，構(gòu)建長(zhǎng)久、穩(wěn)定表達(dá)GFP和熒光素酶(Luciferase)，且表達(dá)率在90%以上的細(xì)胞株來(lái)用于后續(xù)的殺傷實(shí)驗(yàn)。在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入0.01×106個(gè)靶細(xì)胞使其貼壁，并按效靶比2︰1、5︰1、10︰1和20︰1加入效應(yīng)T細(xì)胞，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。另外再設(shè)置只加靶細(xì)胞與培養(yǎng)基的陰性對(duì)照孔和用ddH2O重懸靶細(xì)胞的陽(yáng)性對(duì)照孔，每組3個(gè)復(fù)孔。靶細(xì)胞為人肝癌細(xì)胞HepG2、Huh7和Hep3B，效應(yīng)細(xì)胞為non-CAR-T、GPC3-BBZ CAR-T細(xì)胞和GPC3-BBZ-7×19 CAR-T細(xì)胞，殺傷所用培養(yǎng)基為AIM-V T細(xì)胞完全培養(yǎng)基。鋪板結(jié)束后，將96孔板置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后在上清中加入熒光素酶的底物D-(-)-熒光素，避光孵育10 min, 使用酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光值，計(jì)算各組CAR-T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的體外裂解率。裂解率=(Max-V)/(Max-Min)×100%。(Max：只加靶細(xì)胞與培養(yǎng)基孔的熒光值；Min：ddH2O重懸靶細(xì)胞孔的熒光值；V：效靶細(xì)胞共孵育孔測(cè)得的熒光值)

表1 質(zhì)粒構(gòu)建所需引物Table 1 Primer sequence for plasmid construction

1.2.4 ELISA法檢測(cè)CAR-T細(xì)胞分泌的IL-7和CCL19細(xì)胞因子水平

取培養(yǎng)至5 d和10 d的CAR-T細(xì)胞培養(yǎng)上清，300 r/min離心10 min后去除沉淀物，根據(jù)細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒要求，采用雙抗體夾心法檢測(cè)CAR-T細(xì)胞分泌的人IL-7 (Human IL-7) 和CCL19 (Human CCL19) 細(xì)胞因子水平，底物顯色后，使用酶標(biāo)儀在450 nm讀取OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣品中相應(yīng)的細(xì)胞因子濃度。

1.2.5 CAR-T細(xì)胞活化水平檢測(cè)

將靶細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞按1︰1的效靶比共孵育24 h，取上清300 r/min離心10 min后去除沉淀物，采用雙抗體夾心法檢測(cè)CAR-T細(xì)胞分泌人GM-CSF的水平。底物顯色后，使用酶標(biāo)儀在450 nm讀取OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣品中相應(yīng)的細(xì)胞因子濃度。

采用同樣的方法將靶細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞進(jìn)行共孵育，并在上清中加入高爾基體阻斷劑 (美國(guó)BD公司)，6 h以后取T細(xì)胞進(jìn)行染色：先洗滌T細(xì)胞，再用PE標(biāo)記的抗人CD3抗體染色，方法同上，之后按照胞內(nèi)染色試劑盒的操作流程先固定和裂解T細(xì)胞，再加入配制的APC抗人IFN-γ抗體重懸T細(xì)胞，室溫孵育40 min，染色完成后用FACS洗滌細(xì)胞并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)T細(xì)胞的IFN-γ分泌水平。

1.2.6 計(jì)數(shù)檢測(cè)CAR-T細(xì)胞增殖水平

將按相同MOI轉(zhuǎn)導(dǎo)病毒的GPC3-BBZ CAR-T細(xì)胞和GPC3-BBZ-7×19 CAR-T細(xì)胞鋪在96孔板中，0.1×106個(gè)/孔，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，并于3、5、7、9 d計(jì)數(shù)細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量，繪制生長(zhǎng)曲線比較GPC3-BBZ CAR-T細(xì)胞和GPC3-BBZ-7×19 CAR-T細(xì)胞生長(zhǎng)速度。

1.2.7 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CAR-T細(xì)胞趨化功能

取培養(yǎng)至第5天的T細(xì)胞上清備用，取non-CAR-T細(xì)胞置于DynaMagTM-5磁力架上脫磁，1 500 r/min離心5 min，棄上清，將細(xì)胞用BufferⅠ (50 mL PBS中加入250 μL血清配制而成)洗滌后重懸，并計(jì)數(shù)，用5 μmol/L CFSE重懸(1×106個(gè)細(xì)胞加100 μL CFSE)，避光孵育10 min，然后用T細(xì)胞完全培養(yǎng)基洗滌3次。將transwell小室放到24孔板中，于下室中加入400 μL不同的CAR-T細(xì)胞培養(yǎng)上清，上室中加入CFSE標(biāo)記的T細(xì)胞，0.2×106個(gè)/100 μL，然后將24孔板置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2 h后取出24孔板，熒光顯微鏡下拍照，并計(jì)數(shù)遷移到下室的T細(xì)胞數(shù)量。

1.2.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CAR-T細(xì)胞亞型分布

取培養(yǎng)第5天的CAR-T細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其亞型分布情況，操作方法同上，使用抗體為APC抗人CD45RA抗體、FITC抗人CD45RO抗體、PB抗人CD62L抗體、生物素標(biāo)記的F(ab′)2片段化羊抗人IgG和PE標(biāo)記的鏈親和素(PE-SA)。

1.2.9 小鼠肝細(xì)胞癌腹腔移植瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CAR-T細(xì)胞治療效果

收集處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的Huh7-Luc-GFP細(xì)胞，接種于雄性NCG小鼠的腹腔，每只小鼠接種1×106個(gè)Huh7-Luc-GFP細(xì)胞。當(dāng)腫瘤生長(zhǎng)至第5天時(shí)，荷瘤小鼠被隨機(jī)分成2組，3只/組。各組小鼠通過(guò)尾靜脈分別注射相應(yīng)數(shù)量的病毒感染9 d的CAR-T細(xì)胞：8×106個(gè)non-CAR-T細(xì)胞/只小鼠 (對(duì)照組)；8×106個(gè)GPC3-BBZ-7×19 CAR-T細(xì)胞/只小鼠 (實(shí)驗(yàn)組)。每隔5–7 d通過(guò)生物發(fā)光活體成像儀檢測(cè)小鼠體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)情況和小鼠體重；CAR-T細(xì)胞注射后第28天采集小鼠外周血，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠外周血CD3+T細(xì)胞和CAR-T細(xì)胞的生存情況。

1.2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 6軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間比較采用雙因素或單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 成功構(gòu)建慢病毒載體GPC3-BBZ和GPC3-BBZ-7×19

如圖1所示，GPC3-BBZ載體的抗原識(shí)別片段來(lái)自針對(duì)GPC3的抗體4A11的單鏈可變區(qū)，其后連接人源的CD8α (鉸鏈區(qū)和跨膜段)、4-1BB(共刺激分子) 以及CD3ζ (T細(xì)胞活化基序)。GPC3-BBZ-7×19在GPC3-BBZ的基礎(chǔ)上加上人源IL-7和CCL19分子，中間用2A自剪切肽隔開(kāi)。以上2個(gè)慢病毒載體構(gòu)建完成后，經(jīng)過(guò)AflⅡ限制性內(nèi)切酶鑒定以及上海桑尼生物科技有限公司測(cè)序，并與圖譜比對(duì)，結(jié)果與預(yù)期一致，說(shuō)明構(gòu)建成功。

2.2 成功制備GPC3-BBZ CAR-T細(xì)胞和GPC3-BBZ-7×19 CAR-T細(xì)胞

成功構(gòu)建慢病毒載體質(zhì)粒后，將其與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行慢病毒包裝，獲得編碼GPC3-BBZ和GPC3-BBZ-7×19的慢病毒；然后以相同的感染復(fù)數(shù)轉(zhuǎn)導(dǎo)健康人外周血提取的CD3+T細(xì)胞，制備GPC3-BBZ CAR-T細(xì)胞和GPC3-BBZ-7×19 CAR-T細(xì)胞。培養(yǎng)第5天用FITC直接標(biāo)記的商品化GPC3蛋白來(lái)檢測(cè)T細(xì)胞表面CAR的表達(dá)情況，結(jié)果顯示CAR成功表達(dá)于GPC3-BBZ CAR-T細(xì)胞和GPC3-BBZ-7×19 CAR-T細(xì)胞表面，且兩者之間無(wú)明顯差異 (P＞0.05，圖2A–B)，說(shuō)明兩種CAR病毒對(duì)T細(xì)胞的感染能力相當(dāng)。

2.3 GPC3-BBZ-7×19 CAR-T細(xì)胞成功分泌IL-7和CCL19并在體外表現(xiàn)出增殖、趨化、亞型優(yōu)勢(shì)

使用不添加IL-7的AIM-V培養(yǎng)基對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，并分別取第5天和第10天的T細(xì)胞培養(yǎng)上清，用ELISA法檢測(cè)上清中IL-7和CCL19的濃度 (圖3A)。結(jié)果表明，non-CAR-T和GPC3-BBZ CAR-T細(xì)胞的培養(yǎng)上清中沒(méi)有檢測(cè)到這兩種細(xì)胞因子，而GPC3-BBZ-7×19 CAR-T細(xì)胞的培養(yǎng)上清均檢測(cè)到IL-7和CCL19的分泌，并且隨著培養(yǎng)天數(shù)增加，其濃度也有所上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.000 1)。因此可以進(jìn)行下一步相關(guān)的功能驗(yàn)證。

為比較兩種CAR-T細(xì)胞的增殖能力，我們將轉(zhuǎn)導(dǎo)GPC3-BBZ CAR或GPC3-BBZ-7×19 CAR病毒的T細(xì)胞以相同的數(shù)量鋪在96孔板中，然后隔天對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。結(jié)果 (圖3B) 表明，從第7天開(kāi)始，GPC3-BBZ-7×19 CAR-T細(xì)胞的數(shù)量明顯多于GPC3-BBZ CAR-T細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。培養(yǎng)第7天鏡下可見(jiàn)GPC3-BBZ-7×19 CAR-T細(xì)胞成團(tuán)生長(zhǎng)，說(shuō)明細(xì)胞狀態(tài)佳，且密度大于GPC3-BBZ CAR-T和Non-CAR-T細(xì)胞，說(shuō)明分泌IL-7的第四代GPC3-BBZ-7×19 CAR-T細(xì)胞其增殖能力優(yōu)于第二代。

圖1 慢病毒載體GPC3-BBZ和GPC3-BBZ-7×19的質(zhì)粒構(gòu)建示意圖Fig.1 Design diagram of lentiviral vector GPC3-BBZ and GPC3-BBZ-7×19.GPC3-BBZ: the human GPC3-targeted second generation CAR lentiviral vector; GPC3-BBZ-7×19: the human GPC3-targeted fourth generation CAR lentiviral vector which can express human interleukin-7 and chemokine CCL19.

在趨化實(shí)驗(yàn)中，我們將non-CAR-T細(xì)胞標(biāo)記上CFSE染料，并通過(guò)熒光顯微鏡觀察GPC3-BBZ-7×19 CAR-T細(xì)胞分泌至上清的CCL19對(duì)non-CAR-T細(xì)胞的趨化作用。結(jié)果 (圖3C) 表明，加入GPC3-BBZ-7×19 CAR-T細(xì)胞培養(yǎng)上清的孔中，其遷移到下室的non-CAR-T數(shù)量比另兩個(gè)組更多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.000 1)。

由于T細(xì)胞亞型對(duì)于CAR-T免疫治療效果具有重要作用，因此我們通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)比較CAR-T細(xì)胞的亞型分布。結(jié)果 (圖3D) 表明，在GPC3-BBZ-7×19 CAR-T細(xì)胞中，其初始T細(xì)胞(Native) (CAR+CD62L+CD45RA+CD45RO–) 和T記憶干細(xì)胞 (Tscm) (CAR+CD62L+CD45RA+CD45RO+)的比例高于GPC3-BBZ CAR-T，記憶干細(xì)胞的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.001)。

2.4 GPC3-BBZ-7×19 CAR-T細(xì)胞和GPC3-BBZ CAR-T細(xì)胞有相當(dāng)?shù)募?xì)胞因子分泌能力以及體外殺傷毒性

用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的肝細(xì)胞癌細(xì)胞系SK-Hep1、Huh7、HepG2和Hep3B細(xì)胞表面GPC3的表達(dá)水平，結(jié)果如圖4A所示，Huh7表面的GPC3抗原為高表達(dá)，HepG2和Hep3B為中等表達(dá)，而SK-Hep1則不表達(dá)。

圖3 GPC3-BBZ-7×19 CAR-T細(xì)胞和GPC3-BBZ CAR-T細(xì)胞體外功能比較Fig.3 Functional comparison of GPC3-BBZ-7×19 CAR-T cells and GPC3-BBZ CAR-T cells in vitro.(A) IL-7 and CCL19 secreted by GPC3-BBZ-7×19 CAR-T cells was detected on day 5 and 10 by ELISA.(B) Absolute numbers of GPC3-BBZ CAR-T and GPC3-BBZ-7×19 CAR-T cells on day 3, 5, 7, 9 counted.(C) Chemotactic capacity of CCL19 secreted by GPC3-BBZ-7×19 CAR-T cells toward non-CAR-T was examined by transwell assay.(D) To analysis the phenotype of CAR-T cells, the expression of CD62L, CD45RO, and CD45RA were determined by FCM assay with the indicated antibodies.Data represent the ±s of triplicates.*: P＜0.05, ***: P＜0.001, ****: P＜0.000 1, n=3.

將non-CAR-T細(xì)胞、GPC3-BBZ CAR-T細(xì)胞和GPC3-BBZ-7×19 CAR-T細(xì)胞與Huh7細(xì)胞按效靶比1︰1共孵育24 h，ELISA法檢測(cè)共孵育上清液中GM-CSF的濃度，流式胞內(nèi)染色法檢測(cè)共孵育T細(xì)胞IFN-γ的分泌情況。結(jié)果 (圖4B) 顯示，GPC3-BBZ CAR-T細(xì)胞和GPC3-BBZ-7×19 CAR-T細(xì)胞分泌GM-CSF和IFN-γ水平無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。

在體外殺傷實(shí)驗(yàn)中，我們采用熒光素酶生物發(fā)光法檢測(cè)CAR-T細(xì)胞與肝細(xì)胞癌細(xì)胞系(Huh7、HepG2和Hep3B) 在不同效靶比 (2︰1、5︰1、10︰1、20︰1) 下共孵育24 h后的體外殺傷情況。結(jié)果顯示，GPC3-BBZ CAR-T細(xì)胞和GPC3-BBZ-7×19 CAR-T細(xì)胞均能夠特異性殺傷GPC3陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞，且殺傷效果無(wú)明顯差異(P值均＞0.05，圖4C)，其對(duì)于靶細(xì)胞的最大裂解率與靶細(xì)胞表面GPC3表達(dá)陽(yáng)性率相關(guān)。以上結(jié)果表明，分泌IL-7和CCL19并沒(méi)有對(duì)CAR-T細(xì)胞活化后的細(xì)胞因子分泌能力以及殺傷的特異性和有效性造成不利影響。

圖4 GPC3-BBZ-7×19 CAR-T細(xì)胞體外殺傷活性以及細(xì)胞因子分泌能力檢測(cè)Fig.4 Cytotoxicity and cytokine secretion detection of GPC3-BBZ-7×19 CAR-T cells in vitro.(A) The glypican-3(GPC3) expression on human hepatocellular carcinoma cell lines was detected by FCM assay.(B) GM-CSF and IFN-γ secretion of GPC3-BBZ-7×19 CAR-T cells co-cultured with GPC3 positive hepatocellular carcinoma cells were detected by ELISA and FCM assay.(C) Cytotoxicity of GPC3-BBZ-7×19 CAR-T cells in vitro was detected by luciferase bio-luminescence assay.GM-CSF: granulocyte-macrophage colony stimulating factor; IFN-γ: interferon-γ.Data represent the ±s of triplicates.***: P＜0.001, ****: P＜0.000 1, n=3.

2.5 GPC3-BBZ-7×19 CAR-T細(xì)胞使小鼠體內(nèi)GPC3陽(yáng)性的肝細(xì)胞癌腹腔移植瘤消退

首先建立Huh7-Luc-GFP細(xì)胞的腹腔移植瘤模型，然后利用GPC3-BBZ-7×19 CAR-T細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)治療。由生物發(fā)光成像結(jié)果 (圖5A) 來(lái)看，與non-CAR-T組相比，GPC3-BBZ-7×19 CAR-T細(xì)胞有效使小鼠體內(nèi)的腫瘤消退。此外，我們將小鼠體重作為衡量CAR-T治療的毒性指標(biāo)之一，定期對(duì)小鼠體質(zhì)量進(jìn)行稱量。結(jié)果顯示，各組小鼠的體重?zé)o明顯差異 (P＞0.05，圖5B)，提示靶向GPC3的第四代CAR-T細(xì)胞 (分泌IL-7和CCL19)治療小鼠體內(nèi)的肝細(xì)胞癌腹腔移植瘤時(shí)未出現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)。

為了解CAR-T細(xì)胞在外周血中的存活情況，于28 d取小鼠外周血進(jìn)行染色，通過(guò)流式檢測(cè)外周血中T細(xì)胞所占比率，結(jié)果表明CAR-T組小鼠CD3+T細(xì)胞占25% (圖5C–D)，這其中GPC3 CAR表達(dá)陽(yáng)性的T細(xì)胞占50%，而對(duì)照組小鼠的外周血CD3+T細(xì)胞只占1%，這可能是由于實(shí)驗(yàn)組小鼠體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞被CAR-T特異性識(shí)別并刺激其增殖，而對(duì)照組中的non-CAR-T細(xì)胞不能特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞而自然衰竭死亡。

3 討論

基于CAR-T細(xì)胞的免疫過(guò)繼療法已被證明是治療B淋巴細(xì)胞惡性腫瘤的一項(xiàng)有效策略，目前這種臨床的成功性較難體現(xiàn)到實(shí)體瘤身上，由于實(shí)體瘤異質(zhì)性以及免疫微環(huán)境的存在，包括髓樣來(lái)源的抑制細(xì)胞 (Myeloid derived supressor cell，MDSC)、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 (Regulatory cell，Treg)、免疫抑制細(xì)胞因子 (例如IL-10) 等[25-26]，這些因素限制了CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)的增殖能力和持久性，從而影響其抗腫瘤能力。

先前的研究表明，T區(qū)成纖維網(wǎng)狀細(xì)胞產(chǎn)生的IL-7和CCL19對(duì)于淋巴器官中T細(xì)胞區(qū)的形成和維持至關(guān)重要[27-28]。為了提高靶向GPC3的CAR-T細(xì)胞對(duì)肝細(xì)胞癌的治療效果，我們構(gòu)建并制備了靶向GPC3的第四代CAR-T細(xì)胞 (分泌IL-7和CCL19)，與第二代GPC3 CAR-T相比，IL-7和CCL19的分泌不影響T細(xì)胞表面CAR表達(dá)以及CAR-T殺傷肝癌細(xì)胞的特異性和有效性。然而在無(wú)外源性添加IL-7的培養(yǎng)過(guò)程中，GPC3-BBZ-7×19 CAR-T細(xì)胞展現(xiàn)出了更為出色的增殖能力，這將有利于其在體內(nèi)的生存，提高其臨床活性。此外，CAR-T表型已被證明是臨床療效的一個(gè)關(guān)鍵因素[29-31]，相較于中央記憶型T細(xì)胞而言，T記憶干細(xì)胞分化程度低，具有更強(qiáng)的自我更新以及分化生成所有記憶和效應(yīng)T細(xì)胞子集的能力，從而被認(rèn)為具有更強(qiáng)的抗腫瘤活性和持久力[32]。已有研究表明IL-7趨向于誘導(dǎo)CAR-T細(xì)胞分化生成Naive、Tscm等分化程度更低的細(xì)胞[33]。經(jīng)亞型分析發(fā)現(xiàn)，GPC3-BBZ-7×19 CAR-T中Tscm的比率確實(shí)高于二代GPC3-BBZ CAR-T，這有利于其在體內(nèi)形成針對(duì)腫瘤的長(zhǎng)效記憶功能，從而更有效預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)。CCL19是T細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞的趨化因子，我們于體外驗(yàn)證GPC3-BBZ-7×19 CAR-T細(xì)胞分泌的CCL19對(duì)non-CAR-T細(xì)胞具有促遷移作用，這有助于其在體內(nèi)募集外周血T細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞協(xié)同對(duì)抗腫瘤。此外針對(duì)HCC移植瘤模型的體內(nèi)研究表明，GPC3-BBZ-7×19 CAR-T能有效清除免疫缺陷小鼠體內(nèi)的HCC移植瘤模型，并且在觀察期間小鼠體重穩(wěn)定，未發(fā)現(xiàn)不良反應(yīng)，一個(gè)月之后在外周血中仍然能夠檢測(cè)到部分存活的CAR-T細(xì)胞。

傳統(tǒng)的CAR-T細(xì)胞由于在體內(nèi)生存時(shí)間不夠長(zhǎng)，而且受到腫瘤微環(huán)境中各種免疫抑制因子的影響，對(duì)腫瘤的浸潤(rùn)能力較差，本研究構(gòu)建了一種靶向GPC3的第四代CAR-T細(xì)胞 (分泌IL-7和CCL19)，其生存能力、趨化能力和亞型分布均優(yōu)于第二代GPC3 CAR-T細(xì)胞，因此有望在體內(nèi)取得更好的抗腫瘤效果，并為之后的臨床試驗(yàn)提供臨床前研究基礎(chǔ)。

圖5 GPC3-BBZ-7×19 CAR-T細(xì)胞對(duì)NCG小鼠體內(nèi)肝細(xì)胞癌腹腔移植瘤的作用效果Fig.5 Effect of GPC3-BBZ-7×19 CAR-T cells on the growth of GPC3-positive hepatocellular carcinoma xenograft in NCG mice.(A) NCG mice bearing Huh-7-Luc-GFP xenografts were intravenous injected with 8×106 non-CAR-T or GPC3-BBZ-7×19 CAR-T cells on day 5.Mice were imaged weekly.Tumor growth was assessed by total bioluminescence signals.(B) The weight curve of NCG mice after incubation with different CAR-T cells.(C) CD3+ human T cells in mice peripheral blood were detected by FCM assay.(D) CAR+ T cells in mice peripheral blood were detected by FCM assay.