山藥商品規(guī)格及其質(zhì)量特性分析

馬 蕊，王露露，陳隨清

（河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，河南鄭州 450046）

按質(zhì)論價(jià)是中藥材商品交易的傳統(tǒng)特色，中藥材商品規(guī)格等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)是實(shí)現(xiàn)按質(zhì)論價(jià)、優(yōu)質(zhì)優(yōu)價(jià)的重要依據(jù)［1］。目前在我國(guó)現(xiàn)行的《七十六種藥材商品規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)》 中，山藥的商品規(guī)格劃分依據(jù)為外觀性狀，但隨著中醫(yī)藥現(xiàn)代化的發(fā)展，僅依據(jù)外觀性狀已無(wú)法滿足現(xiàn)實(shí)需求，亟需建立能反映中藥材內(nèi)在質(zhì)量的商品規(guī)格等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，這是規(guī)范中藥材市場(chǎng)交易的關(guān)鍵［2-4］。

山藥為薯蕷科植物薯蕷Dioscorea oppositaThunb.的干燥根莖，其化學(xué)成分主要含有蛋白質(zhì)、多糖、氨基酸、尿囊素等［5-7］，具有補(bǔ)脾養(yǎng)胃、生津益肺、補(bǔ)腎澀精的功效［8］，以及抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、降血糖等［9-11］作用。趙國(guó)華等［12］從山藥塊莖中提取到一種山藥多糖RDPS-I，闡明了其化學(xué)結(jié)構(gòu)，并證明其具有免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤作用。鄭曉珂等［13］采用小鼠子宮增重實(shí)驗(yàn)和人乳腺癌細(xì)胞（MCF-7） 增值實(shí)驗(yàn)對(duì)尿囊素雌激素樣活性進(jìn)行篩選，首次發(fā)現(xiàn)尿囊素具有雌激素樣作用。陳艷等［14］用氨基酸分析儀測(cè)定了山藥中各種氨基酸的組成，結(jié)果表明，懷山藥中有17 種氨基酸，其中人體必需氨基酸的含有量占總氨基酸的25.32%。

本研究通過(guò)測(cè)定浸出物、尿囊素、腺苷、β-谷甾醇、氨基酸、山藥多糖、單糖和寡糖等化學(xué)成分的含有量，對(duì)山藥不同商品規(guī)格等級(jí)進(jìn)行綜合比較分析，為了更好的反映藥材的質(zhì)量與療效的相關(guān)性，對(duì)山藥抗氧化和降血糖等生物作用進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期為制定山藥商品規(guī)格等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)提供理論依據(jù)，對(duì)規(guī)范和保證山藥的質(zhì)量具有重要意義。

1 材料

1.1 樣品 本實(shí)驗(yàn)采集河北安國(guó)、安徽亳州、四川荷花池、廣西玉林、內(nèi)蒙古赤峰等藥材市場(chǎng)，河南焦作、河北安國(guó)等山藥產(chǎn)地，以及焦作地區(qū)山藥加工炮制企業(yè)的藥材及飲片，共44 批，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)陳隨清教授鑒定為薯蕷科植物薯蕷Dioscorea oppositaThunb.的干燥根莖。

山藥在市場(chǎng)上依據(jù)加工方式的不同，主要有3 種商品規(guī)格，分別為毛山藥、光山藥、山藥片，另有毛山藥、光山藥經(jīng)炮制而成的飲片。

1.2 儀器 UV-2600 紫外分光光度計(jì)、LC-20A 高效液相色譜儀（日本島津公司）；ME203E 分析天平（十萬(wàn)分之一，瑞士梅特勒-托利多公司）；BSA124S-CW 天平（萬(wàn)分之一，德國(guó)賽多利斯公司）；Milli-Q Academic A10 超純水機(jī)（美國(guó)Millipore 公司）。

1.3 試藥 尿囊素（批號(hào)B20909，純度≥98%）、腺苷（批號(hào)B21356，純度≥98%）、β-谷甾醇（批號(hào)B21972，純度≥98%）、果糖（批號(hào)B21896，純度≥99% ）、麥芽糖（批號(hào)B20834，純度≥98%）、蔗糖（批號(hào)111507-200302，純度≥99%） 對(duì)照品均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；葡萄糖 （批號(hào)110833-200503，純度≥98%）、麥芽三糖（批號(hào)100274-200601，純度100%） 對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。1，1-二苯基-2-苦基肼（DPPH） 購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；維生素E 軟膠囊購(gòu)自海南海神同洲制藥有限公司；阿卡波糖購(gòu)自德國(guó)拜耳醫(yī)藥保健有限公司；α-葡萄糖苷酶、4-硝基苯酚-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG） 購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；α-淀粉酶、還原型谷胱甘肽（GSH） 購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。乙腈、甲醇為色譜純；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 等級(jí)劃分 觀察44 批山藥藥材及飲片性狀，然后基于《七十六種藥材商品規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)》 與市售標(biāo)示規(guī)格等級(jí)重新劃分。毛山藥按中部圍粗6、4、2 cm 以上，劃分為一等、二等、三等；光山藥按直徑1.8、1.5、0.8 cm以上，劃分為一等、二等、三等；山藥片按表面白色、黃白色、粉褐色，劃分為一等、二等、三等。最終，得到61 個(gè)帶編號(hào)樣品。

編碼原則如下，毛山藥MXYYY，其中M 代表毛山藥；X 代表等級(jí)編碼，一等1，二等2，三等3；樣品號(hào)YYY。光山藥、毛山藥片、光山藥片編號(hào)分別為GXYYY、MPXYYY、GPXYYY，等級(jí)編碼及樣品號(hào)同毛山藥。山藥片PXYYY，其中P 代表山藥片；X 代表等級(jí)編碼，白色1，黃白色2，粉褐色3；樣品號(hào)YYY。

2.2 水分、總灰分和二氧化硫殘留量檢查 參照2015 年版《中國(guó)藥典》 山藥項(xiàng)下測(cè)定，發(fā)現(xiàn)所有樣品的水分、總灰分均符合規(guī)定，但二氧化硫殘留量有8 份超標(biāo)。

2.3 成分含有量測(cè)定

2.3.1 浸出物 參照2015 年版《中國(guó)藥典》 山藥項(xiàng)下測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3.2 尿囊素 參考文獻(xiàn)［15］報(bào)道，將流動(dòng)相調(diào)整為甲醇-水（2∶98）；體積流量0.5 mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)224 nm。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 尿囊素HPLC 色譜圖

2.3.3 腺苷 參照2015 年版《中國(guó)藥典》 中冬蟲(chóng)夏草腺苷［8］含有量測(cè)定方法，將流動(dòng)相調(diào)整為甲醇-水（15∶85）；進(jìn)樣量20 μL。在此色譜條件下，樣品中腺苷與其他組分獲得了較好的分離，色譜圖見(jiàn)圖2。

2.3.4 β-谷甾醇 參考文獻(xiàn)［16］報(bào)道，將流動(dòng)相改為純甲醇；檢測(cè)波長(zhǎng)205 nm；柱溫35 ℃。色譜圖見(jiàn)圖3。

2.3.5 山藥多糖 采用文獻(xiàn)［17］報(bào)道的紫外分光光度法測(cè)定。

2.3.6 單糖、寡糖

圖2 腺苷HPLC 色譜圖

圖3 β-谷甾醇HPLC 色譜圖

2.3.6.1 對(duì)照品溶液制備 分別精密稱取果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、麥芽三糖對(duì)照品10.05、21.21、10.00、12.09、12.35 mg 至2 mL 量瓶中，加水稀釋至刻度，即得（含有量分別為5.025、10.605、5.00、6.045、6.175 g／L）。

2.3.6.2 供試品溶液制備 取山藥粉末約1 g，精密稱定，加15 mL 水煮沸15 min，冷卻至60 ℃以下，加入5 mL 新鮮配制的2%淀粉酶溶液，55 ℃下保溫1 h，不時(shí)振搖，加1 滴碘試液，應(yīng)不顯藍(lán)色，若顯藍(lán)色則重復(fù)上述步驟直至不顯色，冷卻后移入50 mL 量瓶中，加水至刻度，混勻，濾過(guò)，續(xù)濾液用0.22 μm 微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.3.6.3 色譜條件 Inertsil NH2色譜柱 （4.6 mm ×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈-水（80∶20）；柱溫30 ℃；體積流量1.0 mL／min；進(jìn)樣量20 μL。色譜圖見(jiàn)圖4。

圖4 各成分HPLC 色譜圖

2.3.7 方法學(xué)考察 尿囊素、腺苷、β-谷甾醇、山藥多糖、果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、麥芽三糖在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r＞0.999 8），加樣回收率試驗(yàn)中RSD 分別為2.34%、1.38%、1.85%、2.60%、1.70%、1.83%、2.35%、2.37%、2.39%。

2.3.8 樣品含有量測(cè)定 將61 批樣品制成供試品溶液，在“2.3.6.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含有量，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 山藥樣品浸出物及各成分含有量測(cè)定結(jié)果（%）

2.4 氨基酸含有量測(cè)定 采用氨基酸自動(dòng)分析儀，由河南海瑞正檢測(cè)有限公司進(jìn)行測(cè)定。

2.5 體外抗氧化活性測(cè)定 參考文獻(xiàn)［18］報(bào)道，取DPPH約40 mg，精密稱定，溶于無(wú)水乙醇中制成20 mmol／mL溶液；取山藥粉末5 g，加10 倍量75% 乙醇超聲提取30 min，濾過(guò)，得供試品溶液，75% 乙醇依次稀釋成0.1、1、5、10、20、30 g／L。取DPPH 溶液、供試品溶液各100 μL，充分混勻，室溫下避光放置30 min，在517 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度Ai；取DPPH 溶液、75% 乙醇各100 μL，測(cè)定吸光度Ac；取供試品溶液、75%乙醇各100 μL，測(cè)定吸光度Aj，計(jì)算DPPH 清除率，公式為清除率＝ ［1-（Ai-Aj） ／Ac］×100%。

2.6 降血糖活性研究

2.6.1 供試品溶液制備 參考文獻(xiàn)［19］報(bào)道，取山藥粉末5 g，精密稱定，加入40 mL 乙酸乙酯，超聲30 min 提取2 次，濾過(guò)，合并濾液，揮干，殘?jiān)脽o(wú)水乙醇溶解并定容至10 mL 量瓶中，依次稀釋成0.5、0.25、0.125、0.08、0.062 5、0.045、0.031 25、0.015 6 g／mL，即得。

2.6.2 α-淀粉酶抑制活性測(cè)定 參照Sigma 公司α-淀粉酶操作說(shuō)明書(shū)方法，取待測(cè)樣品溶液0.5 mL，加入1%淀粉溶液0.5 mL，25 ℃水浴5 min，然后加入淀粉酶溶液0.5 mL，繼續(xù)水浴3 min，加入1 mL DNS 溶液沸水浴中煮沸15 min 終止反應(yīng)，流水冷卻，加蒸餾水定容至25 mL，540 nm 下測(cè)定吸光度，計(jì)算酶活性抑制率。以樣品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），酶活性抑制率為縱坐標(biāo)（Y） 繪制抑制曲線，求出IC50值。

酶活性抑制率＝ ［1-（A1-A2） ／ （A3-A4）］×100%，式中A1為待測(cè)溶液吸光度，A2為待測(cè)溶液本底吸光度，A3為空白對(duì)照溶液吸光度，A4為空白對(duì)照溶液本底吸光度。

2.6.3 α-葡萄糖苷酶抑制活性測(cè)定 參照α-葡萄糖苷酶操作說(shuō)明書(shū)方法，在5 mL 67 mmol／mL、pH6.8 磷酸二氫鉀緩沖液中加入0.1 mL 待測(cè)樣品、0.1 mL GSH、0.1 mL α-葡萄糖苷酶、，搖勻后37 ℃溫浴10 min，然后加入0.1 mL PNPG，37 ℃水浴反應(yīng)20 min，加入0.1 mol／mL 碳酸鈉溶液5 mL 終止反應(yīng)，在400 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。按“2.6.2”項(xiàng)下方法計(jì)算酶活性抑制率，求出IC50值。

3 數(shù)據(jù)分析

3.1 成分分析

3.1.1 聚類分析 采用SPSS 20.0 軟件，以浸出物及9 種成分含有量為原始數(shù)據(jù)，將其標(biāo)準(zhǔn)化處理后進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見(jiàn)圖5。

由此可知，相同規(guī)格不同等級(jí)山藥片單獨(dú)聚成一類，其他規(guī)格山藥聚成一類，但各規(guī)格等級(jí)相互交叉較多，可見(jiàn)等級(jí)與成分含有量相關(guān)性不強(qiáng)，各等級(jí)之間無(wú)明顯區(qū)別。

3.1.2 主成分分析 以浸出物及9 種成分含有量作為變量，特征值和累計(jì)貢獻(xiàn)率作為判定依據(jù)，SPSS 20.0 軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理后進(jìn)行主成分分析。根據(jù)降維結(jié)果，選出2 個(gè)主成分PC1、PC2，特征值分別為8.286、1.054，累積貢獻(xiàn)率達(dá)到93.397%，代表性強(qiáng)，浸出物、尿囊素、腺苷、果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖在PC1 上具有較高的載荷，說(shuō)明PC1 主要反映了這些成分的信息。同理，PC2主要反映了β-谷甾醇、多糖、麥芽三糖的信息。

圖5 15 批不同商品規(guī)格等級(jí)樣品聚類樹(shù)狀圖

以每個(gè)主成分對(duì)應(yīng)的方差貢獻(xiàn)率占所提取主成分總方差貢獻(xiàn)率之和的比例作為權(quán)重，計(jì)算主成分綜合得分（F），公式為F＝0.887 1F1＋0.112 8F2，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同規(guī)格等級(jí)樣品成分含有量綜合得分

由此可知，山藥片排名第一，其次為毛山藥、毛山藥片、光山藥、光山藥片。但不同規(guī)格等級(jí)無(wú)顯著規(guī)律性，表明等級(jí)劃分與成分含有量無(wú)明顯相關(guān)性。

3.1.3 方差分析 聚類分析和主成分分析結(jié)果表明，不同規(guī)格樣品的等級(jí)劃分與成分含有量相關(guān)性不強(qiáng)，故不再對(duì)其進(jìn)行方差分析。采用SPSS 20.0 軟件對(duì)不同商品規(guī)格樣品進(jìn)行方差分析，多重差異檢驗(yàn)結(jié)果采用字母標(biāo)記法表示，如在浸出物中山藥片標(biāo)示a，而其他商品規(guī)格不含a，即山藥片與其他商品規(guī)格具有顯著性差異；毛山藥與光山藥均含有b，故兩者沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 不同規(guī)格樣品中各成分方差分析

由此可知，在浸出物、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、麥芽三糖、尿囊素、腺苷含有量方面，山藥片與其他規(guī)格樣品均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且含有量最高，其中麥芽三糖最低；在多糖含有量方面，光山藥與其他規(guī)格樣品均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，含有量最高；在果糖含有量方面，5 種規(guī)格樣品均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其中山藥片含有量最高；在谷甾醇含有量方面，5種規(guī)格樣品均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3.2 統(tǒng)計(jì)分析 本實(shí)驗(yàn)共測(cè)定了山藥中17 種氨基酸，包括人體必需的7 種，其含有量以谷氨酸、精氨酸、天門(mén)冬氨酸最高，胱氨酸最低；必需氨基酸含有量依次為亮氨酸＞苯丙氨酸＞賴氨酸＞纈氨酸＞異亮氨酸＞蘇氨酸＞蛋氨酸。SPSS 20.0 軟件對(duì)17 種氨基酸含有量及總量在不同規(guī)格樣品之間的差異進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同規(guī)格樣品中氨基酸含有量方差分析（%，， n≥3）

表3 不同規(guī)格樣品中氨基酸含有量方差分析（%，， n≥3）

注：在組間多重比較中，小寫(xiě)字母a～c 表示有顯著差異（P＜0.05），大寫(xiě)字母A～C 表示有極顯著差異（P＜0.01）。

由此可知，蘇氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、胱氨酸、異亮氨酸、組氨酸含有量在各規(guī)格樣品之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；在谷氨酸、絲氨酸、精氨酸、丙氨酸含有量及總量方面，山藥片與其他規(guī)格樣品有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，含有量最高；在纈氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸含有量方面，毛山藥與其他規(guī)格樣品有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，含有量最高。

3.3 體外抗氧化活性 不同商品規(guī)格山藥對(duì)DPPH 的清除作用見(jiàn)圖7。由此可知，隨著質(zhì)量濃度升高，各商品規(guī)格山藥的清除作用增強(qiáng)，其中山藥片低于毛山藥、光山藥、毛山藥片和光山藥片。采用Logit 法計(jì)算IC50值，并用單因素方差分析比較不同商品規(guī)格樣品的清除能力差異，發(fā)現(xiàn)山藥片與其他規(guī)格樣品有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，IC50為6.61 g／L，抗氧化活性最弱；毛山藥、光山藥、毛山藥片、光山藥片各等級(jí)之間的IC50均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，分別為2.24、2.37、1.75、2.04 g／L。

圖7 不同規(guī)格樣品對(duì)DPPH 的清除作用

3.4 降血糖活性 不同規(guī)格樣品對(duì)α-淀粉酶的抑制率均小于50%，遠(yuǎn)小于陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖，即無(wú)明顯抑制作用，與文獻(xiàn)［19-20］報(bào)道一致，見(jiàn)圖8。

圖8 不同商品規(guī)格樣品對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用

由此可知，隨著質(zhì)量濃度升高，各規(guī)格樣品對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用增強(qiáng)，其中山藥片高于毛山藥、光山藥、毛山藥片和光山藥片。采用Logit 法計(jì)算IC50值，發(fā)現(xiàn)各樣品遠(yuǎn)大于陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖，其中山藥片抑制作用較強(qiáng)，IC50為0.034 8 g／L；光山藥、光山藥片的最大抑制率均未達(dá)到50%，無(wú)法計(jì)算IC50值；毛山藥、毛山藥片對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用最弱，IC50分別為0.099、0.103 7 g／L。

4 討論與結(jié)論

鮮山藥含水量高，農(nóng)戶會(huì)使用硫磺熏制和熱風(fēng)干燥的方法加工以達(dá)到干燥的效果［21］。由于加工技術(shù)水平有限、操作不規(guī)范等，有8 份樣品二氧化硫殘留量超標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)以水溶性浸出物含有量為指標(biāo)對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明有6 份不合格，推測(cè)在產(chǎn)地加工時(shí)毛山藥有一個(gè)濱水的過(guò)程，水溶性成分會(huì)有一定流失。

山藥化學(xué)成分復(fù)雜，以淀粉為主，目前有效成分和指標(biāo)物質(zhì)不明確。本研究通過(guò)測(cè)定浸出物、氨基酸及9 種成分的含有量，發(fā)現(xiàn)各規(guī)格之間有差異，其中山藥片大部分高于其他規(guī)格，但各等級(jí)之間無(wú)顯著性差異。山藥片降血糖活性強(qiáng)于其他規(guī)格，但是抗氧化活性更低；山藥片大部分成分含有量均高于其他規(guī)格，與其降血糖活性呈正相關(guān)；山藥片中多糖、麥芽三糖含有量較低，文獻(xiàn)報(bào)道多糖為山藥主要活性成分，具有較強(qiáng)的抗氧化活性［22］，因此各成分含有量與抗氧化活性呈負(fù)相關(guān)可能與其含有量有較大聯(lián)系。

各規(guī)格樣品之間成分含有量差異明顯，可能與加工方式有關(guān)。山藥加工成商品需要經(jīng)過(guò)去皮、濱水、晾曬等諸多步驟，而且不同規(guī)格加工方式也不一樣。毛山藥、光山藥有時(shí)會(huì)硫熏，這在一定程度上會(huì)影響成分含有量，并且光山藥還要進(jìn)行搓圓、打光等步驟，更容易流失；山藥片基本上都是直接切片、烘干，可有效保存成分，所以總量較高。

同時(shí)，毛山藥、光山藥、毛山藥片、光山藥片抗氧化活性較強(qiáng)，可能是這些樣品在加工過(guò)程中經(jīng)過(guò)了硫熏，殘留有亞硫酸基團(tuán)，它具有清除自由基的能力。但有些毛山藥、光山藥（包括飲片） 并未檢測(cè)到二氧化硫殘留，其抗氧化活性也較強(qiáng)，并且其殘留量是否超標(biāo)與抗氧化活性及多糖含有量均無(wú)明顯相關(guān)性，具體原因有待進(jìn)一步研究。