UPLC-MS／MS 法分析通奶草乙酸乙酯部位成分及其體外抗菌活性

林啟凰，鮑紅娟，張 崗*

（1.廈門醫(yī)學(xué)院，廈門市海洋天然產(chǎn)物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建廈門 361023； 2.廈門醫(yī)學(xué)院閩臺(tái)青草藥研究室，福建廈門 361023）

大戟科大戟屬植物是被子植物的一個(gè)龐大家族，全世界有2 000 種以上［1］，《中國植物志》 記載該屬植物有80種［2］，部分是臨床上常見中藥，如大戟、狼毒、甘遂、飛揚(yáng)草等，在民間應(yīng)用也十分普遍，具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗炎等藥理活性［3］。通奶草Euphorbia hypericifoliaL.為大戟屬聚生花序組植物［4］，廣泛分布于我國長江以南各省，具有清熱利濕、收斂止癢的功效［3］，可用于治療腹瀉及瘙癢性皮膚病，主要含有黃酮、鞣花酸、三萜、甾體類物質(zhì)［5］，但其藥理活性評價(jià)未見報(bào)道。課題組前期發(fā)現(xiàn)，通奶草乙酸乙酯萃取物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌有一定的抑制作用，為了進(jìn)一步發(fā)掘其藥用價(jià)值，本實(shí)驗(yàn)利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（UPLC-MS／MS） 對其乙酸乙酯萃取物成分進(jìn)行分析，共鑒定出21 種，包括3 種有機(jī)酸、8 種可水解鞣質(zhì)、10 種黃酮，除鞣花酸和槲皮素外均為首次從該植物中鑒定。

1 材料

ACQUITY UPLC H-Class 超高效液相色譜儀［Waters 科技（上海） 有限公司］；Q Exactive Focus 組合型四極桿Orbitrap 質(zhì)譜儀（美國賽默飛世爾科技公司）；Diaion MCI樹脂（日本三菱化學(xué)公司）。沒食子酸、鞣花酸、異槲皮苷、木犀草苷、紫云英苷、槲皮素對照品均購自成都瑞芬思生物科技有限公司；瑞諾苷、番石榴苷、juglalin 對照品均購自成都普利斯生物科技有限公司；金絲桃苷［6］、柯里拉京［7］、老鸛草素［7］對照品為實(shí)驗(yàn)室自制。MH 瓊脂培養(yǎng)基（北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司）；MH 液體培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱生物科技有限公司）；金黃色葡萄球菌、大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株由廈門醫(yī)學(xué)院病原微生物與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供；氨芐青霉素、諾氟沙星藥敏紙片（杭州微生物試劑有限公司）。藥材于2018 年10 月采自福建廈門市灌口鎮(zhèn)，經(jīng)廈門醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系鮑紅娟副教授鑒定為大戟科大戟屬植物通奶草Euphorbia hypericifoliaL.的地上部分。

2 方法

2.1 樣品溶液制備 取通奶草地上部分50 g （干重） 粉碎成粗粉，分別用10 倍量75%甲醇加熱回流提取2 次，每次2 h，濾過，合并提取液，減壓濃縮至無醇味，加入適量水混旋后，依次用等量的石油醚、乙酸乙酯各萃取3 次，合并萃取液，減壓蒸干得總萃取物（2.5 g），取適量過MCI樹脂，90%甲醇洗脫，收集洗脫液，減壓干燥，適量甲醇溶解，即得（1 mg／mL）。

2.2 色譜條件 Agilent Eclipse Plus C18色譜柱（100 mm×4.6 mm，3.5 μm）；柱溫25 ℃；流動(dòng)相乙腈（A） -0.1%甲酸（B），梯度洗脫 （0～50 min，5%～30% B；50～51 min，30%～100%B；51～57 min，100%～100%B；體積流量0.4 mL／min；全波長掃描；進(jìn)樣量2.5 μL。

2.3 質(zhì)譜條件 電噴霧電離源負(fù)離子檢測模式，輔助氣體積流量5 L／min；噴霧電壓2.00 kV；離子傳輸管溫度320 ℃；掃描模式Full MS／dd-MS2，m／z100～1 500；二級質(zhì)譜碰撞能量-30 eV。

2.4 抗菌實(shí)驗(yàn)

2.4.1 抑菌圈測定［8］取金黃色葡萄球菌、大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（-80 ℃超低溫保存），活化后挑取單菌落接種于100 mL MH 肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃下?lián)u瓶培養(yǎng)24 h，最后將菌液調(diào)整至約1.5×108CFU／mL 的含菌量。

金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的陽性對照品分別為氨芐青霉素、諾氟沙星藥敏紙片，空白對照為甲醇和活化菌液。將各活化菌液用滅菌棉簽均勻鋪于MH 瓊脂培養(yǎng)基板上，用鑷子夾取直徑6 mm 的無菌濾紙片放在平板中，貼緊MH固體培養(yǎng)基表面，吸取2 mg／mL 樣品溶液10 μL 滴于濾紙上，陽性藥敏紙片同法貼于培養(yǎng)基表面，待甲醇揮干后密封，于37 ℃培養(yǎng)箱中靜置24 h 后觀察。

2.4.2 最小抑菌濃度測定［9］采用96 孔板法，每孔培養(yǎng)體系為200 μL，含有MH 液體培養(yǎng)液180 μL、不同質(zhì)量濃度的待測樣品10 μL、菌液10 μL。測試前配制樣品溶液，并稀釋成2、1.8、1.6、1.4、1、0.8 mg／mL。用空白培養(yǎng)基和甲醇溶液作對照，吸取稀釋好的待測樣品10 μL，置于已加入180 μL 培養(yǎng)液的96 孔板中，加入菌液10 μL，密封，于37 ℃培養(yǎng)箱中靜置24 h 后觀察并計(jì)算MIC 值。

公式為MIC （μg／mL） ＝ （V1×C×1 000） ／V2，其中V1為待測樣品體積（μL），V2為體系總體積（μL），C為使培養(yǎng)液澄清的最低待測溶液質(zhì)量濃度（mg／mL）。

3 結(jié)果

經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)合同屬植物化學(xué)成分報(bào)道，推斷通奶草主要成分可能為酚類，故采用負(fù)離子模式采集總離子流數(shù)據(jù)，結(jié)果見圖1、表1。根據(jù)離子流出峰的相對保留時(shí)間、準(zhǔn)分子離子的精確質(zhì)荷比、碎片離子信息，同時(shí)參照文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，最終鑒定出21 種成分，包括3 種有機(jī)酸、8 種可水解鞣質(zhì)、10 種黃酮，結(jié)合相關(guān)對照品信息，鑒定了沒食子酸（1）、柯里拉京（5）、老鸛草素（6）、鞣花酸（11）、金絲桃苷（12）、異槲皮苷（13）、木犀草苷（14）、瑞諾苷（15）、番石榴苷（16）、紫云英苷（17）、juglalin （20）、槲皮素（21），除鞣花酸和槲皮素外均首次從該植物中鑒定。體外抗菌實(shí)驗(yàn)顯示，通奶草乙酸乙酯萃取物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有一定的的抑制作用。具體如下。

圖1 通奶草乙酸乙酯萃取部位負(fù)離子檢測模式下總離子流圖

3.1 化合物鑒定

3.1.1 沒食子酸類 化合物1 （tR＝6.00 min） 的準(zhǔn)分子離子峰為m／z169.013 3 ［M-H］-，根據(jù)元素組成，推測分子式為C7H6O5，二級碎片離子m／z125.023 1 ［M-H-CO2］-是由為分子中失去一個(gè)質(zhì)子和一個(gè)中性碎片CO2產(chǎn)生，根據(jù)對照品的相關(guān)信息，鑒定化合物1 為沒食子酸?；衔? （tR＝18.05 min） 的準(zhǔn)分子離子峰為m／z183.029 1 ［MH］-，根據(jù)元素組成，推測分子式為C8H8O5，二級碎片離子m／z168.005 4 ［M-H-·CH3］-是由為分子中失去1 個(gè)質(zhì)子和1 個(gè)甲基自由基·CH3產(chǎn)生，初步鑒定化合物2 為沒食子酸甲酯［10］。

3.1.2 沒食子酸鞣質(zhì) 化合物3、7、10 的二級質(zhì)譜均有m／z169 ［M-H］-特征信號，且為基峰，提示分子中均有沒食子?；?；其碎片離子在準(zhǔn)分子離子峰基礎(chǔ)上連續(xù)失去沒食子?；?（-galloyl，152 u）［11］，也可能失去中性碎片H2O。以化合物10 （tR＝33.92 min） 為例，準(zhǔn)分子離子峰為m／z787.100 1 ［M-H］-，根據(jù)元素組成，推測分子式C34H28O22，二級質(zhì)譜顯示了635.090 8 ［M-H-galloyl］-、617.080 9 ［M-H-galloyl-H2O］-、483.078 0 ［M-H-2galloyl］-、465.067 3 ［M-H-2galloyl-H2O］-、169.013 2［GA］-等特征碎片離子信息，根據(jù)文獻(xiàn)［12］鑒定為四沒食子?；咸烟擒?。同理，化合物3 （tR＝24.43 min）、7（tR＝28.41 min） 的準(zhǔn)分子離子峰分別為m／z635.089 9、635.089 7 ［M-H］-，根據(jù)碎片離子信息和文獻(xiàn)［12］鑒定均為三沒食子?；咸烟擒眨ㄍ之悩?gòu)體）。

3.1.3 鞣花酸及鞣花鞣質(zhì) 化合物11 （tR＝34.80 min）的準(zhǔn)分子離子峰為m／z300.998 8 ［M-H］-，根據(jù)元素組成，推測分子式為C14H6O8，特征碎片離子有m／z283.305 4［M-H-H2O］-、257.008 5 ［M-H-CO2］-。根據(jù)碎片離子和對照品的相關(guān)信息，鑒定為鞣花酸。

化合物4～6、8～9 鑒定為鞣花鞣質(zhì)，分子中均有六羥基聯(lián)苯二甲酸結(jié)構(gòu)，二級質(zhì)譜均出現(xiàn)m／z301 ［M-H］-［13］，且為基峰，其碎片離子可能失去沒食子?；蛑行运槠琀2O。該類化合物另一個(gè)典型特征是一級質(zhì)譜上易見［M-2H］2-峰［14］。以化合物5 （tR＝26.60 min）、6 （tR＝27.11 min） 為例，化合物5 準(zhǔn)分子離子峰為m／z633.074 5［M-H］-，根據(jù)元素組成，推測分子式C27H22O18，二級質(zhì)譜顯示了615.063 0 ［M-H-H2O］-、463.051 9 ［M-Hgalloyl-H2O］-、300.999 3 ［ellagic acid］-、169.013 4［GA］-等特征性碎片離子信息，根據(jù)文獻(xiàn)［15］并結(jié)合對照品質(zhì)譜和色譜信息，鑒定為柯里拉京；化合物6 準(zhǔn)分子離子峰為m／z951.076 2 ［M-H］-，根據(jù)元素組成，推測分子式C41H28O27，二級質(zhì)譜顯示了475.034 1 ［M-2H］2-特征性碎片離子，以及933.064 6 ［M-H-H2O］-、933.053 1 ［M-HH2O］-、475.034 1 ［M-2H］2-、300.999 1 ［ellagic acid］-、169.012 9 ［GA］-等特征性碎片離子信息，根據(jù)文獻(xiàn)［15］結(jié)合對照品質(zhì)譜和色譜信息，鑒定為老鸛［12］草素。同理，

鑒定化合物4、8、9 分別為chebulanin［16］、digalloyl-HHDPglucose、chebulagic acid［12］。

表1 通奶草乙酸乙酯部位化學(xué)成分鑒定

3.2 黃酮類化合物鑒定

3.2.1 槲皮素類 負(fù)離子模式下，黃酮醇苷的ESI 串聯(lián)質(zhì)譜中易形成［M-H］-分子離子峰，脫去糖基形成苷元離子［Y0］-，也可以均裂方式形成［Y0-H］-·自由基負(fù)離子［17］，后者在3-O 取代黃酮中極易形成［18］?；衔?2～13、15～16 鑒定為以槲皮素為母核的黃酮苷，二級質(zhì)譜均顯示了槲皮素母核的特征信號為m／z301 為 ［Y0］-，m／z300 為［Y0-H］-·，后者為基峰，說明可能為3-O取代黃酮苷；m／z271 為［Y0-H2CO］-碎片離子，m／z151 為RDA 裂解產(chǎn)生的碎片離子?；衔?2 （tR＝35.18 min） 準(zhǔn)分子離子峰為m／z463.088 5 ［M-H］-，與苷元m／z301 相比少了一個(gè)己醛糖基，推斷3-O上連有己醛糖；化合物13 （tR＝35.91 min）準(zhǔn)分子離子峰為m／z463.088 4 ［M-H］-，與苷元m／z301相比少了一個(gè)己醛糖基，推斷3-O上也連有己醛糖，根據(jù)對照品的相對保留時(shí)間和質(zhì)譜信息，鑒定12 為槲皮素-3-Oβ-吡喃半乳糖苷，即金絲桃苷；13 為槲皮素-3-O-β-吡喃葡萄糖苷，即異槲皮苷。化合物15 （tR＝37.46 min） 準(zhǔn)分子離子峰為m／z433.077 8 ［M-H］-，與苷元m／z301 相比少了一個(gè)戊醛糖基，推斷3-O上連有戊醛糖；16 （tR＝38.31 min） 準(zhǔn)分子離子峰為m／z433.077 6 ［M-H］-，與苷元m／z301 相比少了一個(gè)戊醛糖基，推斷3-O上也連有戊醛糖，根據(jù)對照品的相對保留時(shí)間和質(zhì)譜信息，鑒定化合物15 為槲皮素-3-O-β-D-吡喃木糖苷，即瑞諾苷；16 為槲皮素-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖苷，即番石榴苷。根據(jù)準(zhǔn)分子離子峰、碎片離子和對照品信息，鑒定化合物21 （tR＝53.39 min） 為槲皮素。

3.2.2 山柰酚類 化合物17、19～20 鑒定為以山柰酚為母核的黃酮苷，二級質(zhì)譜均顯示其特征信號為m／z285 為［Y0］-，m／z284 為［Y0-H］-·，后者為基峰，說明可能為3-O取代黃酮苷；m／z255 為［Y0-H2CO］-碎片離子，m／z151 為RDA 裂解產(chǎn)生的碎片離子?；衔?7 （tR＝39.86 min） 準(zhǔn)分子離子峰為m／z447.093 5 ［M-H］-，與苷元m／z285 相比少了一個(gè)己醛糖基，推斷3-O上連有己醛糖，根據(jù)對照品的相對保留時(shí)間和質(zhì)譜信息，鑒定為山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷，即紫云英苷?；衔?9 （tR＝41.50 min） 和20 （tR＝42.43 min） 為同分異構(gòu)體，準(zhǔn)分子離子峰均為m／z417 ［M-H］-，與苷元m／z285 相比均少了一個(gè)戊醛糖基，推斷3-O上連有戊醛糖，根據(jù)對照品相對保留時(shí)間和質(zhì)譜信息，鑒定20 為山柰酚-3-O-α-阿拉伯糖苷，即juglalin；根據(jù)同屬植物化學(xué)成分報(bào)道和相對保留時(shí)間［19-20］，初步鑒定19 為山柰酚-3-O-β-D-吡喃木糖苷。

3.2.3 其他黃酮 在實(shí)驗(yàn)條件下，未實(shí)現(xiàn)化合物14 （tR＝35.98 min） 與15 的色譜分離，一級質(zhì)譜上顯示了m／z447.093 5 ［M-H］-準(zhǔn)分子離子峰，與化合物17 互為同分異構(gòu)體，但卻顯示了與17 不同的質(zhì)譜數(shù)據(jù)。表1 顯示，基峰m／z285 為［Y0］-，提示黃酮分子3 位氫未被取代，可能為木犀草素母核，此外還顯示了m／z327.050 8 的碎片離子峰，與文獻(xiàn)［21］報(bào)道一致。結(jié)合對照品信息，鑒定化合物14 為木犀草苷?；衔?8 （tR＝40.90 min） 準(zhǔn)分子離子峰為m／z417.083 5 ［M-H］-，根據(jù)元素組成推測分子式為C21H20O10，碎片離子顯示了m／z269 ［Y0］-的芹菜素母核信息，初步鑒定為芹菜素-7-O-β-吡喃葡萄糖苷［21］。

3.3 抗菌活性 結(jié)果見圖2。在質(zhì)量濃度為2 mg／mL時(shí)，通奶草乙酸乙酯提取物對金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑為（9±0.2） mm ［陽性對照為（31±0.2） mm］，見圖2A；對大腸桿菌為（8±0.3） mm ［陽性對照為（30±0.3） mm］，見圖2B；MIC 值分別為90、100 μg／mL，表明萃取物對兩者具有一定的抑制作用。

圖2 通奶草乙酸乙酯萃取物抗菌活性實(shí)驗(yàn)

4 討論

LC-MS／MS 聯(lián)用技術(shù)用于復(fù)雜天然成分分析，具有快速、高效、靈敏等特點(diǎn)［22］，是研究中草藥等天然藥物的有力工具。本研究采用UPLC-MS／MS 聯(lián)用技術(shù)，結(jié)合對照品對照，鑒定了通奶草乙酸乙酯萃取物的21 種成分，以可水解鞣質(zhì)和黃酮類化合物為主，基本闡明通奶草乙酸乙酯萃取部位的成分組成。通奶草中所含化合物類型及種類與同屬植物地錦草［19］及同科植物烏桕［23］等相似，表明同科特別是同屬植物之間的化學(xué)成分存在共性，這對于開發(fā)藥用資源具有重要意義。本研究所鑒定的諸多化合物具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗病原微生物、降血糖等多種生物活性，對于揭示通奶草藥效物質(zhì)基礎(chǔ)具有一定意義。沒食子酸對早幼粒細(xì)胞白血?。℉L-60RG）、人胃癌細(xì)胞（KATOⅢ）和結(jié)腸腺癌細(xì)胞（COLO 205） 均有抑制作用［24］；老鸛草素對單純皰疹病毒（HSV-1 和HSV-2） 具有顯著抑制活性［25］；鞣花酸對CCl4誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與抗炎和抗氧化有關(guān)［26］；金絲桃苷能有效抑制COX-2 蛋白表達(dá)，逆轉(zhuǎn)炎癥因子對肝細(xì)胞造成的損傷，進(jìn)而保護(hù)肝細(xì)胞［27］；異槲皮苷（15 mg／kg） 可顯著降低四氧嘧啶升高的血糖濃度，其機(jī)制與6-葡萄糖磷脂酶活性抑制以及抗氧化清除自由基密切相關(guān)［28］，這些文獻(xiàn)報(bào)道為通奶草的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。同時(shí)，乙酸乙酯萃取物對2 種常見的革蘭氏致病菌有一定的抑菌作用，對后續(xù)的研究有一定的借鑒意義。