基于熱圖和聚類分析的毛冬青18種無機元素間的相關(guān)性研究

劉 媛，李 敏，陳驍鵬，葉 慧，白鋼鋼，仇雅靜，姚 鑫*，姜 瑋*

1蘇州大學附屬第一醫(yī)院，蘇州 215006；2泰州市食品藥品檢驗所，泰州 225300

毛冬青又名茶葉冬青、密毛假黃楊和密毛冬青，屬冬青科(Aquifoliaceae)冬青屬植物毛冬青(IlexpubescensHook.et Arn.)的干燥根，是我國常用中藥材，藥用價值較高。毛冬青中活性成分主要是三萜類、酚酸類、木脂素類成分，具有抗血栓[1]、降血壓[2]、抗炎[3]、保護心腦血管組織[4,5]的作用，在臨床上主要用于治療冠心病、血栓閉塞性脈管炎、缺血性腦中風、慢性腎炎、小兒急性上呼吸道感染等疾病。中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究的核心除了中藥活性成分之外，藥材中微量元素的探索亦是重要方向，有研究證實藥材中一些無機元素不僅直接參與體內(nèi)調(diào)節(jié)，還與其藥用活性成分產(chǎn)生協(xié)同作用，增強臨床療效[6]。但是隨著科技的進步、工業(yè)的發(fā)展，重金屬及有害元素極大威脅著中藥材生長環(huán)境，對其藥材質(zhì)量造成了極大的損害，更對服用中藥材的人體帶來了潛在的威脅。所以，考察中藥材中無機元素的含量，是全面考察中藥材質(zhì)量的必要手段之一。

中藥材的重金屬測定方法主要有原子吸收光譜法(AAS)，原子熒光光譜法(AFS)，電感耦合等離子體光譜法(ICP-AES)，電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)等。由于ICP-MS靈敏度高、線性范圍寬、抗干擾能力強、分析速度快、同時測定元素多等優(yōu)點，目前已成為國內(nèi)外普遍采用的一種痕量元素分析工具。由于毛冬青產(chǎn)地覆蓋面廣，各地生長環(huán)境相差較大，市售飲片炮制過程又不統(tǒng)一，造成藥材質(zhì)量參差不齊，關(guān)于毛冬青藥材的質(zhì)量評價目前主要集中在皂苷類[7]和黃酮類[8]等活性成分，對無機元素研究報道為零。本實驗采用ICP-MS 法對毛冬青不同產(chǎn)地8份飲片中18種無機元素進行測定，并對測定結(jié)果進行多元統(tǒng)計分析，為傳統(tǒng)中藥的藥理毒理研究提供更科學的理論依據(jù)，為毛冬青藥材的合理應用及安全性評價提供科學依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

THERMO iCAP-Q電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(美國THERMO公司)；Milli-Q超純水處理系統(tǒng)(美國MILLIPORE公司)；CEM MARSCEM MARS 240-50微波消解儀(美國CEM公司)；Mettler XS-105電子分析天平；YB-1500A型高速多功能粉碎機(永康市速峰工貿(mào)有限公司)；IKA?TUBE-MILL試管研磨機(德國IKA公司)。

1.2 試劑與試藥

試劑和標準物質(zhì)：65%優(yōu)級純硝酸(Merck公司)；超純水(Milli-Q超純水處理系統(tǒng))；Al、Ti、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Zn、Zr、Ba、Sn、Sb混合溶液(國家有色金屬及電子材料分析測試中心，批號：17B110，100 μg/mL)；Pb(中國計量科學研究院，批號：15073，1 000 μg/mL)、Cu(中國計量科學研究院，批號：14128，1 000 μg/mL)、Cd(中國計量科學研究院，1 000 μg/mL)、As(中國計量科學研究院，批號：16041，1 000 μg/mL)、Hg(中國計量科學研究院，批號：16083，1 000 μg/mL)；內(nèi)標液：In(中國計量科學研究院，批號：13051，100 μg/mL)，Ge(上海安譜實驗科技股份有限公司，批號：710899486-3，1 000 μg/mL)，Bi(中國計量科學研究院，批號：16031，100 μg/mL)、Sc(國家有色金屬及電子材料分析測試中心，批號：171020，1 000 μg/mL)；金標準溶液(上海安譜實驗科技股份有限公司，批號：166660-4，1 000 μg/mL)；調(diào)諧液：17Li，59Co，89Y，140Ce，205Tl(美國Agilent公司，0.1 μg/L)；標準參考物質(zhì)黃芩(國家標準物質(zhì)研究中心)。

毛冬青樣品購買自各個飲片生產(chǎn)企業(yè)，均經(jīng)泰州市食品藥品檢驗所葉慧副主任中藥師鑒定為冬青科冬青屬植物毛冬青IlexpubescensHook.&Arn.的干燥根。詳細樣品信息見表1。

表1 不同產(chǎn)地毛冬青樣品信息

2 方法

2.1 ICP-MS 工作條件

經(jīng)優(yōu)化的ICP-MS工作參數(shù)為：等離子體射頻功率1.5 kW，冷卻氣、載氣、輔助氣流量分別為14、0.91和0.8 L/min，采樣深度5 mm，蠕動泵轉(zhuǎn)數(shù)為40 rpm，采用全定量分析模式。

2.2 對照品溶液的制備

吸取多元素標準溶液，用10%硝酸溶液稀釋制成含Al、Ti、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Zn、Zr、Ba、Sn、Sb質(zhì)量濃度均為1 mg/L的對照品儲備液。配制成含上述各元素質(zhì)量濃度分別為0、0.1×10-3、0.5×10-3、2×10-3、10×10-3、20×10-3、50×10-3、100×10-3mg/L的對照混合溶液1；吸取適量的Pb、Cu、As、Cd元素標準溶液，稀釋制成分別含Pb、As、Cd元素0.5 mg/L，Cu元素2.5 mg/L的對照品儲備液，再精密吸取對照品儲備液，用10%硝酸溶液依次稀釋，配制成含Pb、As、Cd元素質(zhì)量濃度分別為0、1×10-3、5×10-3、10×10-3、20×10-3mg/L，含Cu元素質(zhì)量濃度為0、5×10-3、25×10-3、50×10-3、100×10-3mg/L的對照混合溶液2；精密吸取Hg元素標準溶液適量，用2%硝酸溶液稀釋制成0.1 mg/L的對照品儲備液，再用2%硝酸溶液稀釋成含元素質(zhì)量濃度為0、0.5×10-3、1×10-3、1.5×10-3、2×10-3、2.5×10-3mg/L的對照溶液3。

2.3 內(nèi)標溶液的配制

分別精密吸取Ge、Sc、In、Bi單元素適量，用2%硝酸溶液配置成質(zhì)量濃度分別為50 μg/mL的混合對照溶液，作為內(nèi)標溶液。

2.4 供試品的制備

取8批不同樣品，打粉，過二號篩得粗粉，每份稱取樣品0.5 g，置洗凈干燥的聚四氟乙烯消解罐中，精密加入硝酸5 mL，置90 ℃的加熱板上預消解30分鐘，靜置12小時后加蓋密封，裝入微波消解儀中。根據(jù)植物類中藥材及飲片特點以及查閱相關(guān)資料，采取以下消解條件：第一步消解功率800 W，在10 min內(nèi)溫度由室溫升至120 ℃，保持5 min；第二步消解功率800 W，在5 min內(nèi)溫度由120 ℃升至150 ℃，保持5 min；第三步消解功率1 600 W，在20 min內(nèi)溫度由150 ℃升至180 ℃，保持5 min。消解完全后，取出消解罐，置90 ℃的加熱板上趕酸約2小時以上，待消解液冷卻至室溫。將冷卻至室溫的消解液轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，用少量水洗滌消解罐3次，洗滌液合并于量瓶中，加入金單元素標準溶液(1 μg/mL)200 μL，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。除不加金單元素標準溶液外，同法制備試劑空白溶液。

2.5 標準曲線的制備

將“2.2項”下的對照品混合溶液1、2，對照品溶液3，分別進樣分析。以對照品的濃度為橫坐標，測量值(3次得數(shù)的平均值)為縱坐標，繪制標準曲線，得到各元素的線性方程和相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見表2。

表2 18種無機元素的線性關(guān)系

2.6 檢出限的測定

取空白溶液進行測試，連續(xù)進樣11次，以空白溶液計算出各元素的標準偏差(SA)，按QL(n=3)=3×SA/S計算檢出限，其中SA為標準偏差，S為標準曲線的斜率。儀器檢出限指在一定的置信范圍內(nèi)能與儀器噪音相區(qū)別的最小檢測信號對應的待測物質(zhì)的量，計算公式為DL(mg/kg)=3×SA×1/S；方法檢出限指在特定儀器條件下，以合理的置信水平測定被測物的最小濃度值，計算公式為CL(mg/kg)=3×SA×1/S×50×10-6×1/(0.5×10-3)。根據(jù)以上兩個公式計算出儀器、方法檢出限，結(jié)果18種無機元素的檢出限均能很好的滿足分析要求，見表3。

表3 18種無機元素的標準偏差(SA)及檢出限

2.7 精密度試驗

取將“2.2項”下的對照品混合溶液1和2，對照品溶液3，連續(xù)進樣6次，記錄結(jié)果?？梢姼鞒煞志芏萊SD在0.67%～2.98%，結(jié)果見表2。

2.8 重復性試驗

選取毛冬青S8樣品，稱取約0.25 g，精密稱定，根據(jù)“2.4”項下方法平行制備6份供試品溶液，測定，計算，可見各成分重復性RSD在0.58%～3.59%。結(jié)果見表2。

2.9 穩(wěn)定性試驗

選取毛冬青S8樣品，稱取約0.25 g，精密稱定，按照“2.4”項下方法制備供試品溶液，分別于0、1、2、4、6、8、10、12 h測定，計算各無機元素RSD值，結(jié)果見表2?？梢姼鞒煞址€(wěn)定性RSD在1.56%～4.02%。

2.10 加樣回收率

選取毛冬青S8樣品，稱取0.25 g，精密稱定，加入混合對照品溶液，按照“2.4”項下的方法制備加樣回收率溶液，扣除本地值后，用ICP-MS測定各元素的回收率，各元素的回收率為82.4%～110.8%，相對標準偏差為1.2%～11.7%。

3 結(jié)果

3.1 樣品測定

采用上述微波消解法-ICP-MS法，精密稱取8批毛冬青飲片各0.5 g，按照上述方法進行測定，通過內(nèi)標校正的標準曲線法計算樣品中18種無機元素的含量，結(jié)果見圖1、表4。

表4 不同產(chǎn)地毛冬青樣品中18種無機元素測定結(jié)果

圖1 不同產(chǎn)地毛冬青中無機元素含量對比圖

3.2 無機元素的相關(guān)性分析

中藥材中無機元素的分析，可采用相關(guān)性分析用以衡量不同元素之間是否具有協(xié)同或者拮抗作用。本研究采用SPSS 23.0 軟件對毛冬青中18種無機元素進行相關(guān)性分析，采用皮爾孫相關(guān)系數(shù)法(該方法主要用于度量兩個變量之間的相關(guān)程度)，統(tǒng)計結(jié)果見表5，統(tǒng)計結(jié)果共有6對元素顯著性負相關(guān)(P<0.01)，4對元素負相關(guān)(P<0.05)；79對元素顯著性正相關(guān)(P<0.01)，60對元素正相關(guān)(P<0.05)。如：As與V和Sb均呈極顯著性正相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)分別為0.835(P<0.01)和0.867(P<0.01)；Cu與Cd、Pb及Zn均呈極顯著性負相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)分別為-0.812(P<0.01)、-0.915(P<0.01)和-0.839(P<0.01)。

表5 不同產(chǎn)地毛冬青中18種無機元素的皮爾遜相關(guān)性分析

3.3 無機元素的熱圖和聚類分析

熱圖(heat map)是近年來被廣泛應用于數(shù)據(jù)挖掘的方法之一，其原理是在聚合大量試驗數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，以一種漸進的藍紅色帶直觀的將結(jié)果展現(xiàn)出來，借此可以看出數(shù)據(jù)的疏密和頻率高低程度，以及重點研究對象的地區(qū)差異變化。本文通過根據(jù)8批不同產(chǎn)地毛冬青18種無機元素各自的比值，利用Image GP網(wǎng)頁制圖工具繪制熱圖，見圖2。由圖2熱圖可見8批不同產(chǎn)地毛冬青樣品呈現(xiàn)出一定的聚類性特征，可以按產(chǎn)地劃分為4類：第Ⅰ類為S1(江西)、S2(廣西)，這2組資源中Cd、Cr比值差異是4組類別中最大的，值得注意的是As、Hg比值亦較高，其它常量及微量元素比值較為平均；第Ⅱ類為S3(安徽)、S8(浙江)，這2組資源中各種無機元素較為平均，Cu比值較高；第Ⅲ類為S4(福建)、S6(廣東)、S7(廣東)，這3組資源中Cd比值是4組類別中第2高的，其它元素相對來說差異不大；第Ⅳ類為S5(海南)，這組資源中所有元素比值是4組類別中最低的，差異均不大。由此可見8批毛冬青樣品中無機元素含量受不同產(chǎn)地土壤、水質(zhì)、氣候等因素的影響比較明顯。

圖2 無機元素含量的熱圖分析

4 討論

本文采用了ICP-MS法對8組資源毛冬青進行了18種無機元素的測定，根據(jù)元素的分類，對文中所測元素進行分類，人體必需微量元素為Mn、Ti、Cr、Sn、Ni、Fe、Zn，有害微量元素為Pb、Hg、As、Cd、Cu、Ba、Sb、Al，其他元素為V、Co、Zr。從表4看，人體必需微量元素Mn、Ti、Cr、Sn、Ni、Fe、Zn元素均檢出且含量不低，而Cr、Ni、V等元素有利于冠心病治療[9]，毛冬青中具有測出了不低的Cr、Ni、V元素，Cr、Ni元素測定值甚至大于2 mg/kg，這與其具有治療冠心病的作用是相符的；而Fe、Zn元素具有較強的活血作用，毛冬青中Fe為89.77 mg/kg，Zn為74.35 mg/kg，這與其臨床上治療血栓閉塞性脈管炎、缺血性腦中風相符。但現(xiàn)代研究證實過量的無機元素亦會對人體造成不良影響，例如Mn過量會造成人暴躁易怒，而毛冬青中Mn檢出平均值最高，達到了118.12 mg/kg。

《中國藥典》2015年版一部規(guī)定了丹參、西洋參、黃芪、甘草等藥材中鉛不得過5 mg/kg、砷不得過2 mg/kg、鎘不得過0.3 mg/kg、汞不得過0.2 mg/kg、銅不得過20 mg/kg[10]。由表4可見8批毛冬青中Pb、Cd、As、Hg、Cu均檢出，平均值分別為5.85、0.05、0.033、0.012、2.11 mg/kg。與藥典規(guī)定限度比較，筆者發(fā)現(xiàn)其中毛冬青中Pb元素超出了標準規(guī)定的限度，而過量的Pb進入人體后，只有少量會隨著體液排除，大部分會集聚在體內(nèi)，易造成貧血、動脈硬化等疾病。此外，藥典中未規(guī)定限度的Ba元素的測定值也較高，8批平均值為35.13 mg/kg，而Ba元素中毒會造成心肌中毒、心律失常及嚴重低血鉀。由此可見，建立合適的重金屬及有害元素控制方法是迫切而必須的。

近年來，對中藥材中無機元素的測定已經(jīng)得到越來越廣泛的關(guān)注，尤其是不同產(chǎn)地中藥材無機元素含量差異較大，這從側(cè)面可反應出我國土壤、水質(zhì)、氣候等環(huán)境因地理及科技發(fā)展帶來的差距，所以在選擇中藥材道地不道地的時候，亦需要將重金屬作為考察指標之一[11]。減少中藥材的重金屬污染除了從源頭上防治污染以外，也可以在中醫(yī)藥理論指導下深入研究，采取合理炮制方法降低其含量。這對保證中藥材質(zhì)量，保障中藥用藥安全具有極大意義。本文對考察毛冬青藥材有效性及安全性提供了一定幫助。