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    趕黃草總黃酮對活化的肝星狀細(xì)胞TGF-β1/Smads信號通路的影響

    2020-07-29 08:53:06謝曉芳李夢婷
    關(guān)鍵詞:黃草星狀膠原

    余 蕾,謝曉芳,彭 芙,謝 君,李夢婷,彭 成,

    1成都中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,成都 610075;2四川大學(xué)藥學(xué)院,成都 610021;3西南特色中藥資源國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,成都 611137

    肝纖維化是一種世界性的常見病疾病,以肝內(nèi)纖維結(jié)締組織的異常增生為病理特征,主要是由于酒精肝、脂肪肝、病毒性肝炎、膽汁淤積性和代謝性肝損傷等刺激肝臟產(chǎn)生慢性炎癥,誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞活化,致使ECM的過度積累,從而導(dǎo)致肝纖維化[1-3]。目前,肝纖維化的治療主要通過抗炎、抗病毒、減少ECM沉積等方式,但這些治療效果并不理想,因此尋找有效的抗纖維化方法仍是當(dāng)前的首要任務(wù)。

    趕黃草又名水澤蘭、水楊柳等,是虎耳草科扯根菜屬植物扯根菜(PenthorumchinensePursh)的干燥地上部分,始載于明代《救荒本草》[4],具有清熱活血、祛濕退黃、利水消腫等功效,可用于黃疸,水腫,跌打腫傷,以及各型肝炎、膽囊炎、脂肪肝等[5]。臨床上有文獻(xiàn)報(bào)道以趕黃草制成的單味成方制劑“肝蘇顆?!蹦苊黠@改善慢性乙肝肝纖維化患者臨床癥狀,具有降酶、退黃、促進(jìn)肝功能恢復(fù)等作用,且對阻斷及逆轉(zhuǎn)肝纖維化有一定療效[6,7]。課題組前期研究也證明“肝蘇顆?!睂Cl4誘導(dǎo)所致的大鼠肝纖維化有顯著的治療作用,可改善肝功能、減輕肝臟纖維化病變?,F(xiàn)代研究表明,趕黃草中主要含有黃酮、生物堿、多糖等成分,因黃酮成分含量較高且具有較強(qiáng)的抗氧化活性所以被廣泛研究[8]。目前已有研究表明趕黃草總黃酮可抑制大鼠酒精性肝纖維化的形成,其抗肝纖維化作用可能與其抗氧化作用及抑制TNF-α和IL-6的分泌有關(guān)[5]。但是,趕黃草總黃酮治療肝纖維化的具體作用機(jī)制尚不清楚,因此,本實(shí)驗(yàn)選用LX-2作為研究對象,采用TGF-β1刺激LX-2活化建立肝纖維化細(xì)胞模型,研討趕黃草總黃酮抗肝纖維化的作用及可能的機(jī)理。

    1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

    1.1 實(shí)驗(yàn)藥物

    黃草總黃酮(total flavonoids ofPenthorumchinensePursh,TFPCP),趕黃草購于四川新荷花中藥飲片股份有限公司,由成都搏屹科技有限公司提取,測得提取物中總黃酮的含量為55.3%。實(shí)驗(yàn)前將趕黃草總黃酮粉末溶于二甲基亞砜(DMSO)中,使用時(shí)稀釋成所需濃度,各給藥組中DMSO濃度均小于0.1%。

    表1 趕黃草總黃酮含量測定結(jié)果

    1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

    HSC-LX2(蘇州北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司,貨號:BNCC337957)。

    1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

    Human TGF-β1(美國Pepro Tech 公司)、FBS(美國Gibco公司)、RPIM-1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)、MTT(德國Biofroxx公司)、Ⅰ型鼠尾膠原(杭州欣友生物技術(shù)有限公司)、α-SMA(Actin alpha,smooth muscle aorta)、FN、Col Ⅰ酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(武漢Elabscience 公司)、兔抗Smad7多克隆抗體(美國Proteintech公司)、兔抗Smad2、phospho-Smad2、Smad3、phospho-Smad3、α-SMA抗體(美國Cell Signaling Technology公司)、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

    1.4 實(shí)驗(yàn)儀器

    二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo公司)、酶標(biāo)定量分析儀(Thermo公司)、MiLL-Q純水儀(Millipore公司)、SW-CJ-1F型潔凈工作臺(蘇凈安泰集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)、倒置顯微鏡(德國蔡司公司)、電泳儀(Bio-Rad公司)、凝膠成像儀(廣州博鷺滕公司)。

    2 實(shí)驗(yàn)方法

    2.1 細(xì)胞分組及處理

    LX2細(xì)胞用含10% FBS和1%青-鏈霉素的RPIM-1640培養(yǎng)基培養(yǎng),培養(yǎng)條件為:37 ℃、5% CO2,取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中將趕黃草總黃酮藥物濃度設(shè)定為5、10、15、20 mg/L時(shí),發(fā)現(xiàn)濃度超過15 mg/L細(xì)胞毒性較大,而在濃度為10 mg/L時(shí)細(xì)胞存活率較高,故降低濃度間距,采用5、9、13 mg/L三個(gè)濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞分為空白對照組、TGF-β1組、TGF-β1+趕黃草總黃酮5、9、13 mg/L組,除空白對照組以外,其余各組均使用TGF-β1(6 ng/L)處理24 h造模,造模成功后給予不同濃度的趕黃草處理24 h。

    2.2 細(xì)胞活力測定

    將細(xì)胞消化并重懸,調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/mL,以每孔100 μL接種于96孔板,次日晨給予TGF-β1,作用24 h后分別給予不同濃度的趕黃草總黃酮,給藥結(jié)束后每孔加入5 mg/mL的MTT溶液15 μL,避光孵育4 h后將細(xì)胞液全數(shù)吸出,每孔加入150 μLDMS0,搖床上震蕩混勻,用酶標(biāo)儀在波長為570 nm處測量OD值(A),計(jì)算細(xì)胞存活率:細(xì)胞存活率=(給藥組A-調(diào)零孔A)/(空白組A-調(diào)零孔A)×100%。

    2.3 細(xì)胞劃痕試驗(yàn)

    用標(biāo)記筆在6孔板背面等距離畫3條間隙為0.5 cm的虛線,用于后續(xù)拍照選取視野時(shí)定位。以1×106個(gè)/mL種板,次日給予TGF-β1造模,24 h后用10 μL的槍尖沿背面虛線在孔底畫線,然后將培養(yǎng)液吸出,用無菌PBS輕輕沖洗將細(xì)胞碎片洗掉,分別加入含有不同濃度的趕黃草總黃酮的培養(yǎng)基,此時(shí)顯微鏡下選取視野進(jìn)行拍照。培養(yǎng)24 h后,選擇與第一次拍照相同的視野再次拍照。用Image J軟件測量劃痕的寬度。

    2.4 細(xì)胞分泌ECM含量測定

    將細(xì)胞以1×105個(gè)/mL接種于24孔板,藥物作用完畢后將細(xì)胞上清液收集起來,離心去除細(xì)胞雜質(zhì),然后4 ℃保存?zhèn)溆茫谝恢軆?nèi)檢測。檢測具體操作方法按ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。

    2.5 膠原收縮試驗(yàn)

    因LX-2活化后產(chǎn)生的ECM可使膠原收縮,增加血管阻力、促進(jìn)門脈高壓[9],故可通過體外建立三維膠原,研究趕黃草總黃酮對膠原收縮的影響。將Ⅰ型鼠尾膠原以300 μL/孔鋪滿24孔板底,待膠原凝固后每孔加500 μL培養(yǎng)液平衡膠原。將細(xì)胞將細(xì)胞以1×105個(gè)/mL接種于板內(nèi),造模完成后用槍頭沿膠原邊緣劃一圈,使膠原與板壁分離,然后給藥處理,藥物作用完畢后進(jìn)行拍照,觀察膠原收縮情況。

    2.6 TGF-β1/Smads信號通路相關(guān)蛋白測定

    細(xì)胞培養(yǎng)完成后用冰PBS清洗3遍,刮取細(xì)胞后離心,向沉淀中加入含有1%磷酸酶抑制劑和1%蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液在冰上裂解30 min提取總蛋白;測定蛋白濃度后進(jìn)行SDS-PAGE電泳,PVDF膜轉(zhuǎn)移,用5% BSA室溫封閉1 h,一抗4 ℃中過夜;次日用TBST洗三次后,每次8 min;二抗室溫孵育1 h,然后TBST洗三次,用凝膠成像儀曝光并拍照。用Image J測量條帶的灰度值。

    2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    3.1 趕黃草總黃酮對TGF-β1活化的LX-2細(xì)胞活力的影響

    如圖1所示,與空白組相比,TGF-β1處理可促進(jìn)細(xì)胞增殖(P<0.05),而給予藥物作用后,各組細(xì)胞增殖均降低,且藥物濃度越高,抑制作用越明顯,在9 mg/L時(shí)有顯著抑制作用(P<0.05)。說明趕黃草總黃酮可抑制TGF-β1活化后的LX-2的增殖。

    圖1 趕黃草總黃酮對TGF-β1活化后的LX-2細(xì)胞活力的影響

    3.2 趕黃草總黃酮對TGF-β1活化的LX-2細(xì)胞遷移和膠原收縮能力的影響

    表2與圖2示,與空白組相比,TGF-β1刺激后,細(xì)胞劃痕愈合率明顯增加(P<0.01);而在給藥處理的各組中,劃痕愈合率與單純給TGF-β1組相比明顯降低,在9 mg/L時(shí)抑制作用顯著(P<0.01),說明趕黃草總黃酮可抑制LX-2的遷移。

    圖2 趕黃草總黃酮對TGF-β1活化后LX-2細(xì)胞遷移的影響

    表2 趕黃草總黃酮對TGF-β1活化后的LX-2后的劃痕愈合率

    如圖4示,與空白組相比,單純給予TGF-β1刺激組,膠原收縮明顯增加,而趕黃草總黃酮作用后的各組與單純TGF-β1組相比較,膠原的收縮被明顯抑制,作用效果呈劑量依賴,在9 mg/L時(shí)抑制用顯著(P<0.01)。

    圖3 趕黃草總黃酮對TGF-β1活化后LX-2細(xì)胞膠原收縮的影響

    圖4 趕黃草總黃酮對TGF-β1活化的LX-2細(xì)胞分泌FN和Col I含量的影響

    3.3 趕黃草總黃酮對TGF-β1活化的LX-2分泌FN和Col I含量的影響

    圖4結(jié)果顯示,與空白對照組相比,TGF-β1刺激后,細(xì)胞分泌FN及ColⅠ顯著增加(P<0.01),而在給予藥物作用的各組里,F(xiàn)N及ColⅠ含量顯著減少(P<0.01),說明趕黃草總黃酮可抑制FN及ColⅠ的沉積。

    3.4 趕黃草總黃酮對TGF-β1活化的LX-2細(xì)胞TGF-β1/Smads 信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

    圖5結(jié)果顯示 在給予TGF-β1作用后,α-SMA分泌明顯增加(P<0.05),而給予藥物作用后,α-SMA分泌被抑制。另外,TGF-β1作用后,Smad3、p-Smad2和p-Smad3均顯著增加(P<0.01),而給予藥物作用后,其表達(dá)均有不同程度減少;Smad7在TGF-β1作用后則顯著減少(P<0.05),而給予不同濃度藥物作用后Smad7的分泌有一定程度的提升,且在藥物濃度達(dá)到9 mg/L時(shí),差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

    圖5 趕黃草總黃酮對TGF-β1活化的LX-2細(xì)胞分TGF-β1/Smads 信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

    4 討論

    HSC-LX2是分布在肝臟各處的常駐的周圍型細(xì)胞,在肝損傷過程中,LX-2被激活成肌成纖維細(xì)胞,產(chǎn)生大量α-SMA、ColⅠ等ECM,從而導(dǎo)致肝纖維化[10-13]。TGF-β1是一類能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化的因子,可活化肝星狀細(xì)胞,促進(jìn)膠原基因表達(dá)、增加ECM沉積,是最重要的促肝纖維化細(xì)胞因子之一[14,15]。TGF-β1主要通過TGF-β1/Smads信號通路促進(jìn)肝纖維化發(fā)展,TGF-β1與肝星狀細(xì)胞表面受體結(jié)合,然后催化其下游Smad分子磷酸化,接著,磷酸化的Smad進(jìn)入細(xì)胞核,調(diào)節(jié)其相應(yīng)靶基因的轉(zhuǎn)錄,導(dǎo)致ECM產(chǎn)生[16,17]。Smad家族中Smad2和Smad3為受體激活型蛋白,可促進(jìn)肝纖維化的進(jìn)程;而Smad7則是一種抑制型蛋白,過表達(dá)可阻止Smad2和Smad3的磷酸化,抑制信號通路,減緩肝纖維化進(jìn)程[18]。

    本實(shí)驗(yàn)中,體外培養(yǎng)的LX-2在TGF-β1刺激后,細(xì)胞增殖及遷移速率顯著增加,F(xiàn)N、Col I等細(xì)胞外基質(zhì)大量沉積,膠原收縮明顯增加,說明TGF-β1誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞活化建立肝纖維化模型成立。而在給予趕黃草總黃酮處理后,細(xì)胞增殖和遷移速率被抑制,細(xì)胞外基質(zhì)的沉積顯著減少,膠原收縮明顯降低,說明趕黃草總黃酮可抑制肝星狀細(xì)胞的活化,減少細(xì)胞外基質(zhì)的沉積,降低血管阻力,減緩肝纖維化的發(fā)展進(jìn)程。此外,Western blot實(shí)驗(yàn)表明,TGF-β1作用后,Smad3、p-Smad2和p-Smad3表達(dá)均顯著增加,Smad7表達(dá)則顯著減少,可以說明TGF-β1/Smads信號通路被激活,而在給予趕黃草總黃酮處理后,Smad3、p-Smad2、p-Smad3表達(dá)均明顯減少,Smad7的表達(dá)則明顯提升,說明趕黃草可抑制TGF-β1/Smads信號通路。

    綜上所述,趕黃草總黃抑制肝星狀細(xì)胞的增殖和遷移,減少ColⅠ及FN等細(xì)胞外基質(zhì)的沉積,機(jī)制與其抑制TGF-β1/Smads信號通路有關(guān)。這可能是趕黃草治療肝纖維化的機(jī)制之一。

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