鳳丹愈傷組織培養(yǎng)體系建立及丹皮酚含量測定

王若馨，紀楠楠，王華芳*

1北京林業(yè)大學林木育種國家工程實驗室；2北京林業(yè)大學生物科學與技術學院，北京 100083

鳳丹(PaeoniaostiiT.Hong et J.X.Zhang var.lishizheniiB.A.Shen)屬芍藥科芍藥屬牡丹組(Paeoniasect.Moutan)楊山牡丹變種[1]，明末崇禎年間安徽銅陵縣開始引種栽培沿用至今[2]。鳳丹根皮(丹皮)的有效成分丹皮酚為我國傳統(tǒng)道地藥材，已入《中國藥典》[3]，是六味地黃丸等的主要成分，具有清熱涼血、活血化瘀、抗菌消炎、鎮(zhèn)靜降溫、解痙、抗動脈粥樣硬化、利尿、抗?jié)僛4-6]等多種藥理作用，是植物藥研究的熱點之一。天然丹皮酚主要取自鳳丹根皮，道地藥材局限于安徽銅陵，田間栽培需不少于5年，生產(chǎn)周期長且占用土地多等諸多因素的限制[7]。化學合成法生產(chǎn)丹皮酚操作簡便，成本低廉，但化學過程產(chǎn)生的少量副產(chǎn)物，長期服用可能影響人體健康[8]。細胞工程技術根據(jù)生物學和工程學原理，以細胞為生物反應器生產(chǎn)丹皮酚，有效減少地域依賴和自然因素限制，縮短生產(chǎn)周期，提高生產(chǎn)效率以滿足社會的健康需求，是丹皮酚生物技術制藥發(fā)展的方向[9]。

目前，植物細胞工程技術制藥途徑主要通過建立愈傷組織或懸浮細胞培養(yǎng)體系，生產(chǎn)離體細胞用于提取藥用成分[10]，因此建立鳳丹愈傷組織培養(yǎng)體系為丹皮酚規(guī)?；迫〉於ɑA。鳳丹愈傷組織培養(yǎng)體系的研究報道始于2002年[11]，隨后常以葉柄[12]、莖段[13]等為外植體獲得鳳丹愈傷組織。Wei[12]以單因素試驗建立鳳丹愈傷組織增殖體系，增殖系數(shù)達2.86，并且發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中添加6-BA 1.0 mg/L、NAA 1.0 mg/L時丹皮酚含量最高，添加高濃度Cu2+較利于丹皮酚積累。Zhang[13]以單因素試驗證實適量濃度的Ca2+、Cu2+及Phe等可提高鳳丹愈傷組織中丹皮酚的含量。目前，鳳丹愈傷組織培養(yǎng)體系依然存在易污染、易褐化、增殖緩慢等問題，阻礙了次生代謝產(chǎn)物丹皮酚的生產(chǎn)；并且未見關于鳳丹愈傷組織生長曲線及確定丹皮酚取材時期的相關研究，因此無法進行規(guī)?；^代及丹皮酚生產(chǎn)參數(shù)設計。

本研究以鳳丹種子胚為外植體，優(yōu)化愈傷組織培養(yǎng)體系，包括培養(yǎng)基類型、植物生長調(diào)節(jié)劑、有機添加物、pH值、瓊脂濃度及繼代周期等影響因素；篩選愈傷組織增殖最佳條件，建立培養(yǎng)體系；測定愈傷組織在培養(yǎng)條件下的生長和丹皮酚含量，基于生長曲線，確定丹皮酚積累最佳培養(yǎng)周期和收獲期，為細胞工程生產(chǎn)丹皮酚提供必需基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

鳳丹(PaeoniaostiiT.Hong et J.X.Zhang var.lishizheniiB.A.Shen)母株種植于北京順義種植基地(北緯40.2°，東經(jīng)116.5°，年平均降水量610 mm，年平均氣溫11.5 ℃，最低溫度-19.1 ℃，最高溫度42.0 ℃)。2017年8月選擇生長健壯、無病蟲害母株，采集成熟飽滿的鳳丹種子，室內(nèi)陰干，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 無菌培養(yǎng)體系的建立

外植體表面消毒以70%乙醇(V/V)消毒時間、消毒劑有效氯濃度及消毒時間設計3因素3水平L9(34)正交實驗，鳳丹種子剝除種皮置于250 mL培養(yǎng)瓶內(nèi)，紗布封口，自來水沖洗20 min。于超凈工作臺上，70%乙醇溶液浸泡0.5、1.0、2.0 min，以有效氯濃度0.5%、1.0%、1.5%的二氯異氰尿酸鈉消毒液(含0.1%吐溫-80)浸泡10、20、30 min，無菌水清洗3次，每次3 min。無菌濾紙瀝干表面水分，接種在MS培養(yǎng)基上，按泊松分布，每處理接種30粒去皮種子，重復3次，14天后統(tǒng)計去污染率。培養(yǎng)條件為24±1 ℃，黑暗培養(yǎng)。

去污染率=(1-污染種子數(shù)/接種種子數(shù))

×100%

1.2.2 鳳丹胚誘導愈傷組織

以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，分別添加6-BA 0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L，2,4-D 2.0 mg/L，蔗糖30 g/L，pH 6.3，瓊脂6 g/L。在超凈臺上，用解剖刀將鳳丹去皮種子切開，取出胚，接種在上述培養(yǎng)基上。按泊松分布，每處理接種30個胚，重復3次，30天后統(tǒng)計愈傷組織誘導率。

愈傷組織誘導率=發(fā)生愈傷組織的胚個數(shù)/

接種的胚個數(shù)×100%

注：愈傷組織塊≥0.5 cm×0.5 cm×0.5cm計為一個發(fā)生事件。

1.2.3 愈傷組織的增殖

1.2.3.1 培養(yǎng)基、6-BA及NAA濃度優(yōu)化

選取生長狀況良好(乳白色、質(zhì)地緊實，生長迅速)的愈傷組織為培養(yǎng)材料，以基本培養(yǎng)基類型、細胞分裂素6-BA和生長素NAA濃度設計3因素3水平L9(34)正交實驗，基本培養(yǎng)基MS、1/2 MS、改良WPM[11]，6-BA 0.6、1.2、1.8 mg/L，NAA 0.6、1.2、1.8 mg/L，蔗糖30 g/L，瓊脂6 g/L，pH 5.8。按泊松分布，每處理接種30塊愈傷組織，在超凈工作臺上，將愈傷組織塊置于分析天平上稱重，每塊0.1 g左右，重復3次，30天后統(tǒng)計愈傷組織增殖倍數(shù)及褐化率。

增殖倍數(shù)=(30天后愈傷組織質(zhì)量-接種

時的質(zhì)量)/接種時的質(zhì)量

褐化率=褐化的愈傷組織塊數(shù)/

接種的塊數(shù)×100%

1.2.3.2 其他條件優(yōu)化

采用單因素實驗，確定水解酪蛋白CH(0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g/L)、pH值(4.8、5.3、5.8、6.3、6.8、7.3、7.8、8.3)、瓊脂(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 g/L)、繼代周期(20、25、30、35、40天)對愈傷組織增殖的影響及適宜條件。選擇生長旺盛、有光澤的愈傷組織，切成每塊0.1 g左右，接種在不同的愈傷組織增殖培養(yǎng)基上，按泊松分布，每處理接種30塊愈傷組織，重復3次，30天后統(tǒng)計愈傷組織增殖倍數(shù)及褐化率。

1.2.4 愈傷組織生長過程中丹皮酚含量測定

丹皮酚含量的測定方法參考Yang等[14]的方法。以上述優(yōu)化的最佳愈傷組織增殖體系，分別于接種5、10、15、20、25、30、35、40天，去除表面瓊脂，稱量愈傷組織鮮重，50 ℃烘干至恒重后于4 ℃保存，以培養(yǎng)時間為橫坐標，愈傷組織鮮重和丹皮酚含量為縱坐標繪制曲線。

稱取約0.1 g烘干后的愈傷組織于研缽中研磨成粉末，無水乙醇定容至10 mL，混勻。50 ℃水浴2 h，100 W超聲處理30 min，靜置過夜，吸取0.1 mL樣品上清液，稀釋300倍后，分光光度計測定274 nm處吸光值，每個樣品3個生物學重復，3個技術重復，以丹皮酚標準品(購于試劑公司，純度>98%)繪制標準曲線，計算樣品的丹皮酚含量。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

以EXCEL 2010計算數(shù)據(jù)標準誤差，IBM Statistical Package for Social Sciences 19.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析和Duncan多重檢驗。

2 結果與分析

2.1 鳳丹種子表面消毒

鳳丹種子表面消毒的結果如表1所示，消毒劑有效氯濃度及消毒時間對鳳丹種子去污染率的影響顯著，而70%乙醇消毒時間則影響不顯著(P<0.05)。消毒劑有效氯濃度1.0%和1.5%去污染率顯著高于0.5%，而1.0%與1.5%的去污染率無顯著性差異；種子消毒劑消毒20和30 min的去污染率顯著高于消毒10 min，20與30 min對去污染率無顯著性影響。綜合考慮經(jīng)濟及時間因素，鳳丹種子表面消毒的最佳組合為70%乙醇消毒2.0 min，有效氯濃度1.0%的二氯異氰尿酸鈉消毒液浸泡20 min，去污染率高達97.78%。

表1 70%乙醇消毒時間、有效氯濃度及消毒時間對鳳丹種子表面消毒的影響

2.2 鳳丹胚愈傷組織誘導

植物生長調(diào)節(jié)劑6-BA濃度顯著影響鳳丹胚愈傷組織誘導率(P<0.05)(圖1)，胚誘導愈傷組織的過程中，接種在培養(yǎng)基上3天后子葉張開，11天后出現(xiàn)愈傷化，隨著培養(yǎng)時間延長愈傷組織不斷增殖(圖2)。6-BA 0.5、1.0、1.5 mg/L對愈傷組織誘導率無顯著性差異，且均顯著高于6-BA 2.0 mg/L；其中，培養(yǎng)基中添加6-BA 1.5 mg/L的愈傷組織誘導率最高，達90.00%。

圖2 鳳丹成熟胚愈傷組織誘導過程

圖1 6-BA濃度對鳳丹胚誘導愈傷組織的影響

2.3 鳳丹胚愈傷組織增殖

2.3.1 培養(yǎng)基、NAA及6-BA濃度對愈傷組織增殖的影響

培養(yǎng)基類型、6-BA及NAA濃度對愈傷組織增殖的影響如表2所示，培養(yǎng)基對愈傷組織增殖倍數(shù)影響顯著，而6-BA和NAA濃度影響不顯著(P<0.05)，在MS和改良WPM培養(yǎng)基上，愈傷組織增殖倍數(shù)顯著高于1/2 MS，但MS和改良WPM無顯著性差異。培養(yǎng)基類型對愈傷組織褐化率均具有顯著性影響(P< 0.05)。在MS培養(yǎng)基上的愈傷組織褐化率顯著高于1/2 MS和改良WPM，但在1/2 MS和改良WPM上的差異不顯著，在添加6-BA 1.8 mg/L的培養(yǎng)基上的褐化率顯著高于0.6、1.2 mg/L。由表2得，處理7增殖倍數(shù)顯著高于其他處理，褐化率與處理5差異不顯著。綜合考慮，改良WPM培養(yǎng)基、6-BA 1.8 mg/L、NAA 0.6 mg/L最適于愈傷組織的增殖培養(yǎng)，其增殖倍數(shù)為2.41。

表2 培養(yǎng)基、6-BA及NAA濃度對愈傷組織增殖的影響

2.3.2 CH對愈傷組織增殖的影響

水解酪蛋白(CH)濃度對愈傷組織的增殖影響顯著(圖3)，而對褐化率無顯著性影響(P<0.05)。隨著CH濃度增加，愈傷組織增殖倍數(shù)呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，CH 0.3 g/L和0.4 g/L的增殖倍數(shù)顯著高于對照(不添加CH)，CH 0.4 g/L的增殖倍數(shù)3.18，達到最大，褐化率則最低。

圖3 CH對愈傷組織增殖的影響

2.3.3 pH對愈傷組織增殖的影響

培養(yǎng)基pH值對愈傷組織的增殖及褐化率均具有顯著性影響(圖4，P<0.05)。隨著pH值增加，培養(yǎng)基硬度增加，愈傷組織的增殖倍數(shù)先增加后降低，pH7.3的增殖倍數(shù)顯著高于pH4.8～6.3及7.8～8.3，而pH7.3與6.8之間無顯著性差異，但以pH7.3時的增殖倍數(shù)最大為3.42；pH4.8的褐化率最高且顯著高于6.8～8.3，而5.3～8.3之間的褐化率差異不顯著，培養(yǎng)基pH7.3較適于愈傷組織的增殖培養(yǎng)。

圖4 pH值對鳳丹愈傷組織增殖的影響

2.3.4 瓊脂濃度對愈傷組織增殖的影響

瓊脂濃度對愈傷組織增殖倍數(shù)和褐化率均有顯著影響(圖5，P<0.05)。愈傷組織的增殖倍數(shù)隨著瓊脂濃度增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。愈傷組織的增殖倍數(shù)在添加瓊脂5.0 g/L的培養(yǎng)基上最高，顯著高于7.0～9.0 g/L，而瓊脂5.0 g/L與4.0、6.0 g/L的增殖倍數(shù)差異不顯著。愈傷組織褐化率隨瓊脂濃度增加呈降低趨勢，培養(yǎng)基中添加4.0 g/L瓊脂時的褐化率最高，5.0～9.0 g/L的褐化率差異不顯著。綜合考慮，培養(yǎng)基中添加瓊脂5.0 g/L更適于愈傷組織的增殖培養(yǎng)，增殖倍數(shù)達3.51。

圖5 瓊脂濃度對鳳丹愈傷組織增殖的影響

2.3.5 繼代周期對愈傷組織增殖的影響

愈傷組織繼代周期對增殖倍數(shù)影響顯著，但對褐化率影響不顯著(圖6，P<0.05)。隨著培養(yǎng)時間延長，愈傷組織的增殖倍數(shù)呈現(xiàn)先增加后趨于平穩(wěn)，培養(yǎng)25～45天的增殖倍數(shù)無顯著性差異但顯著高于20天，隨著培養(yǎng)時間延長愈傷組織趨于顏色灰暗褐變。培養(yǎng)25～35天時，愈傷組織呈乳白色，增殖較快(圖7)，增殖倍數(shù)達3.53～3.67。培養(yǎng)25～35天之間的增殖倍數(shù)無顯著性差異，而本研究中25天為丹皮酚最佳收獲期，所以在實際生產(chǎn)中以25天為最佳繼代周期。

圖6 繼代周期對愈傷組織增殖的影響

圖7 鳳丹愈傷組織增殖情況

2.4 愈傷組織的丹皮酚含量

以丹皮酚標準品為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，擬合的標準方程為：y=0.407 3x-0.003 7，R2= 0.998 1，表明標準品梯度濃度線性關系好。愈傷組織鮮重隨培養(yǎng)時間的增長呈S型曲線，如圖8所示，培養(yǎng)10～30天的愈傷組織生長處于對數(shù)生長期，此時的細胞已適應新的培養(yǎng)環(huán)境，細胞快速增殖；30～45天趨于穩(wěn)定期，細胞生長緩慢。丹皮酚含量的測定表明，愈傷組織培養(yǎng)0～20天，丹皮酚含量在1.50 mg/g上下波動，20～25天丹皮酚含量則迅速增加至最高，為1.75±0.13 mg/g，之后隨著培養(yǎng)時間延長丹皮酚含量呈下降趨勢。愈傷組織培養(yǎng)25天，適合收獲用于提取丹皮酚。

圖8 愈傷組織生長曲線及丹皮酚含量的積累

3 討論

牡丹外植體表面消毒常以升汞(HgCl2)[15]和次氯酸鈉[15,16]作為消毒劑，升汞劇毒，致癌、致突變，廢液污染環(huán)境。次氯酸鈉雖為環(huán)境友好型消毒劑，但常溫下容易分解(半衰期大約為3個月)，有效劑量和消毒時間難以掌握。本研究采用有效氯濃度1.5%的環(huán)境友好型消毒劑二氯異氰尿酸鈉水溶液(年損失率約2%)浸泡鳳丹去皮種子30 min，去污染率高達98.89%，較傳統(tǒng)消毒劑相比去污染率高、性質(zhì)穩(wěn)定，便于規(guī)模化生產(chǎn)應用。植物愈傷組織誘導常以葉片、莖段、種胚等為外植體。葉片、莖段等高度分化，脫分化過程比種胚復雜且難度大，種胚生理年齡小，分化程度低、誘導率高常被應用[11]。Wei[12]將鳳丹種胚接種在含6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L的培養(yǎng)基上，愈傷組織誘導率為79.06%。本研究鳳丹種胚愈傷組織誘導率隨6-BA濃度從0.5 mg/L升高至1.5 mg/L逐漸增至最高，達90.00%，較79.06%的種胚愈傷誘導率[12]大幅提升，表明6-BA與2,4-D的組合更適用于鳳丹愈傷組織的誘導。但6-BA濃度上升至2.0 mg/L，則誘導率顯著下降(圖1)，揭示了6-BA濃度誘導鳳丹種胚愈傷發(fā)生的有效范圍。

培養(yǎng)基組成對植物細胞生長分化至關重要。據(jù)報道，基本培養(yǎng)基MS、1/2MS和WPM對鳳丹愈傷組織褐化無顯著性差異[12]。本研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基類型的影響顯著(表2)，MS培養(yǎng)基上的愈傷組織褐化率顯著高于1/2 MS和改良WPM，與前人結果不一致，改良WPM和1/2 MS培養(yǎng)基無機鹽濃度較MS培養(yǎng)基低，褐化率低，有利于愈傷組織的增殖[17]，相關研究有待進行。水解酪蛋白(CH)可為愈傷組織生長提供有機氮源。培養(yǎng)基中添加CH 0.4 g/L促進牡丹(P.suffruticosa)葉片愈傷組織的增殖[18]。本研究添加CH 0.4 g/L，鳳丹愈傷組織增殖系數(shù)由2.41提高至3.18，且對褐化率沒有顯著影響，該結果與文獻一致。CH濃度提高到0.6 g/L則增殖倍數(shù)降低(圖3)，表明CH的添加有最佳有效濃度。

培養(yǎng)基pH值、瓊脂濃度、繼代周期等也影響愈傷組織增殖，‘烏龍捧盛’愈傷組織在中性偏酸的培養(yǎng)基上生長較好，褐化率較低[19]。鳳丹愈傷組織在中性偏堿(pH 7.3)的培養(yǎng)基上增殖效果最好(圖4)。瓊脂0.7%為誘導花生(ArachishypogaeaL.)愈傷組織的最佳濃度[20]，而0.5% 為鳳丹愈傷組織增殖最佳濃度，褐化率較低(圖5)。繼代周期過短，增殖效果不佳，時間過長，則愈傷組織褐化死亡。以上實驗結果表明物種之間存在明顯的培養(yǎng)條件差異，生物的普遍性必須與特定植物的特殊性結合才能獲得解決問題的最佳技術方案。

鳳丹愈傷組織生長曲線和丹皮酚積累曲線是決定愈傷組織收獲期的依據(jù)。圖8顯示培養(yǎng)25天，丹皮酚含量最高。實際生產(chǎn)時可考慮培養(yǎng)25天時，及時繼代使愈傷組織塊降低至10天的鮮重，使其長期處于快速增殖的線形生長期，從而最大程度促進愈傷組織增殖。

丹皮天然產(chǎn)物丹皮酚是《中國藥典》丹皮質(zhì)量檢測指標之一，鳳丹天然產(chǎn)物還有芍藥苷等多種成分，各種次生代謝物質(zhì)最佳培養(yǎng)體系還需分別研究。合適的培養(yǎng)基類型、環(huán)境因素、植物生長激素和誘導子都影響次生代謝產(chǎn)物的積累。據(jù)報道，紅光和藍光可以促進鳳丹愈傷組織丹皮酚的積累[13]。有關的研究必將根據(jù)需要不斷深入，鳳丹細胞作為生物反應器工場將生產(chǎn)人類所需的多種產(chǎn)品服務社會。

4 結論

鳳丹愈傷組織培養(yǎng)體系是植物細胞工程生產(chǎn)天然產(chǎn)物丹皮酚的基礎，在此基礎上可進行高產(chǎn)細胞系的誘變與選擇、細胞培養(yǎng)條件的調(diào)控、代謝反應前體物質(zhì)的添加、誘導子的應用、培養(yǎng)技術的改進等研究，從而實現(xiàn)克服道地藥材地域、生長周期長和土地占用空間大等局限，使生產(chǎn)滿足社會生活需要。本研究以鳳丹種胚為外植體，建立并優(yōu)化鳳丹愈傷組織細胞生產(chǎn)丹皮酚的培養(yǎng)體系。研究表明，去皮種子建議以70%乙醇(V/V)浸泡2.0 min，有效氯1.0%的二氯異氰尿酸鈉溶液浸泡20 min去污染效果最佳；種胚愈傷組織誘導采用6-BA 1.5 mg/L、2,4-D 2.0 mg/L的MS培養(yǎng)基；愈傷組織采用含6-BA 1.8 mg/L、NAA 0.6 mg/L、蔗糖30 g/L、水解酪蛋白0.4 g/L、瓊脂5 g/L、pH 7.3的改良WPM培養(yǎng)基暗培養(yǎng)25天，增殖倍數(shù)高且褐化率低；基于愈傷組織生長和丹皮酚積累曲線，培養(yǎng)25天適于收獲愈傷組織生產(chǎn)丹皮酚。以上研究結果為天然產(chǎn)物丹皮酚的細胞工程生產(chǎn)提供技術基礎。