西藏凹乳芹根、葉提取物的急性及亞急性毒性研究

占 堆，魏榮銳，馬勤閣，何軍偉，多杰加，仁增平措，色 珍

1西藏藏醫(yī)藥大學，拉薩 850000；2江西中醫(yī)藥大學，南昌 330004

西藏凹乳芹(Vicatiathibeticade Boiss.)在四川、云南、西藏等地有分布[1]，其根被稱為西歸，常作為中藥當歸的代用品，其性溫，味辛、甘、微苦，具有祛風除濕、散寒止痛，民間用于健脾補胃、血虛所致的月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)、貧血等癥，西藏凹乳芹根的使用有百余年的歷史，在燉雞、燉肉時常被作為滋補蔬菜食用[2]。近年研究表明，西藏凹乳芹根含有傘形花內(nèi)酯、佛手苷內(nèi)酯、阿魏酸、芹菜素等化學成分，具有抗疲勞、抗痛經(jīng)、抗氧化、促智、提高免疫力等藥理作用[3-7]。西藏凹乳芹根可做藥食兩用，又有很多藥理作用，具有廣闊的開發(fā)應用前景，而鮮有對西藏凹乳芹葉的研究報道，也未見對西藏凹乳芹根、葉的相關(guān)毒性研究的報道，限制了西藏凹乳芹根及葉的深度開發(fā)和利用。因此對西藏凹乳芹根、葉的提取物進行急性毒性和亞急性毒性研究，為西藏凹乳芹根及葉的開發(fā)利用及安全性評價提供毒理學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物

西藏凹乳芹根、葉均采集于西藏山南市洛扎縣卡曲鄉(xiāng)，經(jīng)西藏藏醫(yī)藥大學藏藥專家占堆鑒定為傘形科凹乳芹屬植物西藏凹乳芹(V.thibetica)的根及葉(西藏藏醫(yī)藥大學，標本編號：XZARQGY-201810)。

西藏凹乳芹根、葉提取物的制備：取西藏凹乳芹根、葉干品，粉碎后，分別加入3倍量的95%乙醇浸泡后加熱回流提取三次，每次3小時，過濾，合并三次藥液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮成稠膏。使用時用蒸餾水配制成最大濃度(能通過12號小鼠灌胃針的最大濃度)，濃度以提取物濃度計算，西藏凹乳芹根、葉提取物藥液最大濃度分別為1.00和0.85 g/mL，存于4 ℃冰箱備用，后續(xù)實驗所用的不同濃度的藥液，可用此濃度的藥液進行稀釋。

1.2 實驗儀器

粉碎機(浙江紅景天工貿(mào)有限公司，型號：DE-200g)；KQ-5200DB 型超聲清洗機(昆山市超聲波儀器公司)；電子天平(十萬分之一，賽多利斯，Sarturious BT 124S型)；BUCHI電動旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士步琪公司)；Millipore-Simplicity 純水儀。制冰機(中科美菱低溫科技有限責任公司，型號：IMS-40)；電子秤(上海正光醫(yī)療儀器有限公司，型號：YP20002)；移液器(RAININ Pipet-lite XLS)。

1.3 實驗動物

SPF級昆明種小鼠，雌雄各半，體重(18～22 g)購于江西中醫(yī)藥大學實驗動物中心。實驗動物許可證編號SCXK(贛)2018-0003。

1.4 實驗方法

1.4.1 LD50測定

預實驗取預先配制好的最大濃度的西藏凹乳芹根或葉提取物溶液，以小鼠一次給藥的較大體積(40 mL/kg)灌胃，給藥后嚴密觀察，并每天記錄小鼠毛色及外觀，活動狀態(tài)及大小便，死亡以及中毒等情況，如果在給予最大濃度最大體積后，小鼠全部死亡，則進行后續(xù)LD50測試。測出引起動物100%死亡的最小給藥劑量(Dm)和0%死亡的最大給藥劑量(Dn)，然后根據(jù)預實驗得出的Dm和Dn算出LD50測試需要設(shè)定的給藥組數(shù)和組間比值，一般為5～7個劑量組，組間比為1∶0.80～1∶0.95，另外設(shè)1個空白組，每組10只，雌雄各半[8-10]。試驗前禁食不禁水16 h，根據(jù)預試驗設(shè)計劑量灌胃給藥，空白組給予蒸餾水，灌胃給藥1次。給藥后，連續(xù)觀察14天，記錄小鼠外觀，行為活動狀態(tài)，排泄情況，中毒癥狀，死亡時間，死亡小鼠主要臟器外觀以及死亡數(shù)量。最后根據(jù)實驗結(jié)果用改進寇氏法{LD50=lg-1[Xm-i(ΣP-0.5)]}計算LD50和95%可信限。

1.4.2 亞急性毒性試驗方法

取50只昆明種小鼠，隨機均勻分5組，每組10只，分別為西藏凹乳芹根高、低劑量組、西藏凹乳芹葉高、低劑量組和對照組，高低劑量均為LD50(生藥量)的1/20和1/40，灌胃給藥，每天1次，連續(xù)21天，期間觀察小鼠表現(xiàn)及中毒情況，記錄大鼠體重及攝食量變化[11]，末次給藥后24 h稱體重，眼眶取血清測定血液生化指標，解剖取各臟器，肉眼觀察組織變化，對主要臟器肝、脾、胸腺及腎稱重，計算臟器指數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 西藏凹乳芹根提取物急性毒性效應

2.1.1 西藏凹乳芹根提取物LD50實驗結(jié)果

根據(jù)預實驗得出引起動物100%死亡的最小給藥劑量為207.42 g/kg和0%死亡的最大給藥劑量為108.28 g/kg，因此選取給生藥量108.28～207.42 g/kg之間進行LD50測試，每組劑量以1.00∶0.85遞減，按小鼠體重計算用藥量。給藥組別及劑量如下表。共設(shè)計5個給藥組，1個空白組，各組劑量設(shè)置見表1。

表1 西藏凹乳芹根提取物組劑量表

小鼠灌胃后，空白組小鼠活動正常，毛色光澤，飲食及大小便正常，未見異常狀態(tài)；各劑量組灌胃后均出現(xiàn)活動減少，瞇眼，俯臥不動的情況，其中高劑量組小鼠均出現(xiàn)步履蹣跚、后肢癱瘓、呼吸急促、抽搐，24 h后開始出現(xiàn)死亡，死亡主要集中在3天內(nèi)；中間劑量組149.86 g/kg灌胃后出現(xiàn)瞇眼，精神不振，后肢無力，呼吸急促，其死亡主要集中在2天內(nèi)；低劑量組(108.28 g/kg)無小鼠死亡，為不引起小鼠死亡的最大劑量，因此MTD為108.28 g/kg。具體小鼠死亡情況見表2。根據(jù)小鼠死亡數(shù)量，用改進寇氏法計算西藏凹乳芹根提取物的LD50為154.81 g/kg，95%可信限為143.09～167.50 g/kg

表2 各組小鼠死亡情況

2.1.2 小鼠剖檢結(jié)果

實驗期間對死亡小鼠進行解剖發(fā)現(xiàn)：胃壁完整，胃腸內(nèi)容物為藥物顏色，心肺正常，未見出血點、壞死灶；肝顏色暗紅呈顆粒狀，無明顯腫脹，腎臟顏色正常，呈顆粒狀，其它臟器未見明顯異常。實驗結(jié)束后對小鼠進行解剖發(fā)現(xiàn)：胃壁完整，胃內(nèi)容物和胃壁正常，心肺正常，未見出血點及壞死灶；肝、腎臟顏色正常，但個別小鼠肝、腎可見呈輕微顆粒狀，其它臟器未發(fā)現(xiàn)異常。

2.1.3 西藏凹乳芹根提取物對小鼠肝腎功能、臟器指數(shù)、攝食量曲線和體重變化的影響

與空白組(control)相比，西藏凹乳芹根(VTBR)組(108.28 g/kg)的AST、ALT的血清含量存在上升趨勢，但無明顯差異，血清肌酐(Cr)含量具有明顯升高趨勢(圖1)，而BUN有明顯降低趨勢，提示108.28 g/kg給藥量可能引起小鼠肝腎功能紊亂，此結(jié)果與解剖發(fā)現(xiàn)的小鼠肝、腎有肉眼可見顆粒狀變化結(jié)果一致。另外，與空白組相比，西藏凹乳芹根組對脾臟指數(shù)，腎臟指數(shù)、胸腺指數(shù)、肝臟指數(shù)無明顯影響(圖2)。由西藏凹乳芹根組和空白組的體重變化曲線和攝食量變化曲線可知(圖3)，西藏凹乳芹根組平均體重低于空白組平均體重，但攝食量略高于空白組，可能與西藏凹乳芹根提取物影響機體代謝有關(guān)，但具體原因還有待于進一步研究。

圖1 西藏凹乳芹根提取物對小鼠肝腎功能生化指標的影響

圖2 西藏凹乳芹根提取物對小鼠各臟器指數(shù)的影響

圖3 西藏凹乳芹根提取物對小鼠體重及攝食量的影響

2.2 西藏凹乳芹葉提取物急性毒性效應

2.2.1 西藏凹乳芹葉提取物LD50實驗結(jié)果

根據(jù)預實驗得出引起動物100%死亡的最小給藥劑量為99.55 g/kg和0%死亡的最大給藥劑量為32.62 g/kg，因此選取給生藥量99.55～32.00 g/kg之間進行LD50測試，每組劑量以1.00:0.80遞減，按小鼠體重計算用藥量。各組劑量設(shè)置如表3，共設(shè)計6個給藥組，1個空白組。

表3 西藏凹乳芹葉提取物組劑量表

各組灌胃后，空白組小鼠活動正常，毛色光澤，飲食及大小便正常，未見異常狀態(tài)；各給藥組均表現(xiàn)為小鼠行動遲緩，臥伏，雙目微閉，自發(fā)性活動減少，精神萎靡，30 min后部分小組出現(xiàn)拉稀，口鼻中有分泌物現(xiàn)象，且劑量越大，情況越嚴重。同時高劑量組30 min后開始出現(xiàn)死亡，并且死亡前抽搐，而其余組小鼠死亡之前表現(xiàn)為四肢無力，癱臥不動，呼吸急促且微弱，隨著藥物劑量增大，死亡數(shù)量越多，死亡時間越短。其中高劑量組99.55 g/kg灌胃給藥后1 h就有小鼠死亡，死亡主要集中在1 h內(nèi)；中間劑量組50.97和63.71 g/kg死亡主要集中在2 h；低劑量組(32.62 g/kg)無小鼠死亡，為不引起小鼠死亡的最大劑量，因此MTD為32.62 g/kg，具體情況見表4。根據(jù)各組小鼠死亡數(shù)量用改進寇氏法計算西藏凹乳芹葉提取物的LD50為58.27 g/kg，95%可信限為51.36～66.11 g/kg。

表4 各組小鼠死亡情況

2.2.2 小鼠剖檢結(jié)果

試驗期間對死亡小鼠進行解剖發(fā)現(xiàn)：胃壁完整，胃內(nèi)容物為黑青色(與藥液顏色同)，心肺正常，未見出血點、壞死灶；肝顏色正常呈顆粒狀，無明顯腫脹，腎臟顏色正常呈顆粒狀、腸內(nèi)容物呈黑青色，其它臟器未見明顯異常，小鼠死亡后解剖情況大致相同。實驗結(jié)束后對小鼠進行解剖發(fā)現(xiàn)：胃壁完整，胃內(nèi)容物和胃壁正常，心肺正常，未見出血點及壞死灶；肝、腎臟顏色正常，但個別小鼠肝腎有肉眼可見輕微顆粒狀，其它臟器未發(fā)現(xiàn)異常。

2.2.3 西藏凹乳芹葉提取物對小鼠肝腎功能、臟器指數(shù)、攝食量曲線和體重變化的影響

與空白組相比，西藏凹乳芹葉組(西藏凹乳芹葉MTD組)的AST、ALT、Cr及BUN均有升高趨勢，其中BUN顯著性升高(圖4)，提示灌胃量32.62 g/kg可能使小鼠肝腎損傷，此結(jié)果與解剖發(fā)現(xiàn)的小鼠肝腎有肉眼可見顆粒狀變化結(jié)果一致。另外，與空白組相比，西藏凹乳芹葉組對脾臟指數(shù)、腎臟指數(shù)、胸腺指數(shù)無明顯影響，但可明顯升高肝臟指數(shù)(圖5)，這也與解剖發(fā)現(xiàn)的西藏凹乳芹葉組小鼠肝臟有肉眼可見顆粒狀變化一致。由西藏凹乳芹葉組和空白組的體重變化曲線和攝食量變化曲線可知(圖6)，兩組平均體重變化及攝食量趨勢基本一致，說明西藏凹乳芹葉提取物在最大耐受劑量32.62 g/kg時不影響小鼠的體重和攝食量。

圖4 西藏凹乳芹葉提取物對小鼠肝腎功能生化指標的影響

圖5 西藏凹乳芹葉提取物對小鼠各臟器指數(shù)的影響

圖6 西藏凹乳芹葉提取物對小鼠體重及攝食量的影響

2.3 西藏凹乳芹根、葉提取物對小鼠亞急性毒性結(jié)果

2.3.1 小鼠一般情況及剖檢結(jié)果

各組小鼠在試驗期間活動正常，毛發(fā)光澤、二便無異常。實驗結(jié)束后，對各組小鼠大體解剖顯示：胃壁完整，胃內(nèi)容物正常，肺未見出血點及壞死灶，心、腦、肝、胸腺、脾、腎等組織未見異常。

2.2.3 西藏凹乳芹根、葉提取物對小鼠肝腎功能、臟器指數(shù)、攝食量曲線和體重變化的影響

與空白組相比，西藏凹乳芹根、葉各組的肝腎功能指標(AST、ALT、Cr及BUN)、肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)、腎臟指數(shù)及胸腺指數(shù)均無明顯差異(P>0.05，圖7和8)。另外，由西藏凹乳芹根、葉各組的體重變化曲線和攝食量變化曲線可知，各組平均體重及攝食量變化趨勢基本一致(圖9)，說明西藏凹乳芹根高、低劑量組(7.74和3.87 g/kg)和西藏凹乳芹葉高、低劑量組(2.91和1.45 g/kg)長期給藥并不影響小鼠肝腎功能、臟器指數(shù)，也不影響體重和攝食量，長期重復服用未出現(xiàn)毒性反應。

圖9 西藏凹乳芹根、葉提取物對小鼠體重及攝食量的影響

圖7 西藏凹乳芹根、葉提取物對小鼠肝腎功能生化指標的影響

3 討論

本研究首先對西藏凹乳芹根、葉提取物進行急性毒性實驗，根據(jù)實驗數(shù)據(jù)，采用改良寇氏法得出西藏凹乳芹根提取物的LD50為154.81 g/kg，95%可信限為143.09～167.50 g/kg；西藏凹乳芹葉提取物的LD50為58.27 g/kg，95%可信限為51.36～66.11 g/kg。目前對中藥毒性的分級尚無統(tǒng)一定論，孫文燕[12]在《中藥毒性分級概況與研究思路探討》中的中藥急性毒性分級中顯示LD50>15 g/kg為無毒物質(zhì)，西藏凹乳芹根、葉提取物LD50均遠遠大于15 g/kg，均可判定為無毒物質(zhì)。在試驗過程中，發(fā)現(xiàn)西藏凹乳芹根、葉提取物不引起小鼠死亡的最大耐受量MTD分別為108.28 g/kg和32.62 g/kg，在此劑量雖不引起動物死亡，但通過解剖觀察肝腎病理變化、生化指標檢測、體重及攝食量變化發(fā)現(xiàn)西藏凹乳芹根、葉提取物均可引起肝腎功能損傷，另外，西藏凹乳芹葉在MTD時對小鼠體重及攝食量均無影響，而西藏凹乳芹根在MTD時可使小鼠體重降低，攝食量反而增加，這可能與西藏凹乳芹根影響小鼠機體代謝有關(guān)，但具體機制還需要進一步研究。

圖8 西藏凹乳芹根、葉提取物對小鼠各臟器指數(shù)的影響

西藏凹乳芹根、葉在最大耐受量時均引起肝腎功能損傷，為觀察其長期食用是否會有毒性反應，進一步做亞急性毒性實驗，其結(jié)果顯示：各組小鼠一般情況及臟器大體解剖未見異常；體重、攝食量、臟器指數(shù)與對照組相比差異均無統(tǒng)計學意義；各劑量組肝、腎功能生化指標與對照組相比也無明顯差別，未發(fā)現(xiàn)西藏凹乳芹根、葉長期服用有毒性反應。因此，本研究未觀察到西藏凹乳芹根、葉提取物有明顯的急性經(jīng)口毒性和亞急性毒性，在試驗劑量范圍內(nèi)有較高的安全性，為西藏凹乳芹根、葉的開發(fā)利用提供毒理學依據(jù)。