大孔樹脂對短梗五加多酚的純化效果及多酚的抗疲勞作用研究

劉 琦

（南昌理工學院體育學院，江西 南昌 330044）

短梗五加（Acanthopanax sessiliflorus）為傘形目五加科五加屬植物，富含多糖、氨基酸、花色苷、槲皮素、綠原酸、酚酸等化合物[1-2]，因其具有益氣安神、活血通絡等功效而被加工成各類食品或藥品使用。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，其果實中多酚具有抗氧化、降血糖及增強機體免疫功能等活性[3-5]。肖鳳艷等[6]采取減壓回流提取該植物果實中多酚，發(fā)現(xiàn)其具有較好的抗疲勞效果。但一般提取物中仍含有較多鞣質(zhì)、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，使得多酚含量偏低，進而影響產(chǎn)品的功效。

大孔樹脂吸附分離綜合了機械篩分與化學吸附的優(yōu)點，具有選擇性高、干擾因素少、可重復循環(huán)利用等特點，被廣泛用于天然產(chǎn)物活性成分的分離和純化[7-8]。本研究在短梗五加果多酚提取研究的基礎上，探討大孔樹脂純化短梗五加多酚提取物的最佳工藝條件，同時研究其對運動后小鼠的抗疲勞作用效果，為短梗五加多酚的進一步開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

短梗五加果：采購于遼寧建聯(lián)醫(yī)藥連鎖有限公司；綠原酸：定量分析用，中國藥品生物制品檢定所產(chǎn)品；乙醇、甲醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉：分析純，國藥集團化學試劑有限公司產(chǎn)品；AB-8、DM-130 大孔樹脂：天津浩聚樹脂科技有限公司產(chǎn)品；H-103、D-101 大孔樹脂：滄州寶恩吸附材料科技有限公司產(chǎn)品；NKA-9、ADS-21 大孔樹脂：天津西金納環(huán)保材料科技有限公司產(chǎn)品；血尿素氮（BUN）試劑盒、乳酸（BLA）檢測試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒、乳酸脫氫酶（LDH）檢測試劑、肌糖原（MG）和肝糖原（HG）試劑盒：南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。試驗用水為超純水。

試驗動物：健康雄性小鼠 30 只，體重（7±2）g，由江西省實驗動物中心提供，生長環(huán)境溫度20～25 ℃，相對濕度50%～70%。

1.1.2 儀器與設備

T6 型紫外-可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司產(chǎn)品；FA2204B 型電子天平：上海精密科學儀器有限公司產(chǎn)品；878-B 型多功能粉碎機：常州國華電器有限公司產(chǎn)品；RE-6000AT 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：杭州振和科學儀器有限公司產(chǎn)品；SCIENTZ-10ND型冷凍干燥機：寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品；KL-211D 型恒溫振蕩器：上海凱朗儀器設備有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 提取物的制備

干燥的短梗五加果粉碎后，過80 目篩，稱取50 g，加入750 mL 50%乙醇溶液，80 ℃回流提取60 min 后過濾，提取兩次，合并濾液減壓回收乙醇后，冷凍干燥備用[6]。

1.2.2 定量分析

1.2.2.1 多酚標準曲線的繪制

不同產(chǎn)物的多酚含量以綠原酸當量表示，準確稱取10.0 mg 綠原酸標準品，以甲醇溶解定容至50 mL容量瓶后，分別準確移取 1、2、5、10、15 mL 標準品溶液置于50 mL 容量瓶內(nèi)，另加入5%亞硝酸鈉溶液2.0 mL，靜置6 min 后再加入10%硝酸鋁溶液2.0 mL，混勻后，靜置6 min，再加入4%氫氧化鈉溶液8.0 mL，靜置 15 min，加水定容，即得 0.004 ～ 0.06 mg/mL 綠原酸標準溶液，然后于520 nm 波長處測定吸光度值，繪制標準曲線[9]，得到線性方程為：y=11.253x+0.015 2（R2=0.999 5，y為吸光度，x為濃度值）。

1.2.2.2 多酚含量的測定

提取物和純化物樣品多酚含量測定：準確稱取樣品10.0 mg，采用甲醇溶解，并定容至50 mL 容量瓶后，準確移取20 mL 溶液至50 mL 容量瓶內(nèi)，加入顯色劑后，加水定容至50 mL，于520 nm 波長處測定吸光度，代入標準曲線，計算得到樣品多酚含量，平行測定 3 次。

靜態(tài)吸附液和動態(tài)流出液中多酚含量測定：使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除靜態(tài)吸附液與動態(tài)流出液中的乙醇，后冷凍干燥，按照上述步驟加入顯色劑后，于520 nm波長處測定吸光度值，根據(jù)標準曲線方程，計算樣品的多酚含量，平行測定3 次。

1.2.3 樹脂預處理

將大孔樹脂于90%乙醇中浸泡24 h，充分溶脹后濕法裝柱，然后用90%乙醇反復沖洗，直至流出液與水混合（V液∶V水=1∶5)無白色渾濁出現(xiàn)，再用水洗至無乙醇氣味，加入3%鹽酸浸泡3 h，用水洗至中性；再用3%氫氧化鈉溶液浸泡3 h，用水洗至中性，備用[10]。

1.2.4 大孔樹脂的型號篩選

準確稱取一定質(zhì)量的粗提物溶解至無水乙醇中，配制成0.1 mg/mL 吸附液。準確稱取10.0 g 六種不同極性的大孔樹脂（H-103、D-101、DM-130、AB-8、NKA-9、ADS-21）置于錐形瓶內(nèi)，分別加入100 mL 吸附液后，置于恒溫振蕩器內(nèi)，靜態(tài)吸附24 h 后過濾。通過下式計算不同類型大孔樹脂的靜態(tài)吸附量與吸附率[11]。

式中：Γe為樹脂的吸附量，mg/g；m0為吸附液中多酚質(zhì)量，mg；me為吸附后濾液中多酚質(zhì)量，mg；m為干燥的大孔樹脂質(zhì)量，g；Qe為吸附率，%。

利用乙醇溶液作解吸劑，將吸附后的樹脂過濾，用一定量水洗至無提取液殘留后，置于錐形瓶內(nèi)，加入70%乙醇100 mL 后，置于恒溫振蕩器中，靜態(tài)解吸24 h，過濾，測定濾液中多酚的含量，通過下式計算不同類型樹脂的解吸率與回收率[12]。

式中：Dd為解吸率（%）；md為解吸液中多酚質(zhì)量（mg）；m0為原吸附液中多酚質(zhì)量（mg）；me為吸附后濾液中多酚質(zhì)量（mg）；R為回收率（%）。

1.2.5 不同吸附條件對樹脂動態(tài)吸附率的影響

以50 mL 乙醇為溶劑配制不同濃度的吸附液。根據(jù)預試驗結(jié)果，取5 g 已處理后的AB-8 大孔樹脂濕法裝柱后，分別考察上樣液濃度、上樣液pH 和上樣流速對樹脂的吸附率影響，具體如下：（1）當上樣液濃度0.3 mg/mL，上樣液pH 為4 時，上樣流速分別為：1、2、3、4、5 mL/min；（2）當上樣液濃度 0.3 mg/mL，上樣流速為 2 mL/min 時，上樣液 pH 分別為：2、3、4、5、6；（3）當上樣液pH 為4，上樣流速為2 mL/min 時，上樣液濃度分別為：0.05、0.1、0.2、0.3、0.4 mg/mL。吸附完成后，測定流出液中多酚含量，計算樹脂吸附率。

1.2.6 不同洗脫條件對洗脫率的影響

以乙醇溶液作洗脫劑，分別考察洗脫液濃度、洗脫流速與洗脫液體積對多酚化合物洗脫率的影響，具體如下：（1）當洗脫流速為1 mL/min、洗脫液體積為100 mL 時，洗脫液濃度分別為 50%、60%、70%、80%、90%；（2）當洗脫液濃度為70%、洗脫流速為1 mL/min時，洗脫液體積分別為 80、90、100、110、120 mL；（3）當洗脫液濃度為70%、洗脫液體積為100 mL 時，洗脫流速分別為 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL/min。洗脫完成后，測定流出液中多酚含量，計算洗脫率（洗脫的多酚占被吸附的多酚的百分比）。

1.2.7 抗疲勞試驗

1.2.7.1 試驗設計

30 只健康雄性小鼠，隨機分為3 組，每組10 只，分別為對照組、提取組和純化組，向提取組和純化組的飼料內(nèi)摻入等量的多酚提取物和純化物，每天喂食2 次，連續(xù)喂食30 d。每組小鼠每次喂食1 h 后于恒溫游泳池內(nèi)開展游泳訓練，5 d 為一訓練周期，共訓練4周，空白對照組采用等量生理鹽水灌胃[13]。

1.2.7.2 小鼠負重游泳時間

第30 天，喂食結(jié)束1 h 后于鼠尾負重自身5%的重物，進行力竭性游泳試驗，記錄小鼠自入水開始游泳至沉沒超過10 s 的時間，即為游泳力竭時間[14]。

1.2.7.3 生化指標檢測

小鼠游泳運動進行10 min 后，取出擦凈，摘取眼球，抽血離心，收集血清，同時分取肝與肌肉組織，利用相關試劑盒，分別測定不同組別小鼠肝臟中肝糖原含量、肌肉中肌糖原含量和血清中乳酸濃度、丙二醛含量、尿素氮含量與乳酸脫氫酶活力。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

相關評價指標均采用均數(shù)、標準差描述，利用SPSS 19.0 進行方差分析，檢驗水準α=0.05，當P＜0.05表示具有顯著性差異，P＜0.01 表示具有極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔樹脂的選擇

表1 為不同類型樹脂的靜態(tài)吸附與解吸性能比較。由表1 可見，弱極性樹脂對多酚化合物表現(xiàn)出較好的純化效果，特別是AB-8 大孔樹脂的靜態(tài)吸附回收率遠高于其他五類樹脂，達到80.47%，這歸因于多酚化學結(jié)構(gòu)上的羥基具有一定的極性，使得AB-8 大孔樹脂能夠與其產(chǎn)生較好的吸附作用[15]，因此確定采用AB-8 作為純化短梗五加多酚的吸附樹脂。

表1 不同樹脂的靜態(tài)吸附與解吸性能比較Table 1 Comparison of static adsorption and desorption performance of different macroporous resins

AB-8 大孔樹脂的靜態(tài)吸附曲線如圖1 所示。隨著吸附時間的增長，AB-8 大孔樹脂對短梗五加多酚的吸附率不斷升高，在吸附6 h 后趨于平衡。

2.2 AB-8 純化效果的單因素試驗

2.2.1 上樣液濃度對短梗五加多酚吸附率的影響

上樣液濃度過高可能會造成吸附不完全，上樣液濃度過低，分離純化耗時會過長，影響試驗效率。不同上樣液濃度對短梗五加多酚吸附率的影響如圖2所示。隨著上樣液濃度的增大，AB-8 大孔樹脂對短梗五加多酚的吸附率緩慢降低；當上樣液濃度為0.4 mg/mL 時，吸附率明顯下降。綜合考慮，確定上樣液濃度以0.1 mg/mL 為宜。

2.2.2 上樣液pH 對短梗五加多酚吸附率的影響

不同上樣液的pH 對吸附率的影響如圖3 所示。隨著上樣液pH 的增大，AB-8 大孔樹脂對短梗五加多酚的吸附率先增高后降低，當pH 為4 時達到最大值，這源于短梗五加多酚的化學結(jié)構(gòu)中含有酚羥基，呈弱酸性，而上樣液在弱酸性時可降低其溶解性從而易于吸附[16]。因此，確定上樣液pH 以4 為宜。

2.2.3 上樣流速對短梗五加多酚吸附率的影響

在動態(tài)吸附時，上樣流速過快，目標物與樹脂接觸不充分，可能造成過早泄漏；但流速過慢，又導致耗時過長，且對后續(xù)樹脂再生產(chǎn)生不良影響。不同上樣流速對吸附率的影響如圖4 所示。隨著上樣流速的增大，AB-8 大孔樹脂對短梗五加多酚的吸附率呈下降趨勢。綜合考慮吸附效率，本研究確定上樣流速2 mL/min 為宜。

2.2.4 洗脫液濃度對短梗五加多酚洗脫率的影響

不同濃度的乙醇對短梗五加多酚的洗脫效果如圖5 所示。隨著洗脫液濃度的增大，洗脫率逐漸增大；當洗脫液濃度為70%時，洗脫率開始下降。這可能是因為低濃度乙醇無法使得多酚類化合物充分溶出，洗脫不充分，而高濃度乙醇的極性與多酚相差較大，不利于洗脫[17]。因此確定洗脫液以70%的乙醇較為適宜。

2.2.5 洗脫流速對短梗五加多酚洗脫率的影響

不同洗脫流速對短梗五加多酚的洗脫率影響如圖6 所示。隨著洗脫流速的增大，洗脫率逐漸下降，這歸因于流速較快時，洗脫液不能充分接觸樹脂，但流速過低，又會延長洗脫過程。因此確定洗脫流速1.0 mL/min 較為適宜。

2.2.6 洗脫液體積對短梗五加多酚洗脫率的影響

不同洗脫液體積對短梗五加多酚的洗脫率影響如圖7 所示。當洗脫液用量達到100 mL 時，洗脫率趨于平衡，表明樹脂吸附的多酚基本被洗脫。因此確定洗脫液體積100 mL 較為適宜。

2.3 最佳工藝驗證

采取上述條件純化短梗五加提取物中多酚，即配制濃度為 0.1 mg/mL、pH = 4 的上樣液 50mL，以2 mL/min 流速上樣至5 g AB-8 型大孔樹脂中進行吸附。采用體積為100 mL、濃度70%的乙醇溶液，以1 mL/min 流速洗脫，測得吸附率為90.35%，洗脫率為89.87%。純化前后產(chǎn)物的多酚含量如表2 所示。產(chǎn)物的多酚含量由純化前的124.53 mg/g 提高至純化后的279.73 mg/g，約提高 2.25 倍。

2.4 不同組別小鼠的游泳力竭時間比較

負重游泳時間的長短直接反映運動過程的抗疲勞程度[18]。不同產(chǎn)物對小鼠的負重游泳時間影響如圖8 所示。由圖8 可知，與對照組相比，提取組與純化組小鼠的負重游泳時間均極顯著延長（P＜0.01），表明短梗五加多酚能夠提高小鼠的運動耐力；而純化組小鼠的游泳時間較提取組明顯增長，差異具有顯著性（P＜0.05），表明純化產(chǎn)物有助于更好地增強小鼠的運動耐力。

2.5 不同物質(zhì)對小鼠的血乳酸濃度和乳酸脫氫酶活力的影響

身體運動后乳酸的濃度水平與疲勞程度呈正相關，機體高強度運動后會造成體內(nèi)部分細胞缺氧，致使血糖發(fā)生糖酵解生成乳酸，蓄積在骨骼肌等組織中，而乳酸脫氫酶可迅速催化乳酸脫氫形成丙酮酸，有利于排泄出體外[19]。不同產(chǎn)物對運動后小鼠的體內(nèi)乳酸生化指標影響見圖9。與對照組相比，提取組與純化組小鼠運動后血乳酸生成量明顯偏低，且體內(nèi)乳酸脫氫酶活力極顯著增強（P＜0.01）；同時純化組小鼠體內(nèi)的血乳酸含量和乳酸脫氫酶酶活力與提取組小鼠之間呈極顯著差異（P＜0.01），從而表明短梗五加多酚的純化產(chǎn)物具有良好的開發(fā)利用價值。

2.6 不同物質(zhì)對小鼠的肝糖原和肌糖原含量的影響

肝糖原與肌糖原是機體的重要儲能物質(zhì)，當機體開始運動時，肌糖原逐漸消耗至殆盡，隨后利用肝糖原以維持體內(nèi)運動時血糖水平。由圖10 可以看出，提取組與純化組的兩種糖原含量均極顯著高于對照組（P＜0.01），而純化組體內(nèi)的兩種糖原含量明顯更高，從而表明短梗五加純化產(chǎn)物有助于明顯增加體內(nèi)肝糖原與肌糖原的儲備，進而更好地發(fā)揮抗疲勞作用。

2.7 不同物質(zhì)對小鼠的尿素氮和丙二醛含量的影響

機體的劇烈運動會增加體內(nèi)蛋白質(zhì)的分解代謝，使得代謝產(chǎn)物尿素氮從腎臟經(jīng)血液循環(huán)排出體外，相關研究已證明體內(nèi)尿素氮含量與機體的疲勞程度呈正相關[20]。由圖11 可知，提取組和純化組動物運動時，體內(nèi)尿素氮含量均極顯著低于對照組（P＜0.01）；同時，運動后肝臟生成的丙二醛具有細胞毒性，可使蛋白質(zhì)與核酸產(chǎn)生交聯(lián)聚合[21]，而提取組和純化組小鼠的肝臟丙二醛濃度均極顯著低于對照組（P＜0.01）。綜上結(jié)果表明，短梗五加純化產(chǎn)物可有效降低運動時蛋白質(zhì)的代謝和丙二醛的生成速率。

3 結(jié)論

本研究采用AB-8 大孔樹脂純化短梗五加提取物中的多酚，利用單因素試驗得到最佳純化工藝條件：配制濃度為0.1 mg/mL、pH=4 的上樣液50 mL，以2 mL/min 流速上樣至5 g AB-8 型大孔樹脂中進行吸附，采用70 %乙醇溶液100 mL，以1 mL/min流速洗脫，樹脂對多酚的吸附率和洗脫率分別為90.35%、89.87%。產(chǎn)物的多酚含量由純化前的124.53 mg/g 提高至純化后的279.73 mg/g，約提高2.25 倍。該工藝操作簡便、純化效率較高，且產(chǎn)物可顯著延長小鼠的游泳力竭時間，顯著增加體內(nèi)肝糖原、肌糖原含量和乳酸脫氫酶活力，并有效降低尿素氮、丙二醛和乳酸濃度水平，從而具有較好的抗疲勞作用。本研究可為短梗五加多酚化合物的進一步開發(fā)提供參考。