白細(xì)胞介素35和白細(xì)胞介素37與結(jié)直腸癌臨床病理學(xué)特征及預(yù)后的相關(guān)性研究

陳飛兒，張 鳳，談?wù)裼?，夏慶華，包士三，陶 琨，董志恒

1.北華大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理教研室，吉林 吉林 132000；

2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院病理科，上海 200336；

3.上海市長寧區(qū)疾病預(yù)防控制中心，上海 200050

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）在中國男性癌癥死亡率中排第5位，女性癌癥死亡率中排第4位［1］。城市的發(fā)病率高于農(nóng)村地區(qū)，經(jīng)濟(jì)較發(fā)達(dá)地區(qū)的發(fā)病率較高［1］。有研究顯示，宿主免疫在腫瘤發(fā)生中起著重要作用［2］，炎癥性腸病中持續(xù)存在的腸道炎癥會(huì)顯著增加CRC的患病風(fēng)險(xiǎn)［3-4］。白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-12家族的成員IL-35為抗炎因子，IL-1家族的成員IL-37同樣也是一種抗炎因子［5］。最新研究顯示，IL-35具有強(qiáng)烈抑制免疫細(xì)胞的功能，并且在潰瘍性結(jié)腸炎中起到減輕結(jié)腸組織炎癥損傷的作用［6］，血清中IL-37水平升高與卵巢癌患者的不良預(yù)后相關(guān)［7］。但I(xiàn)L-35和IL-37的表達(dá)水平是否與CRC的發(fā)展有關(guān)、是否可以作為CRC患者術(shù)后生存的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)，仍有待研究。

本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry，IHC）染色法將191例CRC患者的癌組織與匹配的切緣組織（即非癌組織）染色，并運(yùn)用Image-Pro Plus軟件將IHC染色陽性部分進(jìn)行定量分析，結(jié)合隨訪結(jié)果，探討CRC組織與非癌組織中IL-35和IL-37表達(dá)水平與CRC臨床病理學(xué)特征及預(yù)后的相關(guān)性，探究IL-35和IL-37在CRC診斷和治療中的意義。

1 資料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

1.1.1 患者臨床病理學(xué)資料

收集2013—2017年在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院接受治療的CRC患者術(shù)后的病理學(xué)組織蠟塊和臨床資料，并排除黏液腺癌。因?yàn)轲ひ合侔┰陲@微鏡下呈現(xiàn)為大片黏液，在IHC染色中沒有特異性。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的選取

收集CRC患者191例，將其中CRC癌組織作為實(shí)驗(yàn)組，同一患者的形態(tài)學(xué)正常的手術(shù)切緣組織作為對(duì)照組，切緣組織距離腫瘤＞5 cm。對(duì)照組的總例數(shù)為141例。

1.1.3 隨訪

隨訪資料來源于上海市長寧區(qū)疾病預(yù)防控制中心，在收集到的191例CRC患者中，共獲得了76例患者的隨訪信息。截至2018年5月，隨訪到的患者信息如下：51例患者生存，25例患者死亡，在這些CRC患者中，最長的生存時(shí)間為53個(gè)月。

1.1.4 患者腫瘤大小分組和年齡分組中間值的選擇

選取腫瘤直徑5 cm作為CRC患者分組的中間值，是影響患者5年生存率和5年局部復(fù)發(fā)率的獨(dú)立因素［8］，因此本次實(shí)驗(yàn)選擇5 cm作為CRC患者分組的中間值。有研究［9］表明，CRC患者診斷的中位年齡約為70歲，因此本次實(shí)驗(yàn)選擇70歲作為分組的中間值。

1.2 主要試劑與儀器

IL-35抗體（編號(hào)ab131039）購自英國Abcam公司，IL-37抗體（編號(hào)ab57187）購自英國Abcam公司，兔血清購自武漢博士德生物工程有限公司，DAB顯色液購自丹麥DAKO公司，蘇木精購自珠海貝索生物科技有限公司，EDTA修復(fù)液購自丹麥DAKO公司，Olympus BX63光學(xué)顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.3 組織芯片的制作

由兩名有高級(jí)職稱的病理科醫(yī)師在顯微鏡下復(fù)習(xí)檔案切片，并對(duì)比蠟塊確定CRC組織實(shí)驗(yàn)組和非癌組織對(duì)照組的代表性區(qū)域（以下稱為癌組織和非癌組織）。由病理科技師從石蠟塊中取出直徑2.0 mm的代表性區(qū)域的組織，放入預(yù)制蠟塊中，制成組織芯片。將制好的組織芯片于80 ℃烤箱高溫處理10 min后進(jìn)行切片。切片厚度為4 μm。將H-E染色切片的鏡下形態(tài)與原選定區(qū)域進(jìn)行對(duì)比，形態(tài)高度一致則為最終的組織芯片。

1.4 IHC染色

將制備好的組織芯片切片后，按順序進(jìn)行烤片，67 ℃烘箱2 h；脫蠟，二甲苯5 min，梯度乙醇100%、95%、80%中振洗1 min。修復(fù)：PT Link抗原修復(fù)儀，EDTA修復(fù)液，30 min。阻斷：0.3% H2O2，室溫下溫育30 min。封閉：兔血清濃度1∶1000，室溫下溫育30 min。加一抗，IL-35濃度1∶12000，IL-37濃度1∶300，室溫下溫育30 min。加二抗，HRP標(biāo)記的鼠兔通用二抗聚合物，1∶1對(duì)倍稀釋，室溫下溫育30 min。顯色、復(fù)染、脫水干燥封片［10-11］。

1.5 拍照

將IHC染色后的組織切片置于Olympus BX63光學(xué)顯微鏡下拍照，物鏡為60倍空氣鏡。每張芯片中的每個(gè)組織拍30～40張圖片。調(diào)整拍攝全程中顯微鏡的光源為日光色溫的白色光，保證顯微鏡光源穩(wěn)定。使用手動(dòng)控制曝光時(shí)間，保持拍照全程曝光一致。使用同樣的顯微鏡工作條件（室內(nèi)溫度、光線等）與相機(jī)工作條件，一次性拍攝完所有照片。

1.6 Image-Pro Plus 9.1軟件量化IHC染色

選取拍攝圖片上帶有IHC染色陽性色調(diào)的區(qū)域?yàn)槟繕?biāo)區(qū)域，測(cè)量該區(qū)域的累計(jì)吸光度（D）值，選擇并測(cè)量有效統(tǒng)計(jì)區(qū)域的面積，計(jì)算平均D值，計(jì)算同一塊組織上的各照片的平均值及標(biāo)準(zhǔn)差，用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析各個(gè)實(shí)驗(yàn)組的平均D值之間差異是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以每組所拍照片的平均值作為最終量化后的數(shù)值［12-13］。

1.7 生存分析中高表達(dá)組與低表達(dá)組截?cái)嘀档呐卸?/h3>

將76例隨訪患者CRC組織中IL-35和IL-37的表達(dá)量分別進(jìn)行排序，選擇中位數(shù)作為區(qū)分高表達(dá)組與低表達(dá)組的截?cái)嘀担↖L-35的截?cái)嘀禐?.23×103，IL-37的截?cái)嘀禐?.98×105）。癌組織中IL-35或IL-37的表達(dá)量高于中位數(shù)的CRC患者為高表達(dá)組；癌組織中IL-35或IL-37的表達(dá)量低于中位數(shù)的CRC患者為低表達(dá)組。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)法對(duì)兩組進(jìn)行比較，使用GraphPad Prism 7軟件繪制柱狀圖；使用Kaplan-Meier方法、GraphPad Prism 7軟件繪制生存曲線，并通過log-rank檢驗(yàn)法進(jìn)行檢驗(yàn)；使用COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型對(duì)影響患者預(yù)后的因素進(jìn)行單因素和多因素生存分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CRC患者的臨床病理學(xué)信息

本實(shí)驗(yàn)共收集191例CRC患者，其中男性120例，女性71例。年齡范圍24～94歲，且主要集中于62～78歲（四分位數(shù)：25%～75%），總體年齡偏大（＜60歲，n=37/191）。按照CRC的病理組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)［14］，高分化的患者例數(shù)為7例，中分化為146例，低分化為38例。在進(jìn)行IL-37與CRC相關(guān)性的研究中由于組織芯片切片后位點(diǎn)丟失，漏掉3例患者的非癌組織。IL-35和IL-37 IHC染色量化后的數(shù)據(jù)均呈現(xiàn)偏態(tài)分布，因此使用中位數(shù)±四分位數(shù)間距來反映數(shù)據(jù)情況，詳細(xì)信息見表1。

2.2 IL-35和IL-37在CRC組織和非癌組織中表達(dá)量的差異分析

在非癌組織中，IL-35和IL-37的表達(dá)主要定位于腸黏膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中（圖1C～D）。與非癌組織相比，CRC組織中的IL-35蛋白的表達(dá)相對(duì)較弱，并在分化較差癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中呈擴(kuò)散式分布（圖1G）。與非癌組織相比，CRC組織中的IL-37蛋白的表達(dá)相對(duì)較強(qiáng)，并在分化較差癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中呈擴(kuò)散式分布（圖1H）。

與非癌組織相比，CRC組織中IL-35的表達(dá)量減少了50%（圖2A）。CRC組織與非癌組織中IL-35蛋白表達(dá)量的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.0001）。與非癌組織相比，CRC組織中IL-37的表達(dá)量增加了40%（圖2B）。CRC組織與非癌組織中IL-37蛋白表達(dá)量的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.012）。

2.3 CRC組織中IL-35和IL-37的表達(dá)量與CRC患者生存時(shí)間的生存曲線分析

癌組織中IL-35高表達(dá)組與低表達(dá)組在CRC患者的生存率中有差異，IL-35高表達(dá)組的CRC患者的生存率相對(duì)高；IL-35低表達(dá)組的CRC患者的生存率相對(duì)低，并且當(dāng)生存天數(shù)＜800 d時(shí)，高表達(dá)組與低表達(dá)組之間的差距最為明顯，但整體差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.18，圖3A）。癌組織中IL-37高表達(dá)組與低表達(dá)組在CRC患者的生存率中同樣有差異，IL-37高表達(dá)組的CRC患者的生存率相對(duì)高；IL-37低表達(dá)組的CRC患者的生存率相對(duì)低，并且在生存時(shí)間＞500 d后，其離散趨勢(shì)十分明顯，但整體差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.14，圖3B）。

表1 CRC患者的臨床病理學(xué)信息Tab.1 Clinical pathology information of CRC patients

圖1 CRC癌組織和非癌組織的陰性對(duì)照組、H-E染色以及IL-35和IL-37的IHC染色Fig.1 IHC staining of negative control groups,H-E staining and IHC staining of IL-35 and IL-37 in CRC tissues and non-cancerous tissues The bar represented 40 μm

圖2 IL-35和IL-37在CRC組織與癌組織之間表達(dá)的差異Fig.2 Difference in expression of IL-35 or IL-37 between non-cancerous tissues and CRC tissues

圖3 CRC組織中IL-35和IL-37的表達(dá)量與CRC患者生存時(shí)間的生存曲線Fig.3 Survival curves of the relationship between the expression of IL-35 or IL-37 in CRC tissues and the survival time among CRC patients

2.4 CRC患者癌組織中IL-35和IL-37的表達(dá)量與其他臨床病理學(xué)特征的單因素和多因素生存分析

單因素生存分析中顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（HR=2.80，95% CI：1.25～6.25，P=0.01）、腫瘤侵襲深度（HR=2.89，95% CI：1.25～6.70，P=0.01）及TNM分期（HR=2.48，95% CI：1.46～4.23，P=0.001）均為可以作為CRC患者預(yù)后的預(yù)測(cè)指標(biāo)。IL-35（HR=0.59，95% CI：0.27～1.29，P＞0.05）不能作為CRC患者預(yù)后的預(yù)測(cè)指標(biāo)。

多因素生存分析中顯示，IL-35（HR=0.39，95% CI：0.16～0.97，P=0.04）、腫瘤侵襲深度（HR=2.42，95% CI：1.05～5.60，P=0.04）是CRC患者術(shù)后生存的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)。其他因素如IL-37、性別、年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化及TNM分期在CRC的多因素分析中無顯著差異（表2）。

表2 CRC患者癌組織中IL-35和IL-37表達(dá)量與其他臨床病理學(xué)特征的單因素和多因素生存分析表Tab.2 Univariate and multivariate analysss of IL-35,IL-37 and clinicopathological factors affecting survival of patients with CRC

3 討 論

與健康人群相比，炎癥性腸病患者發(fā)生CRC的風(fēng)險(xiǎn)更高，并且腸炎的病程長和廣泛性是炎癥性腸病患者最終患有CRC的危險(xiǎn)因素［15-16］。炎癥性腸病中持續(xù)存在的腸道炎癥會(huì)顯著增加CRC的風(fēng)險(xiǎn)，并且結(jié)腸炎演變而來的CRC的存活率比普通CRC患者低［17］。

CRC的進(jìn)展會(huì)受到癌細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境之間復(fù)雜相互作用的影響。免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤進(jìn)展的影響已在各種癌癥類型中廣泛報(bào)道［18］。免疫細(xì)胞可以具有腫瘤抑制作用并在免疫監(jiān)視和平衡期控制腫瘤生長，同時(shí)，腫瘤進(jìn)展也可以由慢性炎癥誘導(dǎo)，刺激癌細(xì)胞的增殖并促進(jìn)血管生成和轉(zhuǎn)移［19］。

IL-35與腫瘤進(jìn)展及預(yù)后的關(guān)系尚未得到充分證明。在本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果中，IL-35蛋白在CRC組織中的表達(dá)量比非癌組織減少了50%，提示IL-35在CRC組織中的作用可能與抑制腫瘤細(xì)胞生長有關(guān)。當(dāng)IL-35表達(dá)水平高時(shí)，可能通過誘導(dǎo)G1期細(xì)胞周期停滯等功能，從而抑制CRC的發(fā)生，而IL-35表達(dá)水平降低，使IL-35在CRC組織中抑制腫瘤細(xì)胞生長的功能減弱，從而導(dǎo)致了CRC的進(jìn)展。

本研究結(jié)果顯示，CRC組織中IL-35和IL-37的高表達(dá)均可能有利于CRC患者術(shù)后生存時(shí)間的延長，這可能與IL-35和IL-37作為抗炎因子，其高表達(dá)有利于患者術(shù)后恢復(fù)有關(guān)。Mohammed等［20］也認(rèn)為抗炎藥物的應(yīng)用有助于CRC患者術(shù)后的治療。但在本研究中，CRC組織中IL-35和IL-37表達(dá)量的高低與患者術(shù)后生存時(shí)間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能是由于隨訪的患者數(shù)量較少所致。

本研究結(jié)果顯示，CRC組織中IL-37的蛋白表達(dá)量在單因素與多因素生存分析中均不是影響患者術(shù)后生存時(shí)間的因素。而IL-35的蛋白表達(dá)量在單因素生存分析中不顯著，但在多因素生存分析中可以作為影響CRC患者生存時(shí)間的獨(dú)立因素。其原因可能是在統(tǒng)計(jì)分析中IL-35的真實(shí)作用在單因素分析中被其他臨床病理學(xué)特征掩蓋，因此其在單因素生存分析中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而通過多因素分析去除其他影響因素后，顯現(xiàn)出了IL-35的蛋白表達(dá)量對(duì)CRC患者術(shù)后生存時(shí)間的真實(shí)作用，即IL-35可能是CRC患者術(shù)后生存的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)。

總之，IL-35和IL-37的表達(dá)水平在CRC癌組織與非癌組織中存在差異。癌組織中IL-35的表達(dá)水平可能是CRC患者術(shù)后生存的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)。