miR-203a-3p通過靶向調(diào)控GATA6抑制食管鱗癌細胞的增殖和侵襲

殷彩橋，方呈祥，陳 婷，黃 慧，鄭 軼，譚家武，張繼喬，張 輝

1.湖北民族大學附屬民大醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北 恩施 445000；

2.湖北民族大學附屬民大醫(yī)院腫瘤科，湖北 恩施445000

食管癌發(fā)病率和死亡率分別位于全球腫瘤的第8位和第6位，嚴重威脅著人類的生命和健康。食管鱗狀細胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）是食管癌的主要病理分型，在發(fā)展中國家，食管癌患者中約80%屬于ESCC，高死亡率與臨床診斷時病情已屬于晚期有關(guān)，中國是ESCC的高發(fā)地區(qū)［1-2］。微小核糖核酸（micro-ribonucleic acids，microRNAs，miRNAs）是一種包含19～22個核苷酸的進化保守的小的非編碼單鏈RNA，通過堿基配對在其目標信使RNA（messenger RNA，mRNA）的3’未翻譯區(qū)域（3’-UTR），參與調(diào)節(jié)不同細胞增殖、侵襲、遷移和凋亡等重要的腫瘤細胞生物學過程［3-4］。許多miRNAs高度保守，可以通過影響多種靶基因的表達來參與到多種細胞功能途徑中，而miRNAs表達的改變和腫瘤發(fā)生有關(guān)。miRNAs可以作為惡性腫瘤的早期診斷和臨床靶向治療的新的候選者［5-6］。miR-203a-3p是影響上皮細胞生長、分化以及功能的重要分子，并多在上皮源性腫瘤中發(fā)揮著防癌、抑癌的作用［7-9］。轉(zhuǎn)錄因子GTAT6是高度保守的鋅轉(zhuǎn)錄因子家族的一員，在早期胚胎發(fā)生過程中高表達，在后期胚胎發(fā)生過程中定位于內(nèi)皮細胞，從而在調(diào)控細胞分化和老化、器官形成和腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用［10］。不同的miRNAs通過不同的信號通路降低GATA6表達后降低細胞的增殖侵襲能力，影響乳腺癌［11］、食管癌［12-15］等腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程。我們通過www.mirbase.org和http://mircancer.ecu.edu等工具進行生物信息學分析提示GATA6是miR-203a-3p的潛在靶基因，miR-203a-3p可能通過調(diào)節(jié)GATA6在ESCC中發(fā)揮腫瘤抑制作用。

1 材料和方法

1.1 生物信息學分析和靶基因預測

主要利用www.mirbase.org和http://mircancer.ecu.edu網(wǎng)站以及其他在線工具進行生物信息學分析和miRNAs的靶基因預測。

1.2 細胞培養(yǎng)

ESCC細胞株（KYSE-70和KYSE-180）（由美國約翰斯·霍普金斯大學的Steve Meltzer博士實驗室贈送）在RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，輔以10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）和1%青霉素及1%鏈霉素，在37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 miRNAs轉(zhuǎn)染實驗

將KYSE-70和KYSE-180細胞（2×105細胞/孔）分別種植在24 孔細胞培養(yǎng)板中。在37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的的條件下溫育24 h，細胞生長達到了70%～80%的培養(yǎng)孔板面積時，使用LipofectamineTMRNAiMAX（購自美國Life Technologies公司）在Opti-MEM無血清培養(yǎng)液（購自美國Life Technologies公司）中將miR-203a-3p模擬物（miR-203a-3p mimic，Cat#4464066，購自美國Life Technologies公司）、miR-203a-3p模擬物陰性對照組（mock，miRVanaTMmiRNA Mimic，Negative Control，Cat# 4464059，購自美國Life Technologies公司）、miR-203a-3p抑制物（miR-203a-3p inhibitor，Cat# 4464084，購自美國Life Technologies公司）、miR-203a-3p抑制物陰性對照組（Inhibitor mock，miRVanaTMmiRNA Inhibitor，Negative Control，Cat# 4464077，購自美國Life Technologies公司）分別瞬時轉(zhuǎn)染到細胞中并繼續(xù)培養(yǎng)48 h，進行后續(xù)實驗。

1.4 RNA 提取和實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）檢測

用TRIzol試劑（購自美國Invitrogen公司）提取總RNAs，選擇TaqManTMMicroRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（購自美國Applied Biosystems公司），用采用miR-203a-3p莖環(huán)引物（lot#p179813-000 C03，購自美國Applied Biosystems公司）對RNAs進行反轉(zhuǎn)錄后進一步做RTFQ-PCR實驗。iScriptTMRT supermix（購自美國Applied Biosystems公司）用于CYBR Green對RNAs進行反轉(zhuǎn)錄，iQTM CYBR Green Supermix和GATA6引物（lot#p163274538，購自美國Applied Biosystems公司）分別用作RTFQ-PCR檢測。U6和18S作為內(nèi)參基因。使用QuantStudio Design&Analysis Software進行RTFQPCR分析。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測

對KYSE-70和KYSE-180采用瞬時轉(zhuǎn)染miRNAs，分成miR-203a-3p模擬物組和模擬物陰性對照組以及miR-203a-3p抑制物組和抑制物陰性對照組，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h，用磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered solution，PBS）洗2次，然后加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液（購自美國ThermoFisher公司），在冰上放置10 min，在12000×g離心10 min，收集上清液（即蛋白質(zhì)液），用納米液滴系統(tǒng)（nanodrop system）測量蛋白質(zhì)濃度。蛋白質(zhì)樣品煮沸10 min變性，裝入十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）（10%）凝膠進行電泳，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜（購自美國Millipore公司）上。用5%脫脂牛奶的PBS-T（含0.1%Tween）在室溫下對膜封閉30 min，然后加入一抗（兔多克隆GATA6抗體，1∶1000；購自美國ThermoFisherr公司，Cat#PA1-104），在4 ℃溫育24 h，PBS-T沖洗后再加入二抗（兔抗IgG 抗體，1∶2000；購自美國Epitomics公司），在37 ℃溫育2 h后PBS-T沖洗。用增強化學發(fā)光試劑（購自美國Pierce公司）檢測信號，在SuperSignal West Pico Chemoluminescence system（美國Pierce公司）檢測結(jié)合抗體。兔多克隆β-actin抗體（1∶1000；購自美國ThermoFisher公司，Cat#PA1-46296）作為對照組。整個實驗操作程序都嚴格按照試劑盒說明進行。

1.6 細胞存活率分析

將miRNAs轉(zhuǎn)染的細胞種植在96孔（1000個細胞/孔）細胞培養(yǎng)板中，在達到70%～80%的培養(yǎng)孔面積時，在每孔中加入活細胞代謝物還原劑噻唑藍［3-(4,5-dimethylthiahiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide，MTT］，并在37 ℃、C O2體積分數(shù)為5%的條件下溫育3 h，然后每孔加入100 μ L 二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO），在37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的溫育30 min，然后使用ELX800熒光分析儀（購自美國Bio-Tek公司）讀取吸光度（D）值。

1.7 細胞體外侵襲能力測定

使用Matrigel基質(zhì)膠（購自美國BD公司）進行了基底膜基質(zhì)凝膠細胞體外侵襲能力分析。在每個實驗開始之前，將500 μL的放置至室溫的無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基添加到上室和下室，在37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的細胞培養(yǎng)箱中水化2 h，將miR-203a-3p mimics、mock（NC miRmimics）和miR-203a-3p inhibitor、inhibitor-mock（NC miR-inhibitor）轉(zhuǎn)染48 h的細胞種植到上室（16×104個細胞/室）。下室加入含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液，在37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。用Diff-Quick staining solution試劑盒按試劑盒要求程序?qū)Ω鹘M侵襲細胞進行固定，染色，并使用倒置顯微鏡進行計數(shù)。細胞計數(shù)在5個不重疊的隨機區(qū)域進行，計數(shù)侵襲細胞。

1.8 雙螢光素酶報告實驗

將KYSE-70和KYSE-180細胞分別種植在24孔培養(yǎng)板（2×105細胞/孔），使用FuGENE轉(zhuǎn)染試劑（FuGENE Transfection Reagent，購自美國Promega公司）將100 ng的pEZX-GATA6-3’UTR （野生型GATA6：Cat#HimT088468-MT0；突變型GATA6：Cat#CS-HimT088468-MT05-01）與100ng pEZX-miR-203a-3p（野生型miR-203a-3p：Cat#HimR0249-MR04-10，掠奪型pEZX-scrambled，GeneCopoeia）進行聯(lián)合質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，使用雙螢光素酶報告系統(tǒng)（secretepair dual luciferase reporter assay，ThermoFisher，Cat#LF032）檢測相對螢光素酶活性，每個樣品都是用Glomax儀器（購自美國Promega公司）測定3次。

1.9 FFPE標本微解剖及RNAs提取

為檢測miR-203a-3p和GATA6在食管癌患者食管組織的表達水平，對ESCC患者的4%的甲醛溶液固定石蠟包埋（formalin-fixed and paraffin-embedded，F(xiàn)FPE）標本進行微解剖，用ABI RecoverAllTM總核酸分離試劑盒（購自美國Ambion公司）分別提取食管惡性腫瘤組織與異型增生組織總RNAs。

1.10 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學處理。數(shù)據(jù)以表示，采用雙側(cè)Student’st檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-203a-3p在ESCC轉(zhuǎn)染實驗中的表達水平

提取轉(zhuǎn)染miR-203a-3p mimics、mock（NC miR-mimics）和miR-203a-3p inhibitor、inhibitormock（NC miR-inhibitor）48 h的KYSE-70和KYSE-180細胞的總RNA，進一步做TaqMan RTFQ-PCR。結(jié)果顯示，與對照組比較，miR-203a-3p在miR-203a-3p mimics轉(zhuǎn)染組的表達明顯升高（P＜0.01），而其表達在miR-203a-3p inhibitor組中明顯下降（P＜0.01，圖1），提示miRNAs轉(zhuǎn)染成功。

圖1 miR-203a-3p在ESCC miRNAs轉(zhuǎn)染實驗中的表達水平Fig.1 miR-203a-3p expression in ESCC miRNAs transfection assay

2.2 miR-203a-3p下調(diào)GATA6基因的表達水平

提取轉(zhuǎn)染miR-203a-3p mimics、mock（NC miR-mimics）和miR-203a-3p inhibitor、inhibitormock（NC miR-inhibitor）48 h的KYSE-70和KYSE-180細胞的總RNA，進一步做CYBR green RTFQ-PCR檢測GATA6的表達水平。結(jié)果顯示，與對照組相比較，GATA6在miR-203a-3p mimic轉(zhuǎn)染組中的表達水平明顯降低，而在miR-203a-3p inhibitor轉(zhuǎn)染組中的表達明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。GATA6和miR-203a-3p的表達水平呈反向關(guān)系（圖2）。

2.3 miR-203a-3p下調(diào)GATA6蛋白的表達水平

從轉(zhuǎn)染48 h的培養(yǎng)細胞中提取蛋白質(zhì)后嚴格按Western blot檢測方法進行操作，用Image J軟件對Western blot條帶掃描后進行定量和統(tǒng)計學處理。結(jié)果顯示，與對照相比，GATA6蛋白（45×103）條帶信號在miR-203a-3p轉(zhuǎn)染組減弱，而在miR-203a-3p inhibitor轉(zhuǎn)染組中的信號增強（P＜0.05，圖3）。

2.4 miR-203a-3p抑制細胞增殖能力

MTT檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，在KYSE-70細胞株中細胞增殖能力在miR-203a-3p mimic轉(zhuǎn)染組中下降，而在miR-203a-3p轉(zhuǎn)染組中卻升高，其差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），KYSE-180細胞株中雖然差異無統(tǒng)計學意義，但其趨勢卻與KYSE-70細胞株一致（圖4）。

圖2 ESCC miRNAs轉(zhuǎn)染實驗中miR-203a-3p下調(diào)GATA6的表達水平Fig.2 The expression of GATA6 was down-regulated by miR-203a-3p transfection in the ESCC cell lines

圖3 Western blot檢測發(fā)現(xiàn)miR-203a-3p能降低GATA6蛋白表達水平Fig.3 miR-203a-3p decreased GATA6 protein expression by Western blot assay in ESCC cell lines

圖4 MTT檢測中miR-203a-3p降低ESCC細胞增殖能力Fig.4 miR-203a-3p decreased cell viability detected by MTT assay in ESCC cells

2.5 miR-203a-3p抑制細胞侵襲能力

使用Matrigel基質(zhì)膠進行細胞體外侵襲能力實驗。結(jié)果顯示，與對照組相比較，相對侵襲細胞數(shù)值/視野在miR-203a-3p mimic轉(zhuǎn)染組中均明顯下降（P＜0.01），而在miR-203a-3p inhibitor轉(zhuǎn)染組中KYSE-70細胞株卻升高（P＜0.05），差異均有統(tǒng)計學意義（圖5）。

圖5 miR-203a-3p降低ESCC細胞系的侵襲能力Fig.5 miR-203a-3p decreased invasion in ESCC cell lines

2.6 miR-203a-3p是通過與GATA6的3’-UTR的結(jié)合部位直接綁定而起到靶向調(diào)控作用

雙螢光素酶報告分析結(jié)果顯示，與miR-203a-3p掠奪型+GATA6野生型組和miR-203a-3p野生型+GATA6突變型組相比，相對螢光素酶活性在miR-203a-3p野生型+GATA6野生型組中明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。miR-203a-3p是通過與GATA6的3’-UTR的結(jié)合部位直接綁定而起到靶向調(diào)控作用（圖6）。

圖6 miR-203a-3p通過直接綁定在GATA6的3’-UTR而發(fā)揮靶向調(diào)控作用Fig.6 miR-203a-3p targets GATA6 by directly binding to its 3’-UTR

2.7 食管鱗癌患者惡性腫瘤組織中miR-203a-3p低表達而GATA6高表達

用RTFQ-PCR檢測食管鱗癌患者惡性腫瘤組織與異型增生組織中miR-203a-3p和GATA6，與異型增生組織相比較，100%（10/10）食管鱗癌患者miR-203a-3p在惡性腫瘤組織中表達下調(diào)，而GATA6的表達水平上調(diào)（圖7）。

圖7 食管鱗癌病人惡性腫瘤組織中miR-203a-3p低表達而GATA6高表達Fig.7 Down-regulation of miR203a-3p and up-regulation of GATA6 in malignant tissues of ESCC patient

3 討 論

我們的生物信息學分析表明，miR-203a-3p是食管癌的一種腫瘤抑制性miRNAs，GATA6是其潛在的靶向調(diào)控基因，本研究目的就是驗證我們的假設(shè)是否成立。RTFQ-PCR實驗發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，GATA6基因和蛋白的表達水平在miR-203a-3p mimic轉(zhuǎn)染組中明顯降低，而在miR-203a-3p inhibitor轉(zhuǎn)染組中卻明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。進一步Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，GATA6蛋白（相對分子質(zhì)量45×103）條帶信號在miR-203a-3p轉(zhuǎn)染組中減弱，而在miR-203a-3p inhibitor轉(zhuǎn)染組中的信號增強。RTFQ-PCR及Western blot實驗結(jié)果一致，證明GATA6和miR-203a-3p的表達水平呈反向關(guān)系，在ESCC中miR-203a-3p可明顯下調(diào)GATA6的表達。miR-203a-3p位于染色體14q32.33的區(qū)域，同時也是位于該染色體的一段不穩(wěn)定的易丟失區(qū)域，在許多類型的惡性腫瘤中表達缺失或下調(diào)，成熟的miR-203a-3p被認為具有重要的抑癌作用。GATA是基因啟動子中一段保守序列，GATA6是GATA家族中的一員，作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，調(diào)節(jié)中胚層及內(nèi)胚層來源的細胞分化，在多種腫瘤疾病中成為促癌基因［10-15］。本研究顯示，miR-203a-3p mimic轉(zhuǎn)染后的KYSE-70細胞株中細胞增殖生存能力明顯下降（P＜0.05），雖然在KYSE-180中差異無統(tǒng)計學意義，但其趨勢卻與KYSE-70一致。Liu等［16］在胃賁門腺癌中和Chi等［17］在非小細胞肺癌中以及Jiang等［8］在鼻咽癌中的研究均提示miR-203a-3p可以降低腫瘤細胞增殖的作用，本研究結(jié)果與以上研究結(jié)論一致，miR-203a-3p可抑制ESCC細胞增殖。在臨床上不可切除的腫瘤或轉(zhuǎn)移是造成部分患者死亡的原因，本研究的Matrigel基質(zhì)膠細胞體外侵襲能力實驗結(jié)果顯示，在miR-203a-3p mimic轉(zhuǎn)染組中相對侵襲細胞數(shù)值/視野均明顯下降（P＜0.01），侵襲細胞顯著減少，由此可見miR-203a-3p可降低食管癌細胞的增殖及侵襲能力。這為miR-203a-3p抑制ESCC中的細胞侵襲和轉(zhuǎn)移提供了重要線索。miR-203a-3p抑制細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的研究結(jié)果在肺癌［18-19］及乳腺癌［20］和食管癌［21］等之中也得到證實。為了證實GATA6的3'-UTR是否為miR-203a-3p在ESCC細胞的功能靶點，進一步測定質(zhì)粒聯(lián)合轉(zhuǎn)染細胞中的螢光素酶活性，結(jié)果顯示，相對螢光素酶活性在miR-203a-3p野生型+GATA6野生型組中明顯降低，提示miR-203a-3p是通過與GATA6的3’-UTR的結(jié)合部位直接綁定而起到靶向調(diào)控作用。另外，本研究檢測了10例食管鱗癌患者的食管惡性腫瘤組織與周圍異型增生組織中miR-203a-3p及GATA6的表達水平，發(fā)現(xiàn)與異型增生組織相比較，100%（10/10）食管鱗癌患者miR-203a-3p在惡性腫瘤組織的表達下調(diào)，而GATA6的表達水平上調(diào)，進一步印證了我們在細胞水平的研究結(jié)果。本研究的不足之處是臨床病例數(shù)較少，我們將收集更多臨床患者標本來進一步驗證miR-203a-3p對GATA6的調(diào)控作用。綜合以上所有實驗結(jié)果，我們認為miR-203a-3p通過靶向調(diào)控GATA6抑制食管鱗癌細胞的增殖和侵襲。