沉默信息調節(jié)因子過表達或谷氨酰胺剝奪對腎透明細胞癌細胞凋亡、增殖的影響

復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院檢驗科，復旦大學上海醫(yī)學院腫瘤學系，上海 200032

腎癌是泌尿系統(tǒng)的常見腫瘤之一，腎透明細胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）占腎癌的70%～75%［1］。局限性ccRCC手術后尚無標準輔助治療方案，同時轉移性ccRCC無標準的治療方案，通常采用以內科為主、外科手術為輔的綜合治療，因此尋求新的治療手段迫在眉睫。谷氨酰胺（glutamine，Gln）是動物組織中重要的氮源。在腫瘤細胞中，Gln代謝處于高水平［2］，也會與宿主細胞競爭血液循環(huán)中的Gln，并引起Gln代謝重編程［3］。Gln代謝產生谷胱甘肽、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phostate，NADPH）等還原性物質抵抗細胞凋亡，抗氧化物質含量的變化會引起微環(huán)境的改變，進而影響ccRCC對鉑類等細胞化療藥物的敏感性［4］，因此調控谷氨酰胺代謝可成為治療ccRCC的新手段。

沉默信息調節(jié)因子4（silent information regulator 4，SIRT4）位于線粒體基質，調節(jié)多種代謝酶活性和參與氧化應激的過程［5］，可以通過ADP-核糖基化抑制谷氨酰胺脫氫酶活性［6］，抑制谷氨酰胺代謝，因此被認為是“glutamine gatekeeper”［7］?，F(xiàn)有研究［8］表明，SIRT4作為一個抑癌基因參與腫瘤的發(fā)生過程。在人類癌癥和小鼠腫瘤模型中發(fā)現(xiàn)SIRT4具有腫瘤抑制作用［9-10］。此外，在正常細胞中，DNA損傷時Gln代謝明顯降低，通過控制周期停滯來限制危害，但是如果SIRT4缺失或低表達，這種保護性限制將會被打破，促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［11］。雖然在SIRT4在肝癌［12］、非小細胞肺癌［13］等癌種中可抑制腫瘤進展，但SIRT4對ccRCC發(fā)生、發(fā)展的影響尚不清楚，本研究探討SIRT4是否通過抑制谷氨酰胺代謝影響ccRCC增殖、凋亡。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系

Caki-2細胞由復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院泌尿外科贈送。

1.1.2 主要試劑

抗體SIRT4（sc-135797）、caspase-3（sc-56053）、caspase-9（sc-133109） 購自美國Santa Cruz公司，抗體Bax（50599-2-ig）、蛋白質印跡法（Western blot）二抗（SA00001-1、SA00001-2）購自美國Proteintech公司，蛋白marker（#26616）購自美國Thermo Fisher公司，cocktail（P8340）購自美國Sigma公司，HRP-ECL曝光液（36208ES60）購自上海翊圣生物科技有限公司，酮戊二酸（α-K G，CAS#328-50-7）、青-鏈霉素（15140122）購自美國Gibco公司，LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司，PrimeScript?RT reagent Kit購自寶生物工程（大連）有限公司，ROS檢測試劑2’,7’-dichlorofluorescein-diacetate（DCFH-DA，HYD0940）、線粒體膜電位檢測試劑盒（C2006）購自上海碧云天生物技術有限公司。細胞計數(shù)試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）檢測試劑（CK04）購自東仁化學科技（上海）有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 SIRT4和SIRT4-H161Y過表達慢病毒液生產

從HEK-293T細胞系中提取RNA，反轉錄為cDNA后，用相應引物擴增為雙鏈DNA，經雙酶切裝載于pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro，連同輔助質粒psPAX2、pMD2按照4∶3∶1一起轉染HEK-293T細胞，48 h后收取病毒液，0.45 μm濾過器過濾。

1.2.2 穩(wěn)定細胞株的獲得和細胞培養(yǎng)

Caki-2細胞用含有10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的RPMI-1640（購自美國Gibco公司）培養(yǎng)于CO2體積分數(shù)為5%、37 ℃的溫箱中。利用0.25%胰酶（購自美國Gibco公司）進行細胞傳代。用病毒液感染Caki-2細胞24 h后，用1～2 μg/mL的嘌呤霉素篩選1周后獲得穩(wěn)定表達的細胞系。

1.2.3 細胞增殖檢測

將細胞以1000個/孔的密度種于96孔板中，在檢測時間點更換新的培養(yǎng)基，并在每孔加入10 μL CCK-8檢測試劑（CK04），37 ℃溫育2 h后，在450 nm波長讀取吸光度（D）值。

1.2.4 細胞克隆形成

將細胞按照1000個/孔種于6孔板種，用含有10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)10～14 d后，4%多聚甲醛固定10 min后用1%的結晶紫染色，進行細胞克隆計數(shù)。

1.2.5 細胞凋亡檢測

Caki-2細胞用0.25%胰酶消化后，400×g離心5 min，用磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered solution，PBS）洗滌2次，Annexin V-FITC和碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色15 min，用BD流式細胞儀檢測凋亡情況。

1.2.6 細胞線粒體膜電位檢測

細胞按照2×104個/孔種于24孔板中，用不同培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。取1個孔細胞用CCCP處理30 min作為陽性對照，所有待檢測細胞中加入500 μL JC-1工作液處理37 ℃處理30 min，PBS洗滌2次。JC-1單體的激發(fā)波長為529 nm，而JC-1二聚體的激發(fā)波長為590 nm。通過流式細胞儀或激光共聚焦顯微鏡檢測細胞線粒體膜電位的改變。

1.2.7 NADPH含量檢測

當細胞長滿約1×106個細胞時，吸凈培養(yǎng)液，用移液器加入200 μL的NADP+/NADPH提取液，裂解細胞。13500×g，4 ℃離心5～10 min，取上清作為待測樣品備用。配置NADPH標準品和標準曲線，加入檢測樣品，37 ℃避光溫育10 min，終止顯色，測量450 nm處的吸光度。

1.2.8 細胞內ROS檢測

細胞用10 μmol/L DCFH-DA工作液37 ℃處理30 min，PBS洗滌1次，胰酶消化，BD流式細胞儀用538 nm發(fā)射波長檢測。

1.2.9 蛋白質印跡法（Western blot）檢測

將細胞用IP裂解液加入cocktail和PMSF在冰上裂解30 min，4 ℃ 360×g離心10 min，取上清，用BCA試劑盒（P0010，購自上海碧云天生物技術有限公司）蛋白定量后，加入上樣緩沖液，100 ℃煮樣5 min。將等量的蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，通過電印記法轉移到PVDF膜上，10%的脫脂牛奶封閉1 h后，按照目的條帶大小切割溫育一抗4 ℃過夜。第2天用對應屬性的二抗室溫溫育1 h，用HRP-ECL熒光法檢測目的蛋白的水平。

1.3 統(tǒng)計學處理

采取GraphPad Prism 6或SPSS 16.0進行統(tǒng)計分析，兩組之間比較用t檢驗，多組之間統(tǒng)計用ANOVA，ROS檢測后分析用FlowJo。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 SIRT4過表達或Gln剝奪對Caki-2細胞增殖、生長的影響

Western blot結果表明，構建的SIRT4和SIRT4-H161Y（SIRT4功能突變體）載體能夠過表達相應蛋白（圖1A）。CCK-8檢測結果表明，Gln剝奪48 h能夠顯著降低Caki-2細胞的增殖速度（P＜0.001）；正常Gln培養(yǎng)時，SIRT4過表達（overexpression，OE）能抑制細胞增殖（P＜0.05，圖1B）。為進一步探索SIRT4抑制Gln在Caki-2細胞增殖中的作用，我們分析了SIRT4突變體H161Y以及回補Gln代謝產物α-KG后細胞增殖的變化，結果表明，在正常Gln培養(yǎng)時，過表達突變體不能抑制細胞增殖；另外，Gln剝奪組回補α-KG后，即使過表達SIRT4也不能抑制細胞增殖（圖1C）。正常Gln培養(yǎng)時，SIRT4-OE能夠減少細胞克隆數(shù)目，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而SIRT4-H161Y組卻無明顯差異。但如果長期缺乏Gln，Caki-2細胞無法生長，無克隆形成（圖1D）。以上結果表明，SIRT4可通過抑制谷氨酰胺脫氫酶（glutamate dehydrogenase，GDH），減少Gln的攝入量，從而抑制Caki-2細胞增殖；在Gln剝奪后其細胞增殖抑制作用更為明顯。

2.2 Gln代謝生成NADPH影響細胞內ROS

由于Gln代謝過程中會產生相當比例的NADPH，可作為抗氧化分子中和細胞內ROS，進而抵抗凋亡。因此NADPH含量檢測顯得尤為重要，檢測結果表明，Gln剝奪48 h后NADPH生成量顯著減少。另外，正常Gln培養(yǎng)的Caki-2細胞，SIRT4-OE組NADPH生成量比pCDH-con和SIRT-H161Y組減少（圖2A）。氧化應激微環(huán)境是影響腫瘤生長、細胞凋亡的重要因素，為進一步探索SIRT4抑制Gln代謝對Caki-2細胞內ROS的影響，我們用DCFH-DA檢測ROS水平，結果發(fā)現(xiàn)，正常Gln培養(yǎng)的Caki-2細胞中，SIRT4-OE組ROS水平較其他兩組比明顯升高；但細胞Gln剝奪后均會產生高水平的ROS，pCDH-con、SIRT4-OE和SIRT-H161Y這3組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，圖2B）。

圖1 SIRT4過表達和Gln剝奪均能抑制細胞增殖Fig.1 SIRT4 overexpression and glutamine deprivation inhibit cell proliferation

圖2 SIRT4-OE或Gln剝奪使得NADPH生成減少，ROS水平增高Fig.2 SIRT4-OE or glutamine deprivation reduces NADPH production and increases ROS levels

2.3 過表達SIRT4或Gln剝奪對Caki-2細胞凋亡的影響

線粒體膜電位的下降是細胞凋亡早期的一個標志性事件，非Gln剝奪的細胞，過表達SIRT4后，綠色熒光（JC-1）/紅色熒光（JC-1 aggregates）比例升高，意味著線粒體膜電位下降。同時Gln剝奪后pCDH-con、SIRT4-OE、SIRT-H161Y此3組細胞的線粒體膜電位都有明顯下降（圖3A）。此外，凋亡檢測結果表明，正常Gln培養(yǎng)時，pCDH-con、SIRT4-OE和SIRT4-H161Y細胞凋亡比例分別是2.777%、7.143%和2.363%，SIRT4過表達引起細胞凋亡增加（P＜0.05）；Gln剝奪引起各組細胞凋亡大幅度增加（圖3B）。Bax、caspase-3、caspase-9均是凋亡相關蛋白，我們采用Western blot檢測這些蛋白的表達變化來進一步探索SIRT4或Gln剝奪對凋亡的影響。結果顯示，非Gln剝奪的Caki-2細胞，SIRT4過表達凋亡相關分子表達量都增加，同時Gln剝奪使得這些分子增加更為明顯（圖3C）。

圖3 SIRT4-OE或Gln剝奪促進細胞凋亡Fig.3 SIRT4-OE or Gln deprivation promotes apoptosis

3 討 論

ccRCC具有明顯的代謝重編程特征，與葡萄糖、谷氨酰胺、脂肪酸等代謝途徑發(fā)生改變有關?？衫酶淖兊拇x途徑作為潛在的治療策略，SIRT4就是一個控制Gln代謝的重要分子?，F(xiàn)有研究［8］表明，SIRT4作為一個抑癌基因參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程。在人類癌癥和小鼠腫瘤模型中，SIRT4可以通過影響Gln代謝發(fā)揮其抑制腫瘤的作用［9-10］，目前尚無SIRT4在ccRCC中作用的研究。本研究發(fā)現(xiàn)，Gln剝奪對ccRCC細胞Caki-2的增殖、凋亡影響最為明顯。然而，谷氨酰胺被眾多細胞途徑所利用，包括核苷酸的產生［14］，DNA［15］和RNA［16］的合成，雖然腫瘤細胞對Gln十分依賴，存在“谷氨酰胺成癮”現(xiàn)象，同時除了葡萄糖以外，Gln也是哺乳動物細胞用于生長和增殖的主要元素之一，對正常細胞同樣是必不可少的，因此徹底剝奪Gln是對腫瘤細胞最有效卻并非是一個最好的治療方法。如果能夠增加SIRT4在ccRCC腫瘤組織中的表達量（如SIRT4激活劑）就能減少腫瘤細胞Gln的利用，發(fā)揮抑制腫瘤生長、促進凋亡的作用。除此之外，抑制Gln代謝減少NADPH生成使得ROS顯著升高，腫瘤細胞比正常細胞對高濃度的ROS更敏感，會因細胞結構不穩(wěn)定等原因導致腫瘤細胞走向凋亡壞死。綜上所述，SIRT4對ccRCC而言是一個有利分子，或將成為阻止腫瘤攝取Gln潛在的治療靶向分子。