Sema3A通過調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化/基質(zhì)金屬蛋白酶-2參與上皮性卵巢癌轉(zhuǎn)移

復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海 200240

卵巢癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，是全球第5大導(dǎo)致女性死亡的腫瘤相關(guān)性疾病。卵巢癌高死亡率是因?yàn)樵摬≡诖_診時(shí)70%的患者已是晚期，疾病的范圍已經(jīng)超出卵巢而擴(kuò)散到腹腔和腹膜后淋巴結(jié)，而晚期卵巢癌的5年生存率約為30%［1］。上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer，EOC）是最常見的卵巢癌組織學(xué)類型，其發(fā)病具有隱蔽性，缺乏有效的早期篩查方法，大多數(shù)患者確診時(shí)已發(fā)生遠(yuǎn)處腹腔轉(zhuǎn)移［2］。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition，EMT）是上皮細(xì)胞失去其頂端-基底極性和細(xì)胞-細(xì)胞間黏附，成為更具侵襲能力的梭形間充質(zhì)細(xì)胞。大量研究發(fā)現(xiàn)，EMT在EOC的侵襲轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞向遠(yuǎn)端散播［3-5］。

Sema家族參與腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和血管新生，且在腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移中起重要作用。Sema3A是Sema3家族中最典型和最先被確定的神經(jīng)導(dǎo)向因子，其基因被認(rèn)為是候選的抑癌基因［6］。研究［7］發(fā)現(xiàn)，低水平的Sema3A與EOC患者的不良預(yù)后有關(guān)，提示Sema3A可能參與EOC的發(fā)生、發(fā)展，然而Sema3A與EOC轉(zhuǎn)移的研究少見報(bào)道。本研究首先檢測(cè)腹腔轉(zhuǎn)移和無(wú)腹腔轉(zhuǎn)移的EOC卵巢組織中Sema3A的表達(dá)，再通過慢病毒感染的方式，構(gòu)建Sema3A過表達(dá)和沉默的卵巢癌細(xì)胞系，體外實(shí)驗(yàn)分析Sema3A與卵巢癌細(xì)胞侵襲遷移的關(guān)系，并探討其可能機(jī)制，為EOC的治療提供潛在的分子靶點(diǎn)。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

選取2018年3月—12月于復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院婦產(chǎn)科住院初治的20例腹腔轉(zhuǎn)移的EOC患者（轉(zhuǎn)移組）和20例無(wú)腹腔轉(zhuǎn)移的EOC患者（非轉(zhuǎn)移組）的卵巢組織蠟塊標(biāo)本。各組病例年齡在40歲～60歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理學(xué)檢查和術(shù)中證實(shí)為腹腔轉(zhuǎn)移EOC和無(wú)腹腔轉(zhuǎn)移EOC；② 不合并其他腫瘤；③均為第1次接受手術(shù)治療，術(shù)前無(wú)放療和化療史。排除標(biāo)準(zhǔn)：①其他病理學(xué)類型的卵巢癌；② 合并其他腫瘤；③術(shù)前行其他特殊治療。所有患者均簽署知情同意書，且經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑和細(xì)胞系

人類卵巢癌細(xì)胞系來(lái)自復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室；HEK-293T細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC），Sema3A cDNA和Sema3A shRNA質(zhì)粒購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司，RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，胰酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板購(gòu)自美國(guó)Corning公司，蘇木精染液購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司，TRIzol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，PrimeScriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，F(xiàn)astStart Universal SYBR Green Master（Rox）試劑購(gòu)自瑞士Roche公司，BCA蛋白濃度分析試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司，transwell培養(yǎng)板購(gòu)自美國(guó)Costar公司，Sema3A抗體（ab23393）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，E-cadherin抗體（60335-1-Ig）和N-cadherin抗體（22018-1-AP）均購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司，ZO-1抗體（8193S）、Slug抗體（9585S）和β-actin抗體（4790S）均購(gòu)自美國(guó)CST公司，MMP-2抗體（sc-10736）購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，HRP標(biāo)記的山羊抗兔、抗鼠二抗均購(gòu)自北京中杉金橋生物工程有限公司。

1.3 卵巢癌細(xì)胞的培養(yǎng)

從液氮中取出凍存的卵巢癌細(xì)胞系迅速?gòu)?fù)蘇，用含有10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基于CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、37 ℃條件下培養(yǎng)，每24 h更換1次培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)，細(xì)胞狀態(tài)良好，進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.4 構(gòu)建Sema3A過表達(dá)和沉默細(xì)胞系

準(zhǔn)備6 cm培養(yǎng)皿，鋪種1.2×106個(gè)HEK-293T細(xì)胞，培養(yǎng)過夜。利用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將Sema3A-cDNA和病毒包裝質(zhì)粒psPAX2和pVSVG（或Sema3A shRNA和病毒包裝質(zhì)粒psPAX2和pMD2.G）按一定的比例導(dǎo)入HEK-293T中，培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞上清液，經(jīng)0.45 μm濾器過濾后分裝備用。

于6孔板中分別鋪種卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780和SK-OV-3，培養(yǎng)過夜后，分別加入上述病毒液及polybrene（8 μg/mL）。其中A2780中加入Sema 3A cDNA，SK-OV-3中加入Sema 3A shRNA。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，換新鮮培養(yǎng)基，并加入puromycin（1 μg/mL）進(jìn)行藥篩，48 h后，降低藥物濃度，繼續(xù)藥篩兩周后得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Sema3A cDNA和Sema3A shRNA的卵巢癌細(xì)胞株。對(duì)照組中按上述步驟導(dǎo)入空載質(zhì)粒（vector）和Luciferase shRNA（shLuc）。

1.5 免疫組織化學(xué)法

將轉(zhuǎn)移組和非轉(zhuǎn)移組卵巢癌組織經(jīng)10%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋后進(jìn)行4 μm連續(xù)切片。常規(guī)脫蠟水化后，利用抗原修復(fù)液（pH為9.0 EDTA）進(jìn)行抗原修復(fù)，利用3%雙氧水室溫溫育20 min，TBST沖洗3次；用10%山羊血清室溫封閉20 min；每個(gè)組織滴加100 μL Sema3A兔多克隆抗體（稀釋比1∶50），4 ℃溫育過夜；次日室溫放置15 min，TBST沖洗3次；每張切片滴加100 μL山羊抗兔二抗，室溫溫育45 min，TBST沖洗3次；每張切片滴加100 μL DAB，鏡下觀察，自來(lái)水終止顯色。蘇木精復(fù)染，鹽酸乙醇分化，返藍(lán)液返藍(lán)。最后干燥封片，顯微鏡下觀察拍照。加入磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered solution，PBS）代替一抗做為陰性對(duì)照組。

免疫組織化學(xué)結(jié)果判定：Sema3A定位于細(xì)胞質(zhì)，陽(yáng)性為棕黃色。染色強(qiáng)度評(píng)分：0分（陰性），1分（弱），2分（中），3分（強(qiáng)）。染色陽(yáng)性率評(píng)分：0分（陰性），1分（1%～20%），2分（21%～40%），3分（41%～60%），4分（61%～80%），5分（81%～100%）。以“染色強(qiáng)度評(píng)分”和“染色陽(yáng)性率評(píng)分”的乘積為總評(píng)分進(jìn)行分組，平均值6.25分，≤6.25分為低表達(dá)組，＞6.25分為高表達(dá)組。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）

TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptTMRT reagent kit with g DN AEraser）將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板采用RTFQ-PCR試劑盒［FastStart Universal SYBR Green Master（Rox）］進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)。引物如下：Sema3A上游引物為5’-GTGCCAAGGCTGAAATTA TCCT-3’，下游引物為5’-CCCACTTGCATTC ATCTCCTTCT-3’；G APDH上游引物為5’-AGGTCGGAGTCAACGGATTTG-3’，下游引物為5’-GTGATGGCATGGACTGTGGT-3’。分析Sema3A相對(duì)mRNA的表達(dá)水平，以GAPDH為內(nèi)參，使用2-ΔΔCt方法分析結(jié)果，公式為：ΔCt＝CtSema3A-CtGAPDH。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.7 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組卵巢癌細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，接種于transwell小室的上室中。每個(gè)小室接種2×104個(gè)細(xì)胞于200 μL無(wú)血清培養(yǎng)基中。在transwell小室的下室中加入500 μL含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，37 ℃溫育20 h。用PBS洗去培養(yǎng)基后將小室置于4%多聚甲醛中固定15 min，用0.1%結(jié)晶紫染色10 min，并用棉簽將殘留在上室中的細(xì)胞擦除干凈。然后用雙蒸水將小室殘留的結(jié)晶紫染液洗滌干凈，在顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取5個(gè)視野中的細(xì)胞進(jìn)行拍照和計(jì)數(shù)。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.8 劃痕遷移實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組卵巢癌細(xì)胞系，以5×104個(gè)/孔的密度培養(yǎng)至細(xì)胞鋪滿單層，用10 μL移液器吸嘴沿培養(yǎng)板底部垂直劃線，用PBS沖洗3次，在顯微鏡下拍照記錄兩組細(xì)胞劃痕寬度。更換無(wú)血清培養(yǎng)基，并在37 ℃的培養(yǎng)箱中再培養(yǎng)24 h，記錄兩組細(xì)胞劃痕寬度。使用Image-J軟件評(píng)估24 h時(shí)間點(diǎn)與零時(shí)間相比傷口閉合的百分比。

1.9 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測(cè)

收集各組卵巢癌細(xì)胞，并用預(yù)冷的PBS洗滌兩次。用RIPA裂解液裂解細(xì)胞30 min，然后12000×g離心15 min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的Eppendorf試管中，全程需保持4 ℃以防蛋白降解。使用BCA蛋白濃度分析試劑盒進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。取20 μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，并將蛋白從膠上轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，將膜置于5%的脫脂牛奶中室溫封閉1 h，并用相應(yīng)的一抗溫育過夜，經(jīng)TBST洗滌3次后，加入二抗室溫下溫育1 h，TBST洗滌3次后加入顯色液進(jìn)行顯色及曝光。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，Sema3A陽(yáng)性率與病理學(xué)參數(shù)的相關(guān)性采用t檢驗(yàn)，計(jì)量資料以x±s表示。采用Graphpad Prism 5.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及作圖，兩組間比較采用獨(dú)立t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)移組和非轉(zhuǎn)移組卵巢癌組織中Sema3A的表達(dá)情況

免疫組織化學(xué)法檢測(cè)轉(zhuǎn)移組和非轉(zhuǎn)移組卵巢癌組織中的Sema3A表達(dá)水平分別為2.73±2.61和7.27±3.61。轉(zhuǎn)移組的Sema3A表達(dá)水平低于非轉(zhuǎn)移組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖1）。

圖1 Sema3A在腹腔轉(zhuǎn)移和非腹腔轉(zhuǎn)移的上皮性卵巢癌中的表達(dá)情況Fig.1 Expression of Sema3A in epithelial ovarian cancer tissues with peritoneal metastasis and non-peritoneal metastasis

2.2 分析轉(zhuǎn)移組中Sema3A與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系

轉(zhuǎn)移組中Sema3A表達(dá)與患者年齡、病理學(xué)類型、腫瘤大小無(wú)關(guān)（P＞0.05），而與國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO）分期、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＜0.05，表1）。

2.3 Sema3A在卵巢癌細(xì)胞系中的表達(dá)及構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株

Western blot和RTFQ-PCR檢測(cè)5種常見卵巢癌細(xì)胞系HEY、OVCA429、SK-OV-3、OVCA433和A2780中Sema3A蛋白和mRNA水平，發(fā)現(xiàn)其在A2780中表達(dá)水平較低，而在SKOV-3中表達(dá)水平較高（圖2A～B）。因此，我們?cè)贏2780中導(dǎo)入vector和Sema3A cDNA，構(gòu)建對(duì)照組（A2780 vector）和過表達(dá)Sema3A的A2780細(xì)胞株（A2780 Sema3A）；在SK-OV-3中導(dǎo)入shLuc和Sema3A shRNA，構(gòu)建對(duì)照組（SKOV-3shLuc）和沉默Sema3A的SK-OV-3細(xì)胞株（SK-OV-3 shSema3A）。Western blot和RTFQPCR檢測(cè)Sema3A的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入Sema3AcDNA后，Sema3A的表達(dá)明顯升高；導(dǎo)入Sema3A shRNA后，Sema3A的表達(dá)明顯下降（圖2C～D），說明過表達(dá)和沉默Sema3A卵巢癌細(xì)胞株構(gòu)建成功，可用于下一步實(shí)驗(yàn)。

表1 Sema3A 的表達(dá)與腹腔轉(zhuǎn)移上皮性卵巢癌患者臨床參數(shù)間的相關(guān)性分析Tab.1 Correlation analysis between the expression of Sema3A and clinical parameters in patients with peritoneal metastatic epithelial ovarian carcinoma［n (%)］

2.4 Sema3A抑制卵巢癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力

進(jìn)一步通過transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Sema3A表達(dá)水平的變化是否引起卵巢癌細(xì)胞侵襲、遷移能力的改變。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)組侵襲的細(xì)胞數(shù)顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），沉默組侵襲的細(xì)胞數(shù)顯著高于對(duì)照組（P＜0.05，圖3A～B）；劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，24 h后過表達(dá)組細(xì)胞劃痕寬度百分比顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），沉默組細(xì)胞劃痕寬度百分比顯著低于對(duì)照組（P＜0.05，圖3C～D），表明Sema3A抑制卵巢癌細(xì)胞的侵襲和遷移行為。

2.5 Sema3A抑制卵巢癌轉(zhuǎn)移的可能機(jī)制

為了研究Sema3A是否調(diào)控EMT相關(guān)蛋白和MMP-2的表達(dá)，我們通過Western blot發(fā)現(xiàn)過表達(dá)組較對(duì)照組的E-cadherin和ZO-1表達(dá)水平升高，而N-cadherin、Slug和MMP-2表達(dá)水平降低；沉默組較對(duì)照組的E-cadherin和ZO-1表達(dá)水平降低，而N-cadherin、Slug和MMP-2表達(dá)水平升高（圖4），提示Sema3A通過下調(diào)EMT/MMP-2途徑從而抑制卵巢癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。

圖3 Sema3A抑制卵巢癌細(xì)胞侵襲和遷移Fig.3 Sema3A inhibits invasion and migration in ovarian cancer cells

圖4 Sema3A通過EMT/MMP-2途徑抑制卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移Fig.4 Sema3A inhibits metastasis through EMT/MMP-2 in ovarian cancer cells

3 討 論

Sema3A在包括不同類型的腫瘤中均處于低水平，被認(rèn)為是候選的抑癌基因。例如，在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）患者中，Sema3A的低表達(dá)與其短生存期相關(guān)，過表達(dá)Sema3A蛋白抑制細(xì)胞增殖和集落形成，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并伴有細(xì)胞周期蛋白的減少，此外，通過抑制NF-κB和Snail2從而抑制HNSCC的EMT［8］。在胃癌中，Sema3A的低表達(dá)與組織低分化、浸潤(rùn)深度、血行轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)，是一個(gè)獨(dú)立的生存不良的預(yù)后因素。此外，在胃癌的體外研究中，Sema3A過表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖和遷移［9］。在前列腺癌中，腫瘤細(xì)胞中Sema3A的表達(dá)與良好預(yù)后相關(guān)，如較低的病理分期和較低的術(shù)前PSA水平［10］。另一方面，前列腺癌細(xì)胞中Sema3A水平的減少也被發(fā)現(xiàn)是對(duì)激素治療抵抗的預(yù)測(cè)因子［11］。研究發(fā)現(xiàn)，在卵巢癌中，Sema3A的低表達(dá)與FIGO分期、分級(jí)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的存在顯著相關(guān)，與腫瘤的組織學(xué)類型或大小無(wú)關(guān)［7］。而該研究?jī)H對(duì)Sema3A與卵巢癌臨床病理學(xué)特征及預(yù)后進(jìn)行分析，并未對(duì)其是否影響EOC轉(zhuǎn)移以及分子機(jī)制進(jìn)行深一步研究。

本研究從臨床標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)，Sema3A可能參與EOC腹腔轉(zhuǎn)移，且與腫瘤的惡性程度有關(guān)，提示Sema3A可能是EOC轉(zhuǎn)移的抑制劑。為進(jìn)一步證明Sema3A抑制EOC的轉(zhuǎn)移能力，我們?cè)诩?xì)胞水平上研究過表達(dá)和沉默Sema3A基因?qū)β殉舶┘?xì)胞的侵襲和遷移行為能力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)Sema3A基因下調(diào)卵巢癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力，沉默Sema3A上調(diào)卵巢癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力，提示Sema3A參與卵巢癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

EMT是上皮細(xì)胞上皮樣特征減少，而間充質(zhì)特性增加的生理過程［12］。EMT被認(rèn)為是胚胎發(fā)育過程以及器官纖維化和癌癥轉(zhuǎn)移中的關(guān)鍵步驟。因此，EMT有助于腫瘤獲得侵襲性、異質(zhì)性和耐藥性［13］。EMT的一個(gè)關(guān)鍵特性是上皮中間絲蛋白和基因下調(diào)而波形蛋白（vimentin）和基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）上調(diào)［14］。此外，細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-基質(zhì)黏附分子如整聯(lián)蛋白、E-cadherin和N-cadherin也在EMT中發(fā)揮重要作用［15］。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在永生化卵巢上皮細(xì)胞中導(dǎo)入E-cadherin基因能誘導(dǎo)細(xì)胞黏附形成，調(diào)控細(xì)胞的形態(tài)和遷移活動(dòng)［16］。Quattrocchi等［17］發(fā)現(xiàn)，在高級(jí)別漿液性卵巢癌中，N-cadherin高表達(dá)與低生存率呈正相關(guān)。這些研究均說明卵巢癌患者E-cadherin的下調(diào)和N-cadherin的上調(diào)與轉(zhuǎn)移相關(guān)。MMP-2是MMP家族的重要成員，協(xié)同腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散轉(zhuǎn)移，與卵巢癌生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)，對(duì)EMT起重要調(diào)節(jié)作用。已在卵巢癌、乳腺癌和胃癌等多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞黏附破壞導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)降解并釋放MMP，介導(dǎo)蛋白酶水解E-cadherin從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移［13］。本研究結(jié)果顯示，Sema3A上調(diào)后，增加了E-cadherin和ZO-1的表達(dá)，而降低了N-cadherin、Slug和MMP-2的表達(dá)，Sema3A下調(diào)后，降低了E-cadherin和ZO-1的表達(dá)，而增加了N-cadherin、Slug和MMP-2的表達(dá)說明Sema3A介導(dǎo)卵巢癌的發(fā)病與轉(zhuǎn)移可能通過調(diào)控EMT/MMP-2途徑。

綜上所述，Sema3A可作為EOC早期診斷的腫瘤標(biāo)志物，其參與EOC的發(fā)病與進(jìn)展可能通過影響EMT/MMP-2的途徑。Sema3A對(duì)EOC的早期診斷、治療、評(píng)價(jià)可能具有重要價(jià)值，有望成為預(yù)測(cè)EOC轉(zhuǎn)移和預(yù)后的生物標(biāo)志物。