PI3K/AKT通路通過Nrf2途徑調(diào)控PD-L1在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)

福建醫(yī)科大學(xué)附屬廈門弘愛醫(yī)院腫瘤科，福建 廈門，361009

程序性死亡［蛋白］配體-1（programmed death ligand-1，PD-L1）是一種相對(duì)分子質(zhì)量為4×104的跨膜蛋白，由CD274基因編碼［1］。早期被發(fā)現(xiàn)在機(jī)體某些特殊時(shí)期增量表達(dá)，如妊娠、自身免疫性疾病及各種病毒感染等［2-3］。近年研究發(fā)現(xiàn)，PD-L1在多種腫瘤細(xì)胞中均呈高表達(dá)，參與對(duì)機(jī)體的免疫抑制［4-5］。PD-L1可以與免疫T細(xì)胞表面的程序性死亡［蛋白］-1（programmed death-1，PD-1）結(jié)合，致使T細(xì)胞失去免疫識(shí)別活性，無法殺傷腫瘤細(xì)胞［6-7］。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展一方面與其自身惡性程度有關(guān)，另一方面也決定于其對(duì)免疫系統(tǒng)的破壞能力［8-9］。因此，PD-L1的表達(dá)水平直接影響患者的預(yù)后，通過人工干預(yù)降低其在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)，也成為促進(jìn)免疫系統(tǒng)恢復(fù)、遏制腫瘤的潛在手段之一［3，10-11］。AKT又名蛋白激酶B（protein kinase B，PKB），其活性受磷脂肌酰醇-3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）調(diào)控，同時(shí)又調(diào)控著細(xì)胞多條信號(hào)通路，在細(xì)胞存活和凋亡中起重要作用。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，AKT在許多腫瘤細(xì)胞中處于較為活躍的狀態(tài)，其異?；钚猿Ｒ鸲鄺l信號(hào)通路的異常激活，并賦予腫瘤細(xì)胞異于正常細(xì)胞的能力，包括無限增殖、侵襲、抗逆性及抗免疫等［12-13］。

前期實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞在經(jīng)PI3K抑制劑wortmannin處理后，細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)與AKT去磷酸化出現(xiàn)同步下調(diào)，根據(jù)AKT在細(xì)胞通路中的作用關(guān)系網(wǎng)，我們推測(cè)這種下調(diào)可能是通過抑制某些轉(zhuǎn)錄因子的活性而實(shí)現(xiàn)的?；谝陨霞僭O(shè)，我們通過短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）技術(shù)同時(shí)構(gòu)建了一些A549細(xì)胞和H460細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子缺陷株，這些轉(zhuǎn)錄因子均被報(bào)道受AKT調(diào)控，如HeLa細(xì)胞系E-box結(jié)合蛋白（HeLa E-box binding protein，HEB）、螺旋環(huán)螺旋轉(zhuǎn)錄因子4（helixloop-helix transcription factor 4，HTF4）、NF-E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）及叉頭盒蛋白O3（forkhead box O3，F(xiàn)OXO3a）等，以明確AKT通過轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控PD-L1在腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

實(shí)驗(yàn)所用人非小細(xì)胞肺癌A549及H460細(xì)胞及pGL3-basic載體均由本實(shí)驗(yàn)室保存。細(xì)胞培養(yǎng)在含10%滅活胎牛血清的RPMI-1640（購自美國(guó)Gibco公司）培養(yǎng)基中，細(xì)胞共培養(yǎng)所有培養(yǎng)基Lonza X-VIVO? 15購自美國(guó)Lonza公司；人外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）購自美國(guó)ZenBio公司；用于基因沉默的shRNA（HEB、HTF4、Nrf2及FOXO3a）均購自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司。用于抑制PI3K活性的抑制劑wortmannin購自美國(guó)MedChemExpress公司。所用一抗為鼠抗，分別為抗Nrf2、抗pNrf2、抗PD-L1、抗AKT、抗pAKT（Ser473）購自美國(guó)Cell Signaling公司；二抗為兔抗鼠抗體，購自美國(guó)DAKO公司。用于流式細(xì)胞術(shù)分析的FITC標(biāo)記PD-L1由本實(shí)驗(yàn)室自行偶聯(lián)；蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）所用試劑購自美國(guó)Bio-Rad Laboratories公司。采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQPCR），使用的Quant One Step RTFQ-PCR kit檢測(cè)試劑盒及反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自天根生化科技（北京）有限公司；ROS探針檢測(cè)試劑盒購自美國(guó)AAT Bioquest公司，用于檢測(cè)PD-L1轉(zhuǎn)錄水平的RTFQ-PCR引物購自美國(guó)Thermofish公司；Dual-Luciferiase Reporter Assay System購自美國(guó)Promega公司；FuGENE［sup］?［/sup］6轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國(guó)Promega公司；SYBR green染料購自生工生物工程（上海）股份有限公司；Dynabeads?人CD3/CD28 T細(xì)胞激動(dòng)劑購自美國(guó)Life Technology公司。

報(bào)告基因及細(xì)胞ROS反應(yīng)檢測(cè)采用美國(guó)PE公司生產(chǎn)的EnVision多功能酶標(biāo)儀，RTFQ-PCR檢測(cè)儀器為美國(guó)ABI公司的Stepone plus型RTFQ-PCR儀，Western blot定量分析軟件為Image J 2.0。

1.2 轉(zhuǎn)錄因子敲除細(xì)胞株構(gòu)建

A549細(xì)胞和H460細(xì)胞分別以3×106個(gè)/mL接種于含10%滅活胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h后更換為不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2～3 h。取3 μL濃度為 0.1 μg/μL的FuGENE［sup］?［/sup］6加入到的97 μL無血清培養(yǎng)基輕輕混勻，于室溫下靜置5 min，加入2 μL 濃度為1 μg/μL的shRNA-plamid（用于HEB、HTF4、Nrf2及FOXO3a等轉(zhuǎn)錄因子敲除）到試管中，用移液器混勻，室溫放置20 min。用100 μL槍吸出轉(zhuǎn)染液，均勻的滴入含10%滅活胎牛血清RPMI-1640的培養(yǎng)皿中，于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6～8 h，待后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

1.3 PD-L1基因的luciferin雙報(bào)告基因體系構(gòu)建

據(jù)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI，National Center for Biotechnology Information）基因數(shù)據(jù)庫查驗(yàn)設(shè)計(jì)引物。順義鏈為5’-TCACCGAAGGTCAGAAAGTCCAACGC-3’，反義鏈為5’-GGAGCCTCGGGGAAGCTGCGCAGAACTG-3’。通過PCR擴(kuò)增方法獲得PD-L1基因啟動(dòng)子，并與pGL3-basic載體進(jìn)行連接后轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中擴(kuò)增，挑選菌落PCR為陽性克隆送測(cè)序。構(gòu)建成功后，表達(dá)載體與海腎熒光素酶基因以1000∶1的比例共轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞和H460細(xì)胞，同時(shí)以pGL3-basic空載體作為對(duì)照。轉(zhuǎn)染48 h后，使用Promega的Dual-luciferase報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒驗(yàn)證PD-L1啟動(dòng)子活性。

1.4 PD-L1的轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)

根據(jù)mRNA提取試劑盒說明，提取A549細(xì)胞總RNA，并使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA文庫。據(jù)NCBI基因數(shù)據(jù)庫查驗(yàn)，設(shè)計(jì)PCR引物。順義鏈為5’-TGTACCACGTCT CCCACATAACAG-3’，反義鏈為5’-ACCCCACGATG AGGAACAAA-3’。以β-actin為內(nèi)參，順義鏈為5’-TGCTGACAGGATGCAGAAGGA-3’；5’-CGCTCAGGAGGAGCAATGAT-3’。對(duì)RTFQPCR實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用2-△△Ct法進(jìn)行分析。

1.5 Western blot檢測(cè)

分別收集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞，加入事先預(yù)冷至4 ℃的洗板裂解液［（裂解液：50 mmol/L Tris，pH為7.4；150 mmol/L NaCl溶液；1%Triton X-100；1.0%脫氧膽酸鈉，0.1%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS），以及10 mmol/L 的PMSF，10 mmol/L氟化鈉］，10 mmol/L EDTA，0.1%的亮抑蛋白酶肽）5～10 min后收集于1.5 mL離心管中，冰浴超聲裂解細(xì)胞。將裂解液于4 ℃、11000×g離心10 min，取上清液測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，調(diào)整各組蛋白濃度一致后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）。將電泳后的SDS-PAGE膠經(jīng)過100 V電轉(zhuǎn)1 h至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，將膜置于5% BSA室溫封閉1 h，一抗（體積比1∶8000 稀釋）室溫溫育2 h，TBST洗滌3次，每次10 min。二抗（體積比1∶10000稀釋）室溫溫育1 h，用TBST洗滌。最后PVDF膜用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光劑（ECL）溶液浸潤(rùn)，顯影觀察。

1.6 PBMC細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)

將A549細(xì)胞與H460細(xì)胞及其對(duì)應(yīng)的人工構(gòu)建基因缺陷株以每孔6×103個(gè)腫瘤細(xì)胞的量接種，并培養(yǎng)于10%滅活胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)于CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、37 ℃的條件下。待細(xì)胞增殖16～18 h后，去掉細(xì)胞上清液，加入適量的Lonza X-VIVO? 15無血清細(xì)胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h后加入適量的PBMC細(xì)胞共培養(yǎng)2 h。按說明書要求加入適量的免疫因子刺激劑CD3和CD28單抗刺激劑，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)免疫細(xì)胞對(duì)A549細(xì)胞、H460細(xì)胞及其基因缺陷株的殺傷效應(yīng)。

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)方法：待檢測(cè)細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，在2000×g的離心力下離心分離3 min，使用預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞。加入FITC標(biāo)記Annexin-Ⅴ及PI，輕輕混勻，與4 ℃冰箱中避光溫育60 min。溫育完成后，在2000×g的離心力下離心分離3 min棄去上清液，加入一定量PBS洗滌并繼續(xù)離心，重復(fù)洗滌3遍后上機(jī)檢測(cè)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)處理運(yùn)用SPSS 20.0軟件，采用t檢驗(yàn)方法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用表示。方差齊性者采用方差分析法進(jìn)行分析，方差不齊者進(jìn)行秩變換后具備方差齊性，然后進(jìn)行方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。組間數(shù)據(jù)相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)系數(shù)，并在顯著性水平為0.05區(qū)間內(nèi)進(jìn)行雙尾檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 Insulin調(diào)節(jié)A549及H460細(xì)胞內(nèi)PD-L1的表達(dá)水平

首先檢測(cè)insulin的刺激對(duì)A549及H460親本細(xì)胞內(nèi)PD-L1的影響。結(jié)果顯示，細(xì)胞經(jīng)10 μg/mL的insulin刺激后，兩株細(xì)胞內(nèi)AKT的磷酸化水平出現(xiàn)顯著增加，伴隨著PD-L1基因的轉(zhuǎn)錄（圖1A、B）和表達(dá)水平（圖1C、D）較陰性對(duì)照組而言，也出現(xiàn)顯著的增強(qiáng)。接著，我們繼續(xù)檢測(cè)了在敲除特定轉(zhuǎn)錄因子的缺陷株中，insulin是否仍然能保持著對(duì)PD-L1表達(dá)的刺激效應(yīng)。結(jié)果如圖1A、圖1B顯示，相同劑量的insulin，對(duì)A549HEB-、H460HEB-、A549HTF4-、H460HTF4-、A549FOXO3a-及H460FOXO3a-細(xì)胞中PD-L1的轉(zhuǎn)錄水平影響顯著（P＜0.001），但在A549Nrf2-、H460Nrf2-兩株細(xì)胞株中PD-L1在刺激前后轉(zhuǎn)錄水平無明顯變化（P＞0.05）。另外，Nrf2敲除后與親本株比較，的A549Nrf2-、H460Nrf2-細(xì)胞株中PD-L1的表達(dá)水平的變化和轉(zhuǎn)錄水平變化完全一致（P＞0.05，圖1C、D）。

圖1 Insulin對(duì)A549、H460細(xì)胞親本株和轉(zhuǎn)錄因子缺陷株中PD-L1的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的調(diào)節(jié)作用Fig.1 Insulin regulated the transcription and expression of PD-L1 in A549 and H460 cell lines and their transcription factor-deficient strain

2.2 ROS反應(yīng)經(jīng)Nrf2調(diào)節(jié)PD-L1的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)

我們發(fā)現(xiàn)，AKT的激活可以顯著地提高PD-L1在A549細(xì)胞和H460細(xì)胞內(nèi)PD-L1蛋白的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平，且這種促進(jìn)作用與轉(zhuǎn)錄因子Nrf2有著重要的聯(lián)系。為進(jìn)一步驗(yàn)證Nrf2在PD-L1表達(dá)中的作用，我們使用ROS誘導(dǎo)法來破壞細(xì)胞中Keap與Nrf2的結(jié)合，促進(jìn)Nrf2入細(xì)胞核發(fā)揮作用。結(jié)果顯示，兩株細(xì)胞株對(duì)isoproterenol的刺激，均表明出了PD-L1增量表達(dá)的效應(yīng)，且呈濃度依賴性（圖2）。

Isoproterenol提高PD-L1表達(dá)的作用，可以被ROS清除劑NAC解除（圖3）。

圖2 Isoproterenol通過ROS途徑上調(diào)A549細(xì)胞及H460細(xì)胞內(nèi)PD-L1的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平Fig.2 Isoproterenol up-regulates the transcription and expression of PD-L1 via ROS pathway in A549 and H460 cell lines

圖3 NAC阻斷isoproterenol在A549細(xì)胞及H460細(xì)胞內(nèi)引起的PD-L1表達(dá)上調(diào)Fig.3 Up-regulation of PD-L1 transcription and expression in A549 and H460 cell lines could be blocked by NAC

2.3 PI3K/AKT抑制下調(diào)PD-L1表達(dá)水平

Insulin作為已知的PI3K/AKT通路激動(dòng)劑，能引起AKT在細(xì)胞內(nèi)的過度活化［14-15］。之前我們發(fā)現(xiàn)insulin的這種促進(jìn)活化AKT作用，可以顯著地提高PD-L1在A549和H460兩株細(xì)胞系中的表達(dá)。為進(jìn)一步驗(yàn)證這種促表達(dá)作用是否與AKT的過度磷酸化有關(guān)，我們接著使用PI3K的抑制劑wortmannin來調(diào)節(jié)AKT的磷酸化水平，并使用熒光素酶雙報(bào)告基因體系評(píng)估PD-L1的轉(zhuǎn)錄水平是否與AKT磷酸化水平改變有同步效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，wortmannin能逆轉(zhuǎn)insulin刺激引起的AKT磷酸化水平增加，磷酸化的AKT隨著抑制劑濃度的增加呈現(xiàn)梯度降低。與此同時(shí)，A549細(xì)胞株（圖4A）和H460細(xì)胞株（圖4B）內(nèi)PD-L1的轉(zhuǎn)錄水平也逐漸降低（P＜0.01），經(jīng)關(guān)聯(lián)性分析，AKT的磷酸化程度和PD-L1在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)量呈正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r分別為0.95和0.93，該數(shù)據(jù)表明AKT的激活程度能直接影響PD-L1蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平。

2.4 PI3K/AKT通路干預(yù)對(duì)Nrf2磷酸化水平的影響

Nrf2作為轉(zhuǎn)錄因子，其促進(jìn)靶蛋白的轉(zhuǎn)錄通常是從其入核并結(jié)合靶基因的啟動(dòng)子開始的［16-17］。前述研究中我們證明，ROS反應(yīng)可以提升PD-L1的表達(dá)量，同時(shí)AKT的過磷酸化也能增加PD-L1的表達(dá)，因此，我們推測(cè)AKT是通過磷酸化Nrf2促進(jìn)其發(fā)揮功能。為驗(yàn)證以上假設(shè)，我們通過Western blot繼續(xù)檢測(cè)Nrf2在細(xì)胞內(nèi)的磷酸化水平，并與AKT的磷酸化水平進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，A549、H460細(xì)胞株中的Nrf2磷酸化水平，在insulin和wortmannin的干預(yù)下，出現(xiàn)了先升后降的趨勢(shì)。首先隨著insulin濃度的增加，Nrf2磷酸化水平出現(xiàn)了明顯的增加，隨后在保持10 μg/mL的insulin體系下，加入0.01～1.00 μmol/L的wortmannin，Nrf2的磷酸化水平則依劑量濃度開始出現(xiàn)下降。同時(shí)，我們還同步監(jiān)測(cè)了AKT磷酸化水平的變化，并進(jìn)行了兩者的相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，在A549和H460細(xì)胞株中，兩者的磷酸化水平變化趨勢(shì)相關(guān)系數(shù)分別為0.86和0.93，為強(qiáng)正相關(guān)（圖5）。

2.5 Nrf2缺陷促進(jìn)PBMC殺傷A549及H460細(xì)胞

為進(jìn)一步觀察Nrf2轉(zhuǎn)錄因子在腫瘤抵抗免疫系統(tǒng)中的作用，我們將構(gòu)建好的Nrf2缺陷細(xì)胞株A549Nrf2-、H460Nrf2-細(xì)胞株與PBMC進(jìn)行共培養(yǎng)，以其親本細(xì)胞A549和H460細(xì)胞為陰性對(duì)照，檢測(cè)共培養(yǎng)后PBMC細(xì)胞對(duì)兩種野生型親本細(xì)胞株和缺陷型細(xì)胞株的殺傷作用。結(jié)果顯示，在加入免疫刺激因子CD3和CD28單抗刺激劑后，A549和H460細(xì)胞與PBMC細(xì)胞培養(yǎng)后，腫瘤細(xì)胞凋亡數(shù)量有所增加，A549細(xì)胞系的凋亡比例從原來的6.3%±0.8%提升為8.9%±0.6%（P＜0.05，圖6A），H460細(xì)胞系的凋亡比例從原來的9.5%±0.7%提升為13.5%±1.2%（P＜0.05，圖6B）；而另一組缺陷株中，A549Nrf2-、H460Nrf2-細(xì)胞株對(duì)CD3和CD28的刺激就表明得非常顯著，A549細(xì)胞系的凋亡比例從原來的10.5%±1.1%提升為32.5%±1.5%（P＜0.001），H460細(xì)胞系的凋亡比例從原來的15.3%±0.7%提升為41.2%±1.2%（P＜0.001）。該結(jié)果表明，Nrf2在腫瘤細(xì)胞抵抗免疫殺傷中有著重要的作用。

圖4 Wortmannin能通過抑制AKT的磷酸化水平而降低A549細(xì)胞及H460細(xì)胞內(nèi)PD-L1的轉(zhuǎn)錄水平Fig.4 Wortmannin down-regulates the transcription of PD-L1 via inhibiting phosphorylation level of AKT in A549 and H460 cell lines

圖5 Insulin與Wortmannin對(duì)A549細(xì)胞及H460細(xì)胞內(nèi)Nrf2磷酸化水平的正負(fù)調(diào)控Fig.5 Positive and negative feedback regulation phenomenon which caused by insulin and wortmannin in A549 and H460 cell lines

圖6 轉(zhuǎn)錄因子Nrf2具有協(xié)助A549細(xì)胞及H460細(xì)胞系逃逸免疫細(xì)胞PBMC殺傷的作用Fig.6 Transcription factor Nrf2 was able to assist the tumor cells A549 and H460 in escape from by immune cell PBMC

3 討 論

PD-L1/PD-1通路是免疫系統(tǒng)的一個(gè)關(guān)鍵檢查節(jié)點(diǎn)，它調(diào)控著免疫系統(tǒng)對(duì)自身組織的識(shí)別，同時(shí)也成為被腫瘤細(xì)胞所利用的逃逸通路之一［18］。PD-L1/PD-1免疫檢查點(diǎn)阻斷為癌癥的免疫治療開啟了新的革命式的發(fā)現(xiàn)，大量臨床報(bào)道完全肯定了阻斷該通路在腫瘤臨床治療的可行性［19-20］。PD-L1高表達(dá)是大多數(shù)實(shí)體瘤的重要特征［21］，本文實(shí)驗(yàn)研究中也證實(shí)A549細(xì)胞和H460細(xì)胞中存在廣泛的PD-L1表達(dá)現(xiàn)象?，F(xiàn)今治療方案主要是通過抗原抗體反應(yīng)法，選擇性地阻斷PD-L1與PD1的接觸，重啟免疫系統(tǒng)，本研究擬從源頭上阻斷PD-L1的表達(dá)，減少腫瘤對(duì)免疫系統(tǒng)的抑制，以期為臨床的靶向治療與免疫治療聯(lián)用提供新的思路和理論基礎(chǔ)。

本研究中發(fā)現(xiàn)，PD-L1的表達(dá)與一種同樣活躍于各種實(shí)體瘤的蛋白AKT的活化程度有著重要的聯(lián)系。PD-L1能受AKT的激活劑insulin影響，即insulin可以在促使AKT磷酸化的同時(shí)顯著地提高PD-L1在腫瘤細(xì)胞的表達(dá)；而另一方面，這種促進(jìn)作用可以為PI3K基因的抑制劑wortmannin所逆轉(zhuǎn)。眾所周知，PI3K基因是激活關(guān)鍵且為核心的環(huán)節(jié)之一，它的抑制能直接導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)AKT的失活，進(jìn)而促使凋亡。實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，PD-L1基因的轉(zhuǎn)錄水平，也嚴(yán)格的受wortmannin調(diào)控，其下降水平與AKT去磷酸化同步發(fā)生，二者相關(guān)性分析提示，AKT的磷酸化水平與PD-L1的轉(zhuǎn)錄水平有重要的聯(lián)系。這種轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控又是如何實(shí)現(xiàn)的？進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，一種名為Nrf2的轉(zhuǎn)錄因子，在此通路中發(fā)揮著重要的作用。我們分別研究了Nrf2缺陷株對(duì)AKT調(diào)控的敏感性以及ROS反應(yīng)觸發(fā)Nrf2活性，發(fā)現(xiàn)Nrf的確是PD-L1正常表達(dá)的關(guān)鍵蛋白。與此同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)，AKT對(duì)Nrf2的調(diào)控與Nrf2的磷酸化有著緊密的聯(lián)系，即AKT的激活與抑制，能同步影響Nrf2的磷酸化程度，這可能也是Nrf2啟動(dòng)PD-L1轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵因素之一。實(shí)驗(yàn)的最后，我們還檢測(cè)了免疫細(xì)胞對(duì)Nrf2缺陷株的殺傷作用，并與其親本株的反應(yīng)作了比對(duì)。結(jié)果如同預(yù)期那樣，敲除Nrf2的A549細(xì)胞系和H460細(xì)胞系對(duì)免疫細(xì)胞的敏感性顯著性提高，在免疫因子刺激后，出現(xiàn)了大量的凋亡。

本研究發(fā)現(xiàn)AKT通路可能是通過Nrf2轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控PD-L1蛋白在腫瘤細(xì)胞的表達(dá)，但還有部分情況仍未探明——AKT是否直接作用于Nrf2導(dǎo)致其磷酸化，這也是我們下一步研究要深入探究的課題?；谝种芇I3K/AKT通路以輔助PD-1/PD-L1免疫治療，在非小細(xì)胞肺癌中也許具有良好的應(yīng)用前景。