抑制PDK1經(jīng)由ASK1/JNK/Bim通路誘導(dǎo)慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞凋亡

王 方，王 昕，劉 哲，惠凌云，馮 艾，李 娜，王亞文,

1.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西 西安 710061；

2.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院生物樣本資源中心，陜西 西安 710061

慢性粒細(xì)胞白血?。╟hronic myelogenous leukemia，CML）是起源于造血干細(xì)胞的惡性增殖性疾?。?］。95%的患者骨髓細(xì)胞攜帶t (9,22)染色體易位。該突變形成的BCR/ABL融合基因編碼并表達(dá)BCR/ABL融合蛋白。作為非受體型酪氨酸激酶，BCR/ABL融合蛋白在細(xì)胞質(zhì)中能夠自身磷酸化活化并激活下游STAT5、PI3K及Ras等信號(hào)通路，影響細(xì)胞的正常生物學(xué)行為［2-4］。以伊馬替尼（imatinib）為代表的特異性酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI）能夠靶向抑制BCR/ABL基因的磷酸化活化，并為CML的治療帶來(lái)了革命性突破［5］。然而也有諸多局限，首先，急變期CML易獲得二次突變，TKI對(duì)于該期患者療效欠佳［6］；其次，即使獲得緩解的患者也存在復(fù)發(fā)的可能，而TKI并不能很好地控制復(fù)發(fā)病情；再次，近年來(lái)大量研究證實(shí)，CML腫瘤干細(xì)胞的存活并不依賴(lài)于BCR/ABL，即使被TKI完全阻斷，腫瘤干細(xì)胞也不能有效地被誘導(dǎo)凋亡［7］。因此，尋找替代治療靶點(diǎn)是治愈CML亟待解決的問(wèn)題。本研究通過(guò)分析CML患者及健康體檢者標(biāo)本發(fā)現(xiàn)，3-磷酸肌醇依賴(lài)性蛋白激酶1（3-phosphoinositide-dependent kinase-1，PDK1）在CML細(xì)胞中表達(dá)升高。抑制其活性對(duì)腫瘤細(xì)胞具有明顯的抗增殖和促凋亡的效應(yīng)，同時(shí)也能夠增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)imatinib的敏感性。因此作為潛在的治療靶點(diǎn)，PDK1值得后續(xù)深入研究。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

PDK1小分子抑制劑GSK2334470購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司，imatinib購(gòu)自美國(guó)Selleck公司，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）及Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡試劑盒購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司，外周血單個(gè)核細(xì)胞分離試劑盒購(gòu)自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司，RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)HyClone公司，胎牛血清購(gòu)自以色列BI公司，PDK1、磷酸化PDK1、凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1（apoptosis signalregulating kinase 1，ASK1）、磷酸化ASK1、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、磷酸化JNK、caspase-3及多聚ADP核糖聚合酶［poly （ADP-ribose）polymerase，PARP］單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司，蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）、磷酸化AKT、糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）、磷酸化GSK-3β、β-catenin、磷酸化β-catenin、Bcl-2相互作用細(xì)胞凋亡介導(dǎo)因子（Bcl-2 interacting mediator of cell death，Bim）、磷酸化Bim及c-Myc抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，GAPDH抗體購(gòu)自杭州賢至生物科技有限公司，HRP標(biāo)記的羊抗鼠、羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

K562和KU812細(xì)胞購(gòu)自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 克隆形成實(shí)驗(yàn)

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用終濃度為5 μmol/L的GSK2334470處理，12 h后按約500個(gè)細(xì)胞/孔的密度加入含0.9%甲基纖維素的24孔板中培養(yǎng)，平行3次，1周后在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)克隆細(xì)胞數(shù)。

1.4 CCK-8檢測(cè)

按5000個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于96孔板中，總體積200 μL，處理組為5 μmol/L的GSK2334470，對(duì)照組為相應(yīng)濃度的二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶劑（＜0.1%）。每組設(shè)置4個(gè)平行對(duì)照孔。分別于培養(yǎng)24、48、72 h后加入20 μL CCK-8溶液。37 ℃培養(yǎng)30 min后檢測(cè)450 nm處的吸光度（D）值，并比較組間差異。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測(cè)

細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)處理48 h后收集，臨床標(biāo)本中外周血單個(gè)核細(xì)胞分離采用密度梯度離心法（依照試劑說(shuō)明書(shū)），最終收集的細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷PBS洗滌3次。加入含1%苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）的RIPA裂解液 (106個(gè)細(xì)胞/100 μL)，冰上裂解30 min；4 ℃，13000 rpm離心15 min，吸取上清液。通過(guò)B C A 法檢測(cè)蛋白濃度，加入相應(yīng)體積的上樣緩沖液，沸水浴中煮5 min，分裝，-80 ℃保存?zhèn)溆?。采用變性十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）分離蛋白質(zhì)，濃縮膠和分離膠聚丙烯酰胺濃度分別為6%和10%～12%，每組上樣20～50 μg。120 V恒壓電泳2 h。橫流濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，40 mA轉(zhuǎn)6～8 h，于5%牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）中室溫封閉1 h。4 ℃溫育一抗過(guò)夜，二抗室溫溫育1～2 h，化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)信號(hào)。

1.6 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

細(xì)胞處理同Western blot，收集細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗3次，用結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，濃度約為106/mL，取100 μL細(xì)胞懸液，加入Annexin-Ⅴ/PI各5 μL室溫避光染色30 min，上機(jī)檢測(cè)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次以上，應(yīng)用SPSS 20.0軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，資料以x±s表示。采用LSD-t法檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PDK1在CML標(biāo)本中表達(dá)升高

檢測(cè)8例初發(fā)CML患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中PDK1蛋白水平，并與同期健康體檢者相比較，PDK1在CML患者中表達(dá)明顯升高（P＜0.05，圖1）。

圖1 Western blot法檢測(cè)8例CML患者及8例健康體檢者外周血中單個(gè)核細(xì)胞PDK1表達(dá)豐度Fig.1 PDK1 abundance was detected by Western blot in peripheral blood mononuclear cells from 8 newly diagnosed CML patients and 8heathy donors

2.2 抑制PDK1影響細(xì)胞增殖

在K562和KU812兩株CML細(xì)胞中，PDK1小分子抑制劑GSK2334470能夠明顯抑制細(xì)胞增殖?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)顯示，相比對(duì)照組，抑制劑組細(xì)胞克隆數(shù)目明顯降低（K562：P＜0.01；KU812：P＜0.05），且形態(tài)較對(duì)照組小，細(xì)胞較為分散（圖2A）。另外，CCK-8檢測(cè)結(jié)果也顯示，在處理后72 h，抑制劑組細(xì)胞活力明顯低于對(duì)照組（K562：P＜0.01；KU812：P＜0.001，圖2B）。

圖2 克隆形成實(shí)驗(yàn)（A）和CCK-8（B）檢測(cè)GSK2334470對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用Fig.2 Inhibition of cell growth by GSK2334470 was detected by clone formation assay (A) and CCK-8 assay (B)

2.3 抑制PDK1促進(jìn)細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，處理組細(xì)胞凋亡率明顯提高，K 562 細(xì)胞中，凋亡率為19.2%±4.38%（P＜0.01），而KU812細(xì)胞則更為敏感，凋亡率為35.7%±6.33%（P＜0.01，圖3A）。隨后檢測(cè)了凋亡信號(hào)通路中執(zhí)行分子caspase-3及底物PARP的活化片段，結(jié)果顯示，GSK2334470能夠明顯誘導(dǎo)兩者活化（圖3B）。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)GSK2334470對(duì)細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用（A）；Western blot檢測(cè)caspase-3及底物PARP的活化（B）Fig.3 Induction of apoptosis by GSK2334470 was detected by flow cytometry (A),and activation of caspase-3 and PARP were detected by Western blot (B)

2.4 抑制PDK1導(dǎo)致AKT活化降低

GSK2334470不能降低總PDK1表達(dá)水平，而是抑制其磷酸化，在K562細(xì)胞中，處理組PDK1磷酸化約降至對(duì)照組的39.4%（P＜0.05）；在KU812細(xì)胞中則更為明顯，不足對(duì)照組的22.6%（P＜0.01，圖4A）。PDK1能夠調(diào)節(jié)AKT磷酸化，因此，PDK1抑制后AKT磷酸化水平在兩株細(xì)胞中也明顯降低，在K562和KU812細(xì)胞中，分別降至對(duì)照組的31.4%（P＜0.01）和42.6%（P＜0.05）。AKT參與了多個(gè)下游分子的磷酸化調(diào)節(jié)，其中ASK1和GSK-3β的磷酸化水平均有明顯下調(diào)。磷酸化ASK1含量在兩株細(xì)胞中分別下降了約73.4%和86.9%（P＜0.001），GSK-3β則分別下降了66.1%（P＜0.01）和78%（P＜0.001）。而作為GSK-3β下游的主要效應(yīng)分子，總β-catenin及磷酸化β-catenin均沒(méi)有明顯變化，c-Myc作為GSK-3β/β-catenin通路的靶基因，其表達(dá)也未見(jiàn)明顯變化（圖4B）。

圖4 Western blot檢測(cè)GSK2334470處理后磷酸化及總PDK1變化（A）；Western blot檢測(cè)GSK2334470處理后ASK1磷酸化水平及AKTGSK-3β-β-catenin通路活化（B）Fig.4 Reduction in p-PKD1 and total PDK1 level was detected by Western blot (A),and activation of AKT-GSK-3β-β-catenin pathway was determined by Western blot (B)

2.5 ASK1/JNK/Bim介導(dǎo)細(xì)胞凋亡

磷酸化ASK1（Ser83）水平降低可促進(jìn)其活性，因此檢測(cè)ASK1下游JNK的磷酸化水平。兩株細(xì)胞中磷酸化JNK在抑制劑處理后均有明顯上調(diào)（K562：P＜0.01，KU812：P＜0.05），同時(shí)，作為JNK下游的Bcl-2家族促凋亡分子，Bim的磷酸化水平亦明顯增加（K562：P＜0.001，KU812：P＜0.05）。另外，在K562細(xì)胞中，總Bim水平也明顯上升（P＜0.05），而在KU812中則不明顯（圖5）。

圖5 Western blot檢測(cè)GSK2334470刺激后磷酸化JNK、磷酸化Bim及總Bim水平Fig.5 Increase in phosphorylated JNK,phosphorylated Bim and total Bim under GSK2334470 stimuli was detected by Western blot

2.6 抑制PDK1增加imatinib敏感性

Imatinib單獨(dú)作用對(duì)兩株細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)率為20%～30%（K562為20.0%±3.95%），而與GSK2334470聯(lián)合作用時(shí)，凋亡率均提高了1倍以上：K562細(xì)胞凋亡率為52.3%±6.77%（P＜0.01）；KU 812 為67.03%±8.94%（P＜0.01）。GSK2334470能夠顯著提高細(xì)胞對(duì)imatinib的敏感性（圖6）。

圖6 GSK2334470提高細(xì)胞對(duì)imatinib的敏感性Fig.6 GSK2334470 promotes the sensitivity of cells to imatinib

3 討 論

作為絲/蘇氨酸蛋白激酶，PDK1是PI3K/AKT信號(hào)通路活化的重要激酶，可磷酸化激活A(yù)KT的Thr308位點(diǎn)［8］。后者活化后調(diào)節(jié)其下游多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與惡性腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲等多種生物學(xué)行為。研究顯示，PDK1在乳腺癌、結(jié)腸癌、急性白血病等多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，而抑制PDK1可有效地抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲［9-10］。因此，PDK1已經(jīng)成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。

本研究證實(shí)，PKD1在CML外周血單個(gè)核細(xì)胞中高表達(dá)。隨后在兩株CML細(xì)胞株中觀察到，抑制PDK1具有明顯的抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用。抑制PDK1誘導(dǎo)的凋亡依賴(lài)于caspase通路。為進(jìn)一步探討抑制PDK1誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，對(duì)AKT及ASK1信號(hào)兩條通路進(jìn)行活性分析。結(jié)果顯示，PDK1失活后AKT及下游GSK-3β磷酸化水平明顯降低，而作為GSK-3β下游的β-catenin的磷酸化水平卻未見(jiàn)明顯變化。同時(shí)作為AKT-GSK-3β通路的靶基因，c-Myc表達(dá)也未受影響。因此，推測(cè)有其他通路負(fù)責(zé)抑制PDK1引起的細(xì)胞凋亡行為。抑制PDK1后，ASK1磷酸化水平明顯下調(diào)，提示其活性增加，這也被其下游JNK磷酸化水平上調(diào)所進(jìn)一步證實(shí)。JNK可通過(guò)磷酸化激活Bim誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［11］。本研究結(jié)果顯示，總Bim和磷酸化Bim水平均明顯上調(diào)，故推測(cè)ASK1-JNK-Bim是負(fù)責(zé)細(xì)胞凋亡的主要效應(yīng)分子。最后也證實(shí)抑制PDK1能夠明顯提高兩株CML細(xì)胞對(duì)imatinib的敏感性，推測(cè)其可能具有逆轉(zhuǎn)imatinib耐藥的作用，然而因?yàn)槿狈δ退幍募?xì)胞，未能更進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，PDK1在CML細(xì)胞中的高表達(dá)參與了細(xì)胞逃避凋亡的生物學(xué)行為，有望成為CML治療及克服耐藥的新靶點(diǎn)。