急性T淋巴細(xì)胞白血病IL-7R突變的研究

張 慧，朱紅勝，劉文亞

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院 蘇州市立醫(yī)院 檢驗(yàn)科，江蘇 蘇州 215002)

急性T淋巴細(xì)胞白血病(T-cell acute lymphoblastic leukemia, T-ALL)是胸腺細(xì)胞多個(gè)基因異常的惡性侵襲性腫瘤， 兒童和成人新診斷為T-ALL病例分別占15%和25%。在T-ALL中目前比較明確的突變基因主要是IL-7R、WT1、FBXW7、NOTCH11和PHF6[1-5]。IL-7在T淋巴細(xì)胞的正常發(fā)育和功能維持中有著非常重要的作用，主要通過(guò)與IL-7R結(jié)合發(fā)揮其生物學(xué)功能[6]。除了IL-7，其他的細(xì)胞因子胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素(thymic stromal lymphopoietin，TSLP)也可結(jié)合IL-7R而組成TSLP受體的另一條鏈TSLPR。IL-7R和CRLF2信號(hào)在早期T淋巴細(xì)胞發(fā)育成熟過(guò)程中有著非常重要的作用[7]；IL-7通過(guò)啟動(dòng)JAK/STAT5和PI3K/AKT/mTOR信號(hào)途徑活化促進(jìn)T細(xì)胞的生存和細(xì)胞周期進(jìn)展[8]。有研究發(fā)現(xiàn)在T-ALL患者中可以檢測(cè)到IL-7R的突變[6]，為進(jìn)一步研究T-ALL患者中IL-7R的突變情況，本研究對(duì)125例ALL患者進(jìn)行第二代測(cè)序，探討ALL中IL-7R 突變特征。

1 資料與方法

1.1病例選擇 收集2008年6月至2018年10月蘇大附一院和蘇州市立醫(yī)院共125例T-ALL骨髓標(biāo)本庫(kù)患者，提取其基因組DNA，研究對(duì)象均經(jīng)遺傳學(xué)、細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫表型、和分子生物學(xué)確診，其中男102例，女23例；男：女比4.43:1，年齡范圍7～32歲，中位年齡23歲。125例患者中，49例患者未在我院行誘導(dǎo)化療，治療情況不詳。其余分別給予VDCP(長(zhǎng)春新堿類+蒽環(huán)類+環(huán)磷酰胺+糖皮質(zhì)激素+酪氨酸激酶抑制劑)和VDCLP方案(長(zhǎng)春新堿類+蒽環(huán)類+環(huán)磷酰胺+門冬酰胺酶+糖皮質(zhì)激素)。

1.2儀器與試劑 DNA提取試劑盒、測(cè)序反應(yīng)通用試劑盒、水平離心機(jī)(LDZ-5)、光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)、PCR儀(ABI2720)(美國(guó)ABI公司)、PCR擴(kuò)增引物。

1.3方法 按照DNA提取試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。按照儀器和試劑盒說(shuō)明書對(duì)IL-7R基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增；擴(kuò)增產(chǎn)物送公司測(cè)序，基因突變陽(yáng)性樣本進(jìn)一步進(jìn)行TA克隆。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)數(shù)資料以百分比或率表示，采用χ2檢驗(yàn)(或Fisher精確概率檢驗(yàn))；非正態(tài)分布計(jì)量資料以中位數(shù)(四份位數(shù))表示，采用非參數(shù)Mann-Whitney檢驗(yàn)；以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)和預(yù)后 兩組WBC、Hb、Plt、LDH 、原始細(xì)胞、復(fù)發(fā)率及病死率等指標(biāo)在兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1 兩組實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)和預(yù)后比較

2.2125例T-ALL脾臟、肝臟和淋巴結(jié)浸潤(rùn)的比例 在125例T-ALL患者中有脾臟浸潤(rùn)者57.6%(72/125)，有肝臟浸潤(rùn)者29.6%(37/125)，有淋巴結(jié)浸潤(rùn)者56.0%(7/125)。

2.3IL-7R突變信息 IL-7R突變位于IL-7R跨膜區(qū)的P240-S246序列；突變的類型為開放閱讀框的插入和缺失，7例突變類型分別為：c.727-730 InsAGCCACTGCCAGG DelCTAA, c.724-736 InsCCTACGGGAT DelTTACTAACCATCA, c.732 InsGGGCCCAATATTGTGACGT DelC， c.724-736InsCCTACGGGAT DelTTACTAACCATCA，c.732 InsCTAAGGTGC，c.731-732 InsGGTTGTCAGAG DelAC， c.720-736 InsAAAACGGT DelTATCTTACTAACCATCA。見表2和圖1。

表2 T-ALL中IL-7R突變插入缺失的具體堿基序列及其他基因突變情況

3 討 論

IL-7R在T淋巴細(xì)胞的發(fā)育、成熟、細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的維持等方面有著重要的作用[9]。本研究125例T-ALL患者中IL-7R基因突變率為5.6%(7/125)，Shochat等[7]研究中IL-7R在ALL中的突變率為10.5%，Zenatti等[10]報(bào)道IL-7R基因突變率為9%，本研究IL-7R基因突變率稍低于后兩者的報(bào)道。本研究中7例IL-7R基因突變者同時(shí)伴有Notch1基因突變的有2例，伴有PFH6突變的有1例，伴有WT1突變的有1例。7例IL-7R基因突變的類型是開放閱讀框的插入和缺失，突變的位置位于IL-7R跨膜區(qū)的P240-S246序列，與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[10]。

圖1 IL-7R突變插入缺失的具體堿基序列圖 方框內(nèi)為插入的序列(所有插入-缺失突變均為雜合，只有等位基因分離后才顯示突變的等位基因)。WT：野生型；Ins：插入；Del：刪除

本組IL-7R突變分別是c.727-730 InsAGCCACTGCCAGG DelCTAA, c.724-736 InsCCTACGGGAT DelTTACTAACCATCA, c.732 InsGGGCCCAATATTGTGACGT DelC， c.724-736InsCCTACGGGAT DelTTACTAACCATCA，c.732 InsCTAAGGTGC，c.731-732 InsGGTTGTCAGAG DelAC， c.720-736 InsAAAACGGT DelTATCTTACTAACCATCA。本研究顯示，兩組病死率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由于突變患者比較少，需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究該基因突變對(duì)預(yù)后的影響。研究顯示，IL-7R突變產(chǎn)生一個(gè)半胱氨酸，使相鄰的鏈產(chǎn)生同源二聚化，導(dǎo)致二硫鍵的形成，使受體發(fā)生構(gòu)像改變，導(dǎo)致信號(hào)通路持續(xù)活化而參與腫瘤形成機(jī)制[11]。另外，有研究報(bào)道IL-7R的5號(hào)外顯子也可以發(fā)生基因突變[12]。這就要求我們擴(kuò)大T-ALL患者的樣本量、增加T-ALL病人的信息作進(jìn)一步的研究。

生物學(xué)和功能分析表明這些突變的IL-7R基因可激活造血祖淋巴細(xì)胞獨(dú)立生長(zhǎng)的細(xì)胞因子[7]。有研究指出IL-7R和CRLF2的突變表明額外增加在近膜處的半胱氨酸是白血病Ⅰ型細(xì)胞因子受體基因突變激活的機(jī)制[7]。針對(duì)T-ALL的靶向治療方案仍缺乏特異性以及不良反應(yīng)大等問(wèn)題，這些問(wèn)題有待于進(jìn)行更深入性的探究和解決。強(qiáng)化化療方案的應(yīng)用使兒童T-ALL患者預(yù)后顯著提高，但成人及復(fù)發(fā)耐藥T-ALL患者的預(yù)后仍較差。研制新型靶向藥物特異性阻斷T-ALL細(xì)胞內(nèi)生存及耐藥相關(guān)的異常激活信號(hào)通路近年來(lái)被認(rèn)為是治療成人及復(fù)發(fā)難治T-ALL患者的新策略[13-16]。近年來(lái)，雖然對(duì)IL-7R突變?cè)赥-ALL中具體機(jī)制仍不清楚，但對(duì)IL-7R基因在T-ALL中的認(rèn)識(shí)不斷增加。綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)的若干突變位點(diǎn)和類型值得進(jìn)行深入的功能和機(jī)制研究，需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究該基因突變?cè)赥-ALL患者中的影響。