晉南驢mtDNA D-loop 區(qū)部分序列系統(tǒng)進(jìn)化分析與體型測定

李慧鋒 ，趙婧微 ，陳員玉 ，程俐芬 ，曹寧賢 ，解建平 ，靳魯柱 ，李武峰

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院，山西太谷030801；2.山西省畜禽繁育工作站，山西太原030001；3.臨汾市畜禽繁育改良工作站，山西太原041000；4.曲沃縣晉合泰農(nóng)副產(chǎn)品有限公司，山西曲沃043400）

我國是世界上驢的馴化和養(yǎng)殖最早的國家之一，我國的驢按體格大小可以分3 類：大型驢、中型驢、小型驢，大型驢分布在古代農(nóng)業(yè)較為發(fā)達(dá)、飼料條件好的中部平原和丘陵地區(qū)，主要包括關(guān)中驢、慶陽驢、德州驢、晉南驢等。晉南驢是山西地方品種，主產(chǎn)于山西南部的運城市和臨汾市南部的黃土高原地形區(qū)，具有體格高大、體型優(yōu)美、頭部清秀等特點，是我國優(yōu)良的大型驢種之一［1］。近20 年來，由于社會經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，農(nóng)業(yè)和運輸業(yè)的迅速興起，中國晉南驢種質(zhì)資源數(shù)量已經(jīng)大為減少，驢群數(shù)量大幅下降。

線粒體 DNA（ Mitochondrial DNA，mtDNA）是核外遺傳物質(zhì)，其具有穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，在世代傳遞的過程中不發(fā)生重組，且具有單性母性遺傳方式［2］。因此，馴化了的家畜一般能保持其祖先mtDNA 類型。作為一種遺傳標(biāo)記，線粒體DNA對于研究家畜的起源進(jìn)化研究、畜群遺傳結(jié)構(gòu)分析等方面都具有重要的意義。線粒體DNA 控制區(qū)（又稱D-環(huán)區(qū)，displacement loop region）也叫控制區(qū)，是線粒體DNA 中的一段富含A、T 堿基的非編碼區(qū)，屬于遺傳高變區(qū)，進(jìn)化速度快，多態(tài)性豐富，已成為動物mtDNA 的研究熱點之一。

驢的mtDNA 基因組為16 670bp，其中D-loop區(qū)的全序列為1 207bp［3］。近年來，國內(nèi)外開展了一些驢的 mtDNA 研究［4，5］，這些研究主要討論了不同驢種的進(jìn)化關(guān)系等問題。晉南驢mtDNA D-loop 多態(tài)性進(jìn)行深入分析的報道較少，且多年來沒有對晉南驢這一重要的地方品種開展成規(guī)模的體型測定工作。因此本文以晉南驢為研究對象，利用PCR 測序技術(shù)檢測mtDNA D-loop 部分序列多態(tài)性，分析了晉南驢種的親緣關(guān)系，并就晉南驢的體型測定結(jié)果進(jìn)行了分析，為進(jìn)一步開展晉南驢這一地方品種的保護(hù)工作提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本

試驗所用晉南驢血樣共99 個，均采自山西省曲沃縣晉合泰農(nóng)副產(chǎn)品有限公司。該公司用于本研究的驢均有購買記錄，來源于曲沃、夏縣、聞喜、侯馬、翼城、襄汾、臨汾、新絳等地。每頭驢頸部采集血液 5 mL，用肝素鈉作為抗凝劑，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 PCR 引物

PCR 所用引物根據(jù) Xu 等［3］已經(jīng)發(fā)表的歐洲驢線粒體DNA 全序列進(jìn)行設(shè)計，設(shè)計出兩條引物A（序列2-322）和B（序列483-671）。

引物 A（序列 2-322）的正鏈引物為 5’-GGATTGGGACACGTAATTGG-3’，反鏈引物為 5’-TTTCCTCCCCTAAACGACAG-3’。引物 B 的正鏈引物為 5’-TGTGGGTGTGCATGTTCTTT-3’，反 鏈 引 物 為 5’-CTGTGGTTTCATGCATTTGG-3’，均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.1.3 主要試劑

肝素、生理鹽水、鹽酸、氫氧化鈉、三羥基氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）、十二烷基磺酸鈉（SDS）、瓊脂糖（Agarose）、Tris 飽和酚（堿性pH 7.8～8.0）、氯仿、異戊醇、無水乙醇，蛋白酶K，均購于北京索萊寶科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA 提取

按照QIAquick? PCR 純化試劑盒的使用方法，從99 個晉南驢血樣中提取基因組DNA。使用Nanodrop 確定提出的DNA 濃度和純度，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR 擴(kuò)增、產(chǎn)物的檢測及測序

反應(yīng)體系為20 μL，其中2×Taq PCR Master-Mix 10 μL，上游下游引物各 0.8 μL，樣品 2.0 μL及 PCR 水 6.4 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 預(yù)變性 2 min，35 個 循 環(huán) 程 序 為 ：94 ℃ 變 性 30 s，54.2 ℃ ～56.2 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，循環(huán)結(jié)束后 72 ℃延伸2 min。

用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的線粒體DNA。DNA 產(chǎn)物由上海生工生物工程有限公司代理測序，ABI 3730 PRISM DNA 測序儀產(chǎn)生ABI 文件。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析方法

測序結(jié)果由Chromas 獲得原始數(shù)據(jù)，產(chǎn)生清晰的序列圖譜。用ClustalX 軟件對測序結(jié)果進(jìn)行同源序列比對，Dnasp4.10 用于遺傳多樣性分析。統(tǒng)計多態(tài)位點數(shù)、單倍型數(shù)、單倍型多樣度、核苷酸多樣度和平均核苷酸差異，用MEGA3.1 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

單倍型多樣度H 是指樣本中隨機抽取到的2個不同單倍型頻率。單倍型多樣度值（Haplotype diversity，Hd）和核苷酸多樣度（Nucleotide diversity）的值（Pi）表示了群體mtDNA 變異程度。這2個值越大，群體的多態(tài)程度越高，遺傳多樣性越豐富［6］。

分別測量公驢和母驢的身高、體斜長、尻斜長、胸圍和管圍，并用SPSS（19.0）統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物

用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖1 所示，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物條帶單一、清晰，電泳片段大小與預(yù)期估計的片段大小相符，且符合測序要求。

圖1 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測的結(jié)果Fig.1 PCR amplification products were detected by 1%agarose gel electrophoresis

2.2 測序圖譜

DNA 產(chǎn)物由上海生工生物工程有限公司代理測序，ABI 3730 PRISM DNA 測序儀產(chǎn)生的文件經(jīng)軟件Chromos 分析，產(chǎn)生清晰的序列圖譜（圖2）。測序結(jié)果經(jīng)過校正后，與發(fā)表在GenBank 上的歐洲家驢線粒體全序列（序列號：X97337）進(jìn)行序列對比，證明本試驗擴(kuò)增和測序的片段是驢線粒體DNA D-loop 區(qū)部分序列，滿足進(jìn)一步研究要求。

圖2 由ABI 3730 PRISM DNA 測序儀產(chǎn)生的序列文件Fig.2 Sequence files generated by the ABI 3730 PRISM DNA sequencer

2.3 不同堿基含量與遺傳多樣性分析

家驢mtDNA 基因組總長度16 670 bp，其中D-loop 區(qū)的總長度為 1 207 bp，GenBank 的登錄號為X97337。本研究對晉南驢99 個樣本的mtDNA D-loop 部分序列進(jìn)行測序，長度共為480 bp。以X97337 為對照，研究所測得序列核苷酸位置介于15 485～15 785（D-loop 序列 22～322）和 15 946～16 126（D-loop 序列 483～663）之間，利用 ClustalX軟件進(jìn)行序列比對，結(jié)果顯示：99 個序列4 個核苷酸 A、C、T、G 的含量分別為 29.8%、14.2%、30.3%、25.6%，全部堿基中G+C 含量為39.8%，A+T 含量為60.2%，其中57 個位點發(fā)生轉(zhuǎn)換，40個位點發(fā)生顛換。用Dnasp4.10 進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明：本研究測定晉南驢群的單倍型多樣度、核苷酸多樣度和堿基對平均差異數(shù)分別為0.867±0.034、0.0270 7、9.640（表 1），表明晉南驢品種具有豐富的遺傳多樣性。

2.4 核苷酸變異位點分析

利用軟件Dnasp4.10 分析中國晉南驢99 個個體mtDNA D-loop 480 bp。結(jié)果表明，除去缺失位點，共檢測到多態(tài)位點97 個，占總數(shù)的20.21%。在所有單倍型中，只有一個單倍型出現(xiàn)變化的位點為單一多態(tài)位點；有2 個單倍型分別出現(xiàn)不同的位點稱之為三堿基的單一多態(tài)位點；有2 個以上單倍型出現(xiàn)一種變化的稱為兩堿基的簡約信息位點；在同一位點有2 種不同的變化且每種變化都含有2 個以上的單倍型的位點稱為三堿基簡約信息位點。本研究共發(fā)現(xiàn)單一多態(tài)位點為56 個，占總位點的11.67%。簡約信息位點為41 個，占總分析位點的8.54%。其中兩堿基單一多態(tài)位點（two variants＞）52 個堿基位置分別為：76、77、78、83、86、88、105、121、142、153、179、187、188、192、193、203、208、209、212、213、215、216、219、221、223、224、229、231、232、233、234、236、238、241、242、243、246、248、249、252、257、259、262、265、266、267、274、285、288、312、509、528。兩堿基簡約信息位點 30 個，堿基位置分別為：74、80、81、82、93、106、111、112、115、129、130、137、138、162、163、181、185、205、217、226、284、297、298、512、529、587、593、613、614、635。 三 堿基單 一 多 態(tài) 位點（there variants＞）4 個堿基位置分別為：79、87、90、227。三堿基簡約信息位點9 個堿基位置分別為：84、96、99、101、145、186、204、225、256。四堿基簡約信息位點2 個，堿基位置分別為：97、98。

表1 晉南驢遺傳多樣指數(shù)Table 1 Genetic diversity index of Jinnan donkey

2.5 單倍型及單倍型分析

經(jīng)分析中國晉南驢99 個個體mtDNA D-loop，共定義出 54 個單倍型（Haplotype）（表 2）。

在 54 種單倍型 99 個個體中，Hap_35 出現(xiàn)頻率最高為36.36%，包含了36 個個體，其余單倍體均包含1～3 個個體（表2）。這個結(jié)果表明，單倍體Hap_35 為優(yōu)勢單倍體。

表2 晉南驢mtDNAD-loop 54 種單倍型的多態(tài)位點Table 2 Polymorphic loci of 54 haplotypes in mtDNA D-loop of Jinnan donkey

2.6 體型統(tǒng)計分析

分別對18 頭公驢和75 頭母驢進(jìn)行描述性統(tǒng)計，成年公驢的身高、體長、胸圍和管圍（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn) 差）分 別 為（130.61±4.6）cm、（122.0±5.6）cm、（146.2±6.7）cm 和（15.78±0.81）cm；成年母驢的身高、體長、胸圍和管圍（數(shù)據(jù)±標(biāo)準(zhǔn)差）分別為（126.4±6.7）cm、（120.6±7.3）cm、（145.3±7.7）cm 和（15.84±0.7）cm。體型符合呂效吾在山西省家畜家禽品種志中列出的大型驢種標(biāo)準(zhǔn)，晉南驢屬于大型驢種（表3、表4）［7］。

將本研究18 頭公驢和75 頭母驢的體型數(shù)據(jù)與呂效吾的山西省家畜家禽品種志中377 頭公驢和 720 頭母驢的測量數(shù)據(jù)進(jìn)行 F、t 檢驗［7］。研究結(jié)果表明此次晉南驢群測定結(jié)果在身高、體長和管圍等體型性狀上與之相比沒有顯著性差異，但胸圍與之相比差異顯著，有增加趨勢（表5、表6）。

表3 公驢測定性狀的描述性統(tǒng)計Table 3 Descriptive statistics of male donkeys

表4 母驢測定性狀的描述性統(tǒng)計Table 4 Descriptive statistics of female donkeys

表5 樣本組與對照組（公驢）體型的F、t 檢驗結(jié)果Table 5 Statistic analysis results of F and t test of control and sample groups（male）

表6 樣本組與對照組（母驢）體型差異的F、t 檢驗結(jié)果Table 6 Statistic analysis results of F and t test of control and sample groups（female）

研究進(jìn)一步對試驗測量得到的18 頭公驢和75頭母驢的身高、體長、胸圍和管圍進(jìn)行F 和t 檢驗，對比數(shù)據(jù)結(jié)果，公母兩種性別的驢在體長、胸圍和管圍上沒有顯著性差異，且公驢的身高高于母驢（表7）。

2.7 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹及親緣關(guān)系分析

從GenBank 中引用已經(jīng)遞交的歐洲家驢線粒體基因組全序列（登錄號為X97337），與本研究測得的晉南驢99 個個體組成的54 個單倍型（標(biāo)號分別為）共 55 個序列，采用 N-J（Neighbor Jioning）法，由MEGA3.1 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，設(shè)定為Kimura 兩參數(shù)法，重復(fù)次數(shù) 1 000 次（圖 3）。該群體的親緣關(guān)系主要分為兩支，其中一支與X97337（歐洲家驢）聚在一起，表明晉南驢群體在親緣關(guān)系上有一定的分化，群體有一定的混雜。

對晉南驢群體中的18 頭公驢構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，采用 N-J（Neighbor Jioning）法，由 MEGA3.1軟件構(gòu)建，設(shè)定為Kimura 兩參數(shù)法，重復(fù)次數(shù)1 000 次（圖4）。結(jié)果表明公驢的親緣關(guān)系也分為兩支，證明晉南驢群體在親緣關(guān)系上有一定分化。

表7 晉南公母驢體型差異F、t 檢驗結(jié)果Table 7 Statistic analysis results of body phenotype F and t test of male and female donkeys

圖3 晉南驢54 個單倍型和GenBank 中歐洲驢構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 NJ phylogenetic tree of Jinnan 54 haplotypes of donkey constructed with European donkey from Gen-Bank

圖4 晉南驢18 個雄性個體的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of 18 male individuals of JinNan donkey

3 討論與結(jié)論

3.1 晉南驢mtDNA D-loop 區(qū)的遺傳多樣性

哺乳動物的線粒體堿基替換存在轉(zhuǎn)換偏倚現(xiàn)象，且隨著進(jìn)化時間增加，轉(zhuǎn)換偏倚下降。本研究結(jié)果與朱文進(jìn)、高雪等［8，9］對中國家驢品種研究結(jié)果相符，沒有發(fā)生序列長度變異，核苷酸變異發(fā)生轉(zhuǎn)換的頻率高于顛換。本研究發(fā)現(xiàn)晉南驢mtDNA D-loop 區(qū)的變異除去缺失和插入的位點，包括了57 處堿基轉(zhuǎn)換和40 處堿基顛換，轉(zhuǎn)換和顛換之比為1.43。這表明晉南驢的mtDNA 在這一區(qū)域有著較高的轉(zhuǎn)換和顛換。

晉南驢群體中共檢測到核苷酸多態(tài)位點97個，多態(tài)位點比例為20.21%；核苷酸多樣度0.027 07；54 種單倍型，單倍型比例為 54.55%，其中Hap_35 出現(xiàn)頻率最高為36.36%，包含了36 個個體，單倍體Hap_35 為優(yōu)勢單倍體。單倍型多樣度為0.867±0.034。表明晉南驢的遺傳多樣性較為豐富，但種群有一定混雜，親緣關(guān)系有一定的分化。Ivankovic［10］對 克 羅 地 亞 的 3 個驢群體 28 個個體mtDNA D-loop 區(qū)的一段391 bp 序列進(jìn)行分析，檢測到36 個核苷酸多態(tài)位點，多態(tài)位點比例為9.21%。其中堿基替換34 個，占94.44%，2 個插入位點，占5.56%。楊東英［11］對2 個品系德州驢（三粉驢和烏頭驢）的線粒體DNA D-loop 區(qū)399 bp 的堿基序列進(jìn)行分析，檢測出核苷酸多態(tài)位點24 個，多態(tài)位點比例為6.02%。趙朝霞［12］分析中國的6 個家驢品種（關(guān)中驢、德州驢、慶陽驢、泌陽驢、廣靈驢、晉南驢）mtDNA D-Loop 部分序列的遺傳多樣性，單倍型多樣度以關(guān)中驢、晉南驢較高，分別為 0.834 和0.904；其次為泌陽驢和廣靈驢，分別為0.629、0.529；德州驢和慶陽驢較低，分別為 0.467、0.599。而雷初朝［13］的研究發(fā)現(xiàn)關(guān)中驢的D-loop 區(qū)核苷酸變異只有轉(zhuǎn)換1 種形式，6 頭關(guān)中驢D-loop 區(qū)的核苷酸序列組成3 種單倍型，單倍型比例為50.00%。對比以上這些研究，本次測定的晉南驢DNA D-loop 區(qū)部分發(fā)現(xiàn)了較多的SNP 多態(tài)性位點，這一結(jié)果與我們所用的晉南驢群體樣本量較大有一定的關(guān)系，同時也表明該試驗群體中的驢來源較為廣泛。

3.2 晉南驢體型變化

自1979 年山西省開展的畜禽品種資源調(diào)查后，多年沒有對晉南驢開展規(guī)模化的體型測定工作。本文對晉南驢群中18 頭公驢和75 頭母驢的4個體型性狀：身高、體長、胸圍和管圍進(jìn)行測定，結(jié)果表明此次研究的晉南驢群的體型符合山西省家畜家禽品種志的大型驢種標(biāo)準(zhǔn)，屬于大型驢種。將本次體型測定與呂效吾在山西省家畜家禽品種志中列出的晉南驢377 頭公驢和720 頭母驢的體型測定數(shù)據(jù)進(jìn)行對比發(fā)現(xiàn)，晉南驢在身高、體長和管圍等體型性狀上與40 年前的測定結(jié)果一致，無顯著差異，但胸圍與之相比有增加趨勢且二者之間差異顯著，可能的原因是過去驢作為農(nóng)業(yè)耕作和運輸工具，不需要經(jīng)過育肥期，所以胸圍較小；而現(xiàn)在驢主要是作為肉用動物，需要經(jīng)過10 個月的育肥期，并且驢的運動量大大減少，所以造成驢的胸圍有增大趨勢。

3.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹及親緣關(guān)系

晉南驢試驗群體中的18 頭公驢分別來自曲沃、侯馬、夏縣、聞喜等地，結(jié)合其產(chǎn)地及遺傳距離（圖4），可將其分為9 個家系，再按照晉南驢體格高大，頭部清秀，背腰平直、黑色帶“三白”的特征選擇良種，為晉南驢的品種保護(hù)工作提供依據(jù)與方向。

在分子水平上本文證明了晉南驢具有較為豐富的遺傳多樣性，并以此為依據(jù)判斷了晉南驢的親緣關(guān)系以促進(jìn)品種保護(hù)工作的開展，但要進(jìn)一步研究晉南驢的遺傳多樣性，還需要開展多種類型的遺傳分析以獲得更多的遺傳學(xué)證據(jù)。

晉南驢mtDNA D-Loop 區(qū)的序列分析顯示該群體在親緣關(guān)系上主要分為2 支，表明該晉南驢群體中來源不同的個體在親緣關(guān)系上有一定的分化。基于此次研究的結(jié)果，我們認(rèn)為晉南驢群體在一定程度上已與其它驢種有所混雜，急需開展相應(yīng)的保種工作。