3 株鏈霉菌對谷子早期白發(fā)病的防治作用

陳杰，楊珍平，夏清，陳昆侖，高志強(qiáng)，韓彥卿，韓淵懷，林文

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷030801）

白發(fā)病是一種由禾生指梗霉（Sclerospora graminicola）引起的系統(tǒng)性真菌病害，在全球谷子（Setaria italica）產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，發(fā)病率高達(dá)50%，造成谷子產(chǎn)量損失達(dá)30%之多［1］。目前，谷子白發(fā)病的防治措施主要有化學(xué)藥劑防除［2，3］、輪作倒茬［4］、選用抗病品種［5］等。隨著白發(fā)病對谷子造成的危害逐漸增加，尋找安全有效的防治手段仍是谷子白發(fā)病的研究熱點(diǎn)。

利用微生物防治谷類白發(fā)病的措施是可行的。目前，谷類白發(fā)病生防真菌和細(xì)菌均有相關(guān)報(bào)道。真菌中的鉤狀木霉（Trichoderma hamatum）和棘孢木霉（Trichoderma asperellum）可增強(qiáng)珍珠粟（Pennisetum glaucum）對白發(fā)病的抗性［6，7］，土壤真菌中的草酸青霉（Penicillium oxalicum）和黃連青霉（Penicillium chrysogenum）在降低白發(fā)病發(fā)病率的同時也促進(jìn)了珍珠粟的生長［8，9］。細(xì)菌中的熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）UOM SAR 14 和UOM SAR 80 浸種處理能夠降低白發(fā)病的病情并促進(jìn)珍珠粟的生長［10］，短小芽胞桿菌（Bacillus pumilus）INR7、SE34 和 枯 草 芽孢桿菌（Bacillus subtilis）GB03 對珍珠粟白發(fā)病也均有一定防治效果［11～13］。目前，谷類白發(fā)病生防放線菌的研究較少，僅Jogaiah 等［14］報(bào)道珍珠粟的根內(nèi)生放線菌灰色鏈霉菌（Streptomyces griseus）SJ_UO M-07-09 和鏈孢囊菌（Streptosporangium roseum）SJ_UOM-18-09 能夠抑制白發(fā)病病菌孢子囊的形成，然而，這些放線菌對谷子白發(fā)病的實(shí)際防除效果尚不明確。

土壤中或種子表面攜帶的卵孢子是病原菌的主要來源。白發(fā)病菌首先在地下侵染種子幼芽，進(jìn)而引起整株發(fā)病，因而白發(fā)病也屬于土傳真菌病害。土壤放線菌尤其是鏈霉菌具有防治植物土傳真菌病害的能力［15～17］。這類對土傳病害有防除作用的鏈霉菌也可能具有防治谷子白發(fā)病的潛能。因此，本研究以來源于健康土壤中對多種作物具有抗病促生作用的黃白鏈霉菌（Streptomyces albidoflavus）T4、密旋鏈霉菌（Streptomyces pactum）Act12 和婁徹氏鏈霉菌（Streptomyces rochei）D74 3 株生防鏈霉菌為試驗(yàn)材料，通過盆栽種子包衣供試鏈霉菌活菌制劑和白發(fā)病菌卵孢子，分析施菌處理和對照（不施加菌劑）中白發(fā)病的發(fā)病及谷子生長情況，初步明確3 株供試鏈霉菌對谷子生長前期白發(fā)病的防治潛能及對谷子植株生長的影響，旨在篩選有應(yīng)用價值的菌株并為谷子白發(fā)病的生防放線菌研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

谷子：本試驗(yàn)所用谷子品種為晉谷40，為易被白發(fā)病菌侵染的谷子品種，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院農(nóng)業(yè)生物工程研究所提供。病原菌：本試驗(yàn)所用谷子白發(fā)病卵孢子收集自田間發(fā)病的谷子植株，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院農(nóng)業(yè)生物工程研究所提供。鏈霉菌：黃白鏈霉菌（Streptomyces albidoflavus）T4、密 旋 鏈 霉 菌（Streptomyces pactum）Act12 和婁徹氏鏈霉菌（Streptomyces rochei）D74，對多種作物具有抗病促生作用［18～20］的土壤放線菌。3 株鏈霉菌均以固態(tài)發(fā)酵粉狀制劑的方式施加，菌劑由西北農(nóng)林科技大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院微生物資源研究室提供。其中，T4、Act12 和D74 菌劑中活孢子含量分別為每克干菌粉中2.3×109個、6.1×109個和 2.3×109個。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)設(shè)計(jì)：本試驗(yàn)設(shè)計(jì)分別施加T4、Act12 和D74 鏈霉菌劑的3 個處理和1 個不施加菌劑的對照。

病原菌與放線菌混合物制備：稱取0.02 g 谷子白發(fā)病卵孢子粉，加入已滅菌過0.25 mm 篩的6.0 g 土中混勻，制成卵孢子土，再將卵孢子土與鏈霉菌菌劑按質(zhì)量比1∶1 混合均勻制備成病原菌與鏈霉菌劑的混合物，以滅菌土代替鏈霉菌劑的處理作為對照。

種子包衣方法：將已知粒數(shù)的均勻飽滿谷子種子用6%羧甲基纖維素鈉溶液浸濕后放于上述混合物中，至各粒種子均勻包裹混合物后取出，播種，剩余混合物烘干、稱重用于計(jì)算菌劑包衣量。每粒谷子種子平均粘附T4、Act12 和D74 孢子的數(shù) 目 分 別 為 1.3×107個 、5.7×107個 和 1.3×107個。

試驗(yàn)方法：盆栽土壤選用田間耕層土壤，過0.5 cm 篩去除石子和植物殘?jiān)蠹尤?/2 體積的蛭石，混勻。加入 0.4 g·kg-1尿素和 1.2 g·kg-1過磷酸鈣后再次混勻，裝入直徑為11 cm，高10 cm 的底部帶孔的塑料花盆中，每盆裝土0.4 kg。每盆播種4 穴包衣后谷子，每穴2 粒，各處理6 盆重復(fù)。播種日期為2019 年4 月22 日，播種后將試驗(yàn)盆放于光照和黑暗時間分別為12 h 的25 ℃人工氣候箱中培養(yǎng)并正常管理。于播種后15 d 和45 d 測量谷子株高。播種后15 d、45 d 和75 d 統(tǒng)計(jì)各株谷子總?cè)~片數(shù)和白發(fā)病葉數(shù)（葉脈中間能觀察到白發(fā)病癥狀即視為發(fā)病），按公式（1）計(jì)算病葉率（%）；同時于播種后75 d，將發(fā)病葉片按發(fā)病程度進(jìn)行分級（0級，健康葉片；1 級，白發(fā)病癥狀面積小于或等于整個葉片面積1/2；2 級，葉片白發(fā)病癥狀面積大于整個葉片面積 1/2；3 級：出現(xiàn)“白化葉”癥狀。），并按公式（2）計(jì)算各株谷子病情指數(shù)。播種后75 d，采集各處理中各株谷子頂數(shù)第2 片完全展開葉，用冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室4 ℃冰箱保存，用于POD 和PPO 酶活力的測定。POD 采用愈創(chuàng)木酚法，PPO 采用鄰苯二酚法測定［21］。同一采樣時間，收獲各盆地上部剩余植株，稱量鮮重和烘干后干重。采樣時各處理隨機(jī)選取3 盆，小心取出谷子完整根系，用自來水沖洗掉表面泥土后用WinRHIZO 根系系統(tǒng)進(jìn)行分析，獲取每盆總根長、根表面積、根體積和根平均直徑數(shù)據(jù)，然后將根系烘干稱重。其余3 盆根系取出洗凈烘干后稱量干重。各指標(biāo)數(shù)據(jù)按公式（3）計(jì)算處理與對照數(shù)值相比的增加率△CK（%）。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用Microsoft Excel 2016 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，Sigmaplot 12.5 進(jìn)行作圖，SPSS 18.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，最小顯著差數(shù)法（LSD）進(jìn)行多重比較（P＜ 0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 鏈霉菌對谷子白發(fā)病的防除作用

由圖1 可見，播種后15 d，施加3 種鏈霉菌劑對谷子白發(fā)病的病葉數(shù)及病葉率影響不大。播種后45 d，T4 和Act12 菌劑處理的病葉數(shù)和病葉率與不施加菌劑的對照相比降低了64.3%～83.3%，但差異未達(dá)顯著水平。在播種后75 d，施加T4 和Act12 菌劑的處理中，病葉數(shù)與對照相比分別顯著減少了 35.9% 和 21.9%（P＜ 0.05）；施加 T4、Act12 和D74 的處理中，病葉率也分別顯著降低了41.4%、20.6%和18.7%（P＜ 0.05）。

由圖 2 可見，播種后 75 d，施加 T4 和 D74 的處理中，谷子白發(fā)病病情指數(shù)與不施加菌劑的對照相 比 亦 分 別 降 低 了 36.0% 和 21.3%（P＜ 0.05）。

2.2 鏈霉菌劑對谷子生長的影響

由圖3 可見，播種后15 d，在施加T4 和Act12菌劑的處理中，谷子株高分別為4.2 cm 和4.5 cm，與對照相比分別增加了15.4% 和24.2%（P＜0.05）；Act12 處理的播種后45 d 谷子株高與對照相比增加了24.4%（P＜ 0.05）。D74 對谷子播種后15 d 和45 d 的株高均無顯著影響。

由表 1 可見，播種后 75 d，T4 和 Act12 處理谷子葉片數(shù)與對照相比分別增加了20.3%和19.4%（P＜ 0.05），T4、Act12 和 D74 處理下同一時期谷子地上部植株總干重與對照相比分別增加了32.9%、23.7% 和 22.7%（P＜ 0.05）。在施加D74 的處理中，谷子地上部鮮重為9.8 g，與對照相比增加了 50.3%（P＜ 0.05）。此外，T4 和 Act12處理的谷子地上部鮮重與對照相比分別增加了21.6%和21.9%，T4 也使谷子根系干重與對照相比增加了19.8%，但處理與對照間差異不顯著。

由表 2 可見，T4、Act12 和 D74 3 種菌劑對谷子總根長、根表面積和根體積影響不大；但Act12 處理谷子根系的平均直徑與不施加菌劑的對照相比顯著增加了 102.6%（P＜ 0.05），T4 和 D74 處理谷子平均直徑較對照分別增加了65.1% 和35.9%，但對照與處理間差異不顯著。

圖1 鏈霉菌對谷子白發(fā)病病葉數(shù)（a）和病葉率（b）的影響Fig.1 Effects of Streptomyces on the number（a）and proportion（b）of diseased leaves

圖2 鏈霉菌對播種后75 d 谷子白發(fā)病病情指數(shù)的影響Fig.2 Effects of Streptomyces on the disease index of millet downy mildew at 75 days after sowing

圖3 鏈霉菌對谷子株高的影響Fig.3 Effects of Streptomyces on the plant height of millet

由圖4 可見，播種后75 d，D74 處理下谷子葉片POD 酶活力與無菌劑對照相比增加了71.4%，T4 處理下谷子葉片PPO 酶活力也與對照相比增加了22.2%，然而，對照與處理間差異均不顯著。施加Act12 菌劑對播種后75 d 谷子葉片POD 和PPO 酶活力亦無顯著影響。

3 討論與結(jié)論

目前，谷子白發(fā)病生防真菌和細(xì)菌已有不少研究［6，22］，但尚缺乏生防放線菌的相關(guān)報(bào)道。本研究結(jié)果表明，施加黃白鏈霉菌T4、密旋鏈霉菌Act12 和婁徹氏鏈霉菌D74 三種鏈霉菌劑對接菌前期（播種后15 d 和45 d）谷子白發(fā)病的發(fā)生影響不大；而在接菌后期（播種后75 d）均顯著降低了谷子白發(fā)病的病葉率并增加了地上部生物量，同時T4 和Act12 降低了白發(fā)病的病情指數(shù)。這表明供試3 株鏈霉菌能夠降低谷子植株受白發(fā)病菌侵染后的發(fā)病程度，同時促進(jìn)谷子植株的生長，減輕白發(fā)病對谷子造成的危害。

表1 鏈霉菌對播種后75 d 谷子生長的影響Table 1 Effects of Streptomyces on the growth of millet plants at 75 days after sowing

表2 鏈霉菌對播種后75 d 谷子根系指標(biāo)的影響Table 2 Effects of Streptomyces on the root traits of millet plants at 75 days after sowing

圖4 鏈霉菌對谷子葉片防御酶活性的影響Fig 4 Effects of Streptomyces on the activities of defensive enzymes of millet leaves

放線菌尤其是鏈霉菌能夠產(chǎn)生代謝物質(zhì)抑制病原菌的生長［23，24］。相關(guān)研究表明，Act12 等土壤鏈霉菌的代謝產(chǎn)物中存在抑制土傳真菌生長的物質(zhì)［25，26］。本研究中所用 3 株鏈霉菌也可能通過產(chǎn)生了某些抗菌次級代謝產(chǎn)物抑制土壤及谷子種子表面白發(fā)病病原真菌的生長，進(jìn)而減輕了谷子白發(fā)病的病癥，但具體發(fā)揮作用的代謝物質(zhì)仍需進(jìn)一步試驗(yàn)確定。

大量定殖于土壤是土壤放線菌發(fā)揮作用的基礎(chǔ)。本試驗(yàn)中，谷子白發(fā)病菌與放線菌同時接種于谷子種子表面后播種，鏈霉菌從接菌開始到在土壤中大量繁殖并發(fā)揮作用需要一段時間，這可能是接種鏈霉菌早期對谷子白發(fā)病防治效果不明顯的原因之一。

放線菌能夠通過作用于植株根系，刺激根系的生長發(fā)育，進(jìn)而增加作物對根系侵染病害的抗性。本試驗(yàn)中，施加3 種鏈霉菌劑都顯著增加了谷子的地上部生物量，但對根系生長和發(fā)育的影響不大，這可能與谷子植株體內(nèi)資源分配策略有關(guān)：通過將更多的養(yǎng)分轉(zhuǎn)移到地上部莖葉，提高光合作用能力，產(chǎn)生更多的有機(jī)物后期轉(zhuǎn)運(yùn)到籽粒中，從而增加植株的生存能力。通過誘導(dǎo)提高植物自身抗性是放線菌防治真菌病害的重要機(jī)制［18，27，28］。植物受病原菌侵染時，體內(nèi)活性氧大量累積，危害植物正常生長［29］。POD、PPO 和 PAL 等氧化酶類通過清除植物體內(nèi)過剩的超氧自由基或促進(jìn)木質(zhì)素和氧化酚類等增強(qiáng)植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)物質(zhì)的產(chǎn)生來增強(qiáng)植物的抗病性［30，31］。包括 Act12 等多種土壤鏈霉菌具有增強(qiáng)植物葉片防御酶活性的功能［32，33］。據(jù)報(bào)道，谷類作物對白發(fā)病的抗性與植株P(guān)OD 和PAL 等多種酶活力提高有關(guān)［7，34］。然而，在本研究中，僅施加T4 和D74 菌劑的處理在數(shù)值上增加了谷子葉片POD 和PPO 酶活力。分析其原因，一方面可能是3 種供試鏈霉菌本身對谷子生長早期防御酶活力的影響不大；另一方面，本試驗(yàn)中鏈霉菌劑施加量為常規(guī)用量，可能不是各菌劑最佳施用量，因而導(dǎo)致鏈霉菌的功能未完全表現(xiàn)出來，后續(xù)研究應(yīng)進(jìn)一步探究各菌劑尤其是T4 防治谷子白發(fā)病的最佳施用量。

本研究采用種子表面包衣粉狀活菌制劑的形式施加供試鏈霉菌，較傳統(tǒng)菌懸液和發(fā)酵液的施用方式具有活性高、耐保存、操作簡單和便于田間大規(guī)模應(yīng)用等多種優(yōu)勢。白發(fā)病菌首先在地下通過侵染種子幼芽進(jìn)而引發(fā)植株發(fā)病。本試驗(yàn)通過在谷子種子表面包裹一層活菌孢子粉，使病原菌在地下侵染種子幼芽和根系時，放線菌在種子周圍同步大量繁殖，充分與植物根系和病原菌接觸，能夠更好地發(fā)揮防治作用。本試驗(yàn)在室內(nèi)小盆栽條件下研究了3 種供試鏈霉菌劑對谷子白發(fā)病的防治效果，后續(xù)試驗(yàn)應(yīng)進(jìn)一步探究室外盆栽及田間土壤條件下供試放線菌對谷子整個生育期白發(fā)病的防治作用及植株生長和產(chǎn)量的影響。

綜上所述，3 株供試鏈霉菌 T4、Act12 和 D74均具有防治谷子白發(fā)病的潛能，其中以T4 的防病促生效果最好。本研究結(jié)果表明，土壤放線菌尤其是具有抗病促生等多種功能的鏈霉菌具有防治谷子白發(fā)病的潛能，為谷子白發(fā)病生防微生物的選擇提供了新的思路。