石墨烯對(duì)白榆扦插苗生長和生理生化特征的影響

張曉 ，曹慧芬 ，趙建國 *，王海雁 ，姚建忠 ，王俐彤 ，張倩琦 ，馬利娟

（1.山西大同大學(xué)炭材料研究所，山西大同037009；2.山西大同大學(xué)生命科學(xué)院，山西大同037009；3.山西省桑干河楊樹豐產(chǎn)林實(shí)驗(yàn)局，山西大同037006）

白榆（Ulmus pumilaL.），多年生落葉喬木，是我國北方重要的用材林和園林綠化樹種［1］。白榆的根系發(fā)達(dá)，具有生長速度快、抗干旱、抗嚴(yán)寒、耐貧瘠等優(yōu)點(diǎn)，是適宜北方干旱、半干旱氣候和鹽堿環(huán)境的優(yōu)良樹種，對(duì)于防治空氣污染、土壤修復(fù)、防風(fēng)固沙等具有重要作用［2］。

石墨烯作為一種二維碳納米片層材料，因其獨(dú)特的理化性質(zhì)，優(yōu)異的電學(xué)、熱學(xué)、機(jī)械性能以及比表面積大等優(yōu)點(diǎn)，已在電化學(xué)、生物醫(yī)學(xué)、催化和復(fù)合材料等諸多領(lǐng)域廣泛應(yīng)用［3］，而在農(nóng)林業(yè)領(lǐng)域，石墨烯的應(yīng)用才剛剛開始。隨著對(duì)石墨烯的深入研究和廣泛應(yīng)用，人們對(duì)石墨烯生物效應(yīng)的了解越來越豐富［4］。有研究表明石墨烯可以被水稻根系吸收，并轉(zhuǎn)運(yùn)到地上部器官，最終被分解成CO2［5］。在固體培養(yǎng)基中，適宜濃度的石墨烯處理可以促進(jìn)草本植物藜麥［6］以及木本植物歐洲山楊［7］、樹莓［8］組培苗的根生長，并能增加植物的生物量。在液體培養(yǎng)基中，200 mg·L-1的水合石墨烯帶處理可以促進(jìn)衰老小麥種子萌發(fā)和根系分化［9］。在土壤中，50 mg·L-1的氧化石墨烯處理菠菜和細(xì)香蔥可以加速其種子萌發(fā)［10］；50 和 200 mg·L-1的氧化石墨烯處理陸地棉和長春花后可以加速種子萌發(fā)、促進(jìn)根系和地上部生長，誘導(dǎo)提前開花并能增加花器官的生物量［11］。石墨烯促進(jìn)植物生長的機(jī)理，目前已有許多研究。首先，石墨烯片層邊緣被含氧基團(tuán)修飾后具有良好的水分傳導(dǎo)性能，可以促進(jìn)植物的種子和植株的水分吸收［10］。其次，石墨烯處理可以改變植物體內(nèi)的基因表達(dá)和代謝活動(dòng)，促進(jìn)植物的根、莖、葉等器官的生長［4，6～8，12，13］。此外，石墨烯可以緩解土壤中的重金屬Cd2+對(duì)水稻芽和種子根以及玉米幼苗生長的毒害效應(yīng)［14］。目前，石墨烯影響植物生長的研究大多集中于草本植物，少數(shù)針對(duì)木本植物的研究則是在培養(yǎng)基中進(jìn)行，而在植物的實(shí)際生長環(huán)境土壤中，石墨烯對(duì)木本植物生長的影響目前少見報(bào)道。

葉片的光合作用及根系的吸收能力是決定樹木存活和生長速度的重要因素。光合作用是植物生長的基礎(chǔ)，為植物提供物質(zhì)和能量［15］，根系吸收能力是保證植物水分、礦質(zhì)元素供應(yīng)的基礎(chǔ)［16］。在光照、CO2濃度等環(huán)境條件一致的前提下，影響光合作用的內(nèi)部因素主要有葉綠素含量和氣孔特征等。研究表明：在一定范圍內(nèi)葉綠素含量與光合速率呈負(fù)相關(guān)關(guān)系［17］，而氣孔密度和氣孔導(dǎo)度與光合速率呈正相關(guān)關(guān)系［18］。植物根系吸收能力主要由根系的生物量、根系形態(tài)和根系活力共同決定［16］。

為了解析土壤中石墨烯處理對(duì)林木生長的影響，本文以白榆扦插苗為研究材料，通過分析石墨烯處理后扦插苗新生器官的生物量及生理生化指標(biāo)，并從光合效率和根系吸收能力2 個(gè)方面解釋石墨烯影響白榆扦插苗生長的作用機(jī)理，旨在為石墨烯在林木培育領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試白榆扦插枝條由山西省桑干河楊樹豐產(chǎn)林實(shí)驗(yàn)局提供，所采枝條為白榆樹當(dāng)年生枝條，枝條直徑0.5～0.6 cm，將枝條剪為約20 cm 長的莖段作為插穗，采樣時(shí)間為冬季12 月份。試驗(yàn)使用的石墨烯由山西大同大學(xué)炭材料研究所提供，含有一定量的COOH 和C-OH 官能團(tuán)修飾，因而可以與水形成氫鍵，并穩(wěn)定的存在于水溶液中形成石墨烯溶膠［6～8］。根據(jù)草本植物菠菜、細(xì)香蔥、陸地棉和長春花在土壤中石墨烯處理實(shí)驗(yàn)［10，11］，并結(jié)合我們前期土壤中多種植物處理預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本次實(shí)驗(yàn)石墨烯處理濃度為50 mg·L-1。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)用土為草炭土、蛭石和珍珠巖按照2∶1∶1的比例混合而成。將插穗基部在深度為5 cm，濃度為 50 mg·kg-1的 ABT1 生根粉中浸泡 2 h，并分別插入用水或50 mg·L-1的石墨烯溶液澆透的土中。將扦插苗轉(zhuǎn)移入光照周期為8 h 黑暗/16 h 光照，溫度為23℃，濕度為50%的培養(yǎng)室中培養(yǎng)，每10 d 用水或50 mg·L-1的石墨烯溶液處理一次。扦插苗生長60 d 后進(jìn)行觀察，每個(gè)處理有15～20 個(gè)植株，試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 生物量測定

將白榆扦插苗從土壤中取出，用自來水將根上附著的土沖洗干凈，用濾紙吸干表面水分。將枝條上新長出的莖葉及根系剪下，分別在電子天平上稱重。

1.3.2 生理生化指標(biāo)測定

植物葉片在萬分之一天平稱重后，在烘箱中110 ℃殺青 10 min，80 ℃烘干至恒重，再次稱重，植物含水量=（鮮重-干重）/鮮重；可溶性糖含量利用蒽酮法進(jìn)行測定；葉綠素用95%乙醇提取后，利用INESA L6S 紫外可見分光光度計(jì)，分別測量663 nm 和 645 nm 下的吸光度，利用公式 Ca=12.7·A663-2.59·A645， Cb=22.9·A645-4.67·A663計(jì)算葉綠素a 和葉綠素b 的含量；根系活力利用北京雷根生物技術(shù)有限公司植物根系（脫氫酶）活力檢測試劑盒（TTC 比色法）分析。

1.3.3 葉片光合特征及光合熒光測定

凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度和蒸騰速率、水分利用效率等光合特征指標(biāo)使用美國PP SYSTEMS 公司CIRAS-3 便攜式光合儀測定，測定時(shí)間為上午 7：00 到 11：00；PSII 實(shí)際光化學(xué)效率（YII）和PSII 最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）利用德國WALZ 公司PAM-2500 便攜式調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨x測定，測定時(shí)間為 19：00 到 22：00［19］。

1.3.4 氣孔分布特征值測定

植物葉片氣孔分布特征值采用指甲油印跡法測定［20］，選取大小一致的葉片，在葉片背面中間遠(yuǎn)離主脈位置涂抹指甲油，待指甲油干后將其撕下并壓片。將指甲油印記切片放于40 倍光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照，每個(gè)處理取5 個(gè)葉片，每張片子選取3 個(gè)視野拍照，利用ImageJ 軟件測量照片中的氣孔數(shù)量、氣孔長度、氣孔寬度和氣孔面積，并計(jì)算氣孔密度（個(gè)·mm-2）。

1.3.5 根系形態(tài)分析

將洗凈土的根系放入掃描儀中掃描，然后利用根系分析系統(tǒng)（WinRHIZO）對(duì)根總長度、根表面積進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)利用SPSS22.0 軟件進(jìn)行t 檢驗(yàn)，并利用Excel 2017 軟件作圖，顯示的數(shù)據(jù)均為3 次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 石墨烯對(duì)白榆扦插苗生物量的影響

白榆插穗插入基質(zhì)中，其莖段基部再生形成根，梢部再生形成莖、葉。新生莖葉和根的鮮重代表了扦插苗的生長速度。石墨烯處理明顯可以促進(jìn)白榆扦插苗的莖葉和根系生長（圖1）。與對(duì)照相比，石墨烯處理使新生莖葉的鮮重增加了36.13%，而根系鮮重增加了19.69%（表1）。

圖1 石墨烯處理后白榆扦插苗植株形態(tài)變化Fig.1 The plant morphological change of elm cutting seedlings after graphene treatment

表1 石墨烯處理對(duì)白榆扦插苗新生器官鮮重的影響Table 1 Effects of graphene on fresh weight of new organs of elm cutting seedlings

為了分析石墨烯處理后白榆扦插苗鮮重的增加是由于水分還是有機(jī)物含量的增加，我們測定了扦插苗葉片的含水量及可溶性糖含量。如表2所示，石墨烯處理并沒有明顯改變白榆扦插苗葉片的含水量，卻顯著提高了葉片的可溶性糖含量。與對(duì)照相比，石墨烯處理使白榆扦插苗的可溶性糖含量提高了43%。這個(gè)結(jié)果說明植物生物量的增加并非由于含水量增加，而是由于有機(jī)物的積累增加。植物體內(nèi)有機(jī)物來源于光合作用，植物可溶性糖含量的提高以及生物量的增加暗示，石墨烯處理可能提高了白榆扦插苗的光合效率。

表2 石墨烯處理對(duì)白榆扦插苗葉片含水量和可溶性糖含量的影響Table 2 Effects of graphene on water content and soluble sugar content of elm cutting seedlings leaves

2.2 石墨烯對(duì)白榆扦插苗光合作用的影響

為了分析石墨烯處理對(duì)白榆扦插苗葉片光合作用的影響，首先對(duì)扦插苗的光合特征進(jìn)行測量。如表3 所示，石墨烯處理顯著提高了白榆扦插苗的胞間CO2濃度、氣孔導(dǎo)度和凈光合速率等光合特征參數(shù)。與對(duì)照相比，3 個(gè)參數(shù)分別提高了13.04%、158.06%和28.97%。植物光合效率提高的同時(shí)，石墨烯處理也使葉片蒸騰速率比對(duì)照顯著提高了31.77%，因而植物水分利用效率并沒有發(fā)生顯著改變。此外，測量植物光合熒光參數(shù)，結(jié)果如表4所示。石墨烯處理使植物PSII 實(shí)際光化學(xué)效率（YII）顯著提高了19.15%，而最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）并未受到顯著影響。植物光合作用是由葉綠素吸收光能，并轉(zhuǎn)化為化學(xué)能的光反應(yīng)，和在一系列酶的作用下將CO2和水轉(zhuǎn)化形成糖的暗反應(yīng)組成。植物的葉綠素以及胞間CO2濃度是影響植物光反應(yīng)和暗反應(yīng)的重要因素，而氣孔作為葉片氣體交換的通道，是決定氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度以及蒸騰速率的重要因素。

葉綠素是植物葉綠體吸收光能進(jìn)行光合作用的關(guān)鍵物質(zhì)，也是光合作用第一步光反應(yīng)的主要成分。葉綠素含量會(huì)影響植物的光反應(yīng)，進(jìn)而影響光合效率［17］。為了分析石墨烯影響白榆光合效率的原因，我們首先測定了處理組與對(duì)照組的葉綠素含量。由表5 可見，石墨烯處理對(duì)白榆葉綠素a、葉綠素b 含量以及葉綠素a/b 值無顯著影響。

表3 石墨烯處理對(duì)白榆扦插苗葉片光合特征的影響Table 3 Effects of graphene on photosynthesis characteristics of elm cutting seedlings leaves

表4 石墨烯處理對(duì)白榆扦插苗葉片光合熒光參數(shù)的影響Table 4 Effects of graphene on photosynthesis fluorescence parameters of elm cutting seedlings leaves

表5 石墨烯處理對(duì)白榆扦插苗葉片葉綠素含量的影響Table 5 Effects of graphene on chlorophyll contents of elm cutting seedlings leaves

石墨烯處理后白榆扦插苗葉片的胞間CO2濃度、氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率顯著提高，說明石墨烯處理可能改變了扦插苗葉片表皮氣孔形態(tài)。石墨烯處理后，植物葉片表皮氣孔結(jié)構(gòu)與對(duì)照沒有明顯差異。對(duì)氣孔密度、氣孔面積等氣孔特征進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析后發(fā)現(xiàn)：石墨烯處理并沒有顯著改變氣孔長度、氣孔寬度和氣孔面積等大小指標(biāo)，但是使氣孔密度顯著提高9.96%（表6）。

表6 石墨烯處理對(duì)白榆扦插苗葉片氣孔特征的影響Table 6 Effects of graphene on stomatal traits of elm cutting seedlings leaves

2.3 石墨烯對(duì)白榆扦插苗根系形態(tài)和根系活力的影響

植物的根系形態(tài)（根長、根表面積）和根系活力是影響植物吸收能力的重要因素［16］。如表7 所示，石墨烯處理顯著影響了白榆扦插苗的根系形態(tài)。與對(duì)照相比，石墨烯處理使白榆扦插苗的總根長和根表面積分別提高了14.59%和14.58%。與根系形態(tài)不同，石墨烯處理對(duì)白榆扦插苗的根系活力沒有顯著改變。

表7 石墨烯處理對(duì)白榆扦插苗根系形態(tài)性狀和根系活力的影響Table 7 Effects of graphene on root morphology characters and root vigor of elm cutting seedlings

3 討論與結(jié)論

植物作為一個(gè)固著生長的生物，由地下根系與地上莖葉等器官組成。根系吸收水分和礦質(zhì)元素，并運(yùn)輸?shù)降厣掀鞴伲欢厣掀鞴龠M(jìn)行光合作用，并將有機(jī)物運(yùn)輸?shù)礁担?1］。石墨烯處理提高了白榆扦插苗地上莖葉和地下根系的生物量，其中地上器官較地下根系鮮重增加更為顯著。

石墨烯處理后白榆扦插苗葉片含水量沒有明顯變化，而可溶性糖含量顯著增加，這說明石墨烯處理主要促進(jìn)白榆有機(jī)物的積累。有機(jī)物主要是在葉片通過光合作用形成，白榆葉片有機(jī)物含量增加表明石墨烯處理可能提高了白榆的光合效率。石墨烯處理后白榆的葉片凈光合效率提高的同時(shí)，氣孔導(dǎo)度、蒸騰效率和胞間CO2濃度都發(fā)生顯著提高，這說明石墨烯處理導(dǎo)致的光合速率提高主要與葉片氣孔因素相關(guān)［22］。石墨烯處理后白榆PSⅡ?qū)嶋H光化學(xué)效率（YⅡ）提高，而PSⅡ最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）和葉綠素含量沒有明顯變化，表明植物的光反應(yīng)系統(tǒng)沒有明顯變化［23］。氣孔特征統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明石墨烯處理沒有影響氣孔大小，而顯著增加了葉片的氣孔密度。這些結(jié)果說明石墨烯處理導(dǎo)致白榆扦插苗氣孔密度增加，進(jìn)而引起氣孔導(dǎo)度和胞間CO2濃度提高，最終提高光合速率。

根系是植物與土壤接觸的橋梁，扦插苗的根系不僅是植物生物量的重要組成部分，也是決定扦插苗吸收能力的重要因素。通過對(duì)白榆扦插苗的根系進(jìn)行分析表明：石墨烯處理可以顯著促進(jìn)白榆的根系生長，提高總根長和總根表面積，卻并沒有顯著改變扦插苗根系的根系活力。這些結(jié)果說明：石墨烯處理可以通過促進(jìn)白榆扦插苗的根系生長，擴(kuò)大植物的吸收面積，從而為植物生長提供充足的營養(yǎng)。

在溶液和固體培養(yǎng)基中的研究表明，石墨烯的生物效應(yīng)與其使用濃度密切相關(guān)，大多表現(xiàn)為低濃度促進(jìn)，高濃度抑制的雙重作用［6～8，24］。在土壤中對(duì)草本植物的研究表明，50 和 200 mg·L-1的石墨烯處理表現(xiàn)為促進(jìn)植物生長的效應(yīng)［10，11］。我們的研究發(fā)現(xiàn)50 mg·L-1石墨烯處理木本植物白榆扦插苗后，植物根系及地上部的生物量相比對(duì)照都出現(xiàn)顯著增加。在未來的研究中，有必要進(jìn)一步探討不同濃度石墨烯處理對(duì)木本植物生長的影響，更好地指導(dǎo)育苗和生產(chǎn)活動(dòng)。

石墨烯增加根系吸收面積和提高葉片可溶性糖含量的作用具有重要的應(yīng)用價(jià)值。首先，植物根系結(jié)構(gòu)是一個(gè)重要的耐旱性指標(biāo)，林木根系的深度和廣度是干旱條件下林木存活的重要影響因素［25］。此外，可溶性糖是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，可溶性糖含量對(duì)干旱脅迫下植物的滲透調(diào)節(jié)具有重要作用［26］。石墨烯處理可能有增強(qiáng)植物的抗旱性的作用，對(duì)于干旱地區(qū)林木栽培具有重要意義。石墨烯可以成為一種新型生長促進(jìn)劑應(yīng)用于林木生產(chǎn)，未來隨著對(duì)石墨烯促進(jìn)植物生長機(jī)理的認(rèn)識(shí)越來越深刻，石墨烯在農(nóng)林業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用前景必將更加廣闊。