姥鮫烷誘導(dǎo)法建立小鼠狼瘡腎炎模型*

沈立軍，顏天銘，王玉玉，孔 永

（蘇州大學(xué) 1生物醫(yī)學(xué)研究院，2醫(yī)學(xué)部免疫學(xué)系，江蘇蘇州215123；3江蘇荃信生物醫(yī)藥有限公司，江蘇泰州225300）

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是由環(huán)境、遺傳和內(nèi)分泌等多種因素導(dǎo)致機(jī)體免疫耐受喪失、免疫功能紊亂進(jìn)而造成包括腎臟在內(nèi)的多組織器官慢性損傷的自身免疫性疾病[1]。研究表明環(huán)境因素在致機(jī)體氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡過(guò)度及促進(jìn)自身抗原產(chǎn)生并引發(fā)自身免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[2-3]。來(lái)源于礦物油中的烯烴化合物姥鮫烷（pristane）為細(xì)胞膜激活劑，可導(dǎo)致細(xì)胞毒性、誘導(dǎo)凋亡及產(chǎn)生活性氧中間體，促進(jìn)產(chǎn)生自身抗原及形成炎性內(nèi)環(huán)境，激活自身免疫細(xì)胞，從而打破自身免疫耐受，導(dǎo)致SLE的發(fā)生[4-5]。

SLE動(dòng)物模型主要有自發(fā)性和誘導(dǎo)性之分，其中自發(fā)性模型有NZB×NZ、MPL/lpr、BXSB等；誘導(dǎo)性模型有化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)模型及慢性移植物抗宿主病模型，化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)模型的誘導(dǎo)劑有伴刀豆球蛋白A、細(xì)菌脂多糖、姥鮫烷等。1994年，McGaha等[6]應(yīng)用姥鮫烷誘導(dǎo)BALB/c小鼠出現(xiàn)類似于人類SLE的癥狀，首次建立了姥鮫烷誘導(dǎo)的狼瘡小鼠模型。與自發(fā)性狼瘡小鼠模型所不同的是該模型側(cè)重于研究環(huán)境因素打破機(jī)體免疫耐受以及導(dǎo)致SLE的機(jī)制，為探究非遺傳因素在SLE發(fā)病過(guò)程中的作用提供了有力的工具，現(xiàn)在也成為最常用的SLE小鼠模型之一[7]。Calvani等[8]的研究表明，姥鮫烷在體內(nèi)外均可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，為打破免疫耐受提供了自身核抗原，引發(fā)自身抗體形成，進(jìn)而形成免疫復(fù)合物沉積于各臟器，造成病理?yè)p害。鑒此，本文采用姥鮫烷單次腹腔注射誘導(dǎo)建立C57BL/6小鼠狼瘡腎炎（lupus nephritis，LN）模型，通過(guò)對(duì)免疫細(xì)胞活化、自身抗體產(chǎn)生、細(xì)胞因子表達(dá)及腎臟病理改變等指標(biāo)的綜合分析，并首次使用透射電鏡觀察該模型腎臟組織超微結(jié)構(gòu)的改變，研究誘導(dǎo)模型形成及病理?yè)p傷的表現(xiàn)及演變過(guò)程并探討其免疫機(jī)制。

材料和方法

1 材料

6～8周齡雌性清潔級(jí)C57BL/6小鼠購(gòu)自蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。胎牛血清購(gòu)自HyClone；DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco；姥鮫烷購(gòu)自Sigma；抗核抗體（antinuclear antibodies，ANA）及抗雙鏈DNA（doublestanded DNA，dsDNA）抗體檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京和杰創(chuàng)新生物醫(yī)學(xué)科技公司；Albustix試紙購(gòu)自Bayer；PE標(biāo)記的抗CD11b、CD11c、Gr1及CD21抗體，F(xiàn)ITC標(biāo)記的抗B7-1及B7-2抗體，APC標(biāo)記的抗MHC-Ⅱ抗體均購(gòu)自eBioscience；PE標(biāo)記的抗小鼠IgG抗體購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)公司；兔抗鼠干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）及白細(xì)胞介素4（interleukin-4，IL-4）抗體、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體、DAB及DAPI染液購(gòu)自武漢博士德公司。

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自Thermo；高速離心機(jī)和流式細(xì)胞儀購(gòu)自Beckman Coulter；倒置顯微鏡購(gòu)自O(shè)lympus；超低溫冰箱購(gòu)自Thermo；超凈工作臺(tái)購(gòu)自Airtech。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組與模型建立 全部小鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中置于蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障系統(tǒng)SPF級(jí)飼養(yǎng)。小鼠隨機(jī)分組，每組15只：模型（model）小鼠組予一次性腹腔注射0.5 mL姥鮫烷；陰性對(duì)照（control）組小鼠以同一方式注射等量生理鹽水。

2.2 脾臟免疫細(xì)胞活化分析 注射后第10天每組處死5只小鼠，制備脾臟細(xì)胞懸液，經(jīng)破除紅細(xì)胞、洗滌后分別采用直接免疫熒光法標(biāo)記及流式細(xì)胞術(shù)分析脾臟細(xì)胞的CD11b、CD11c、Gr1和CD21表達(dá)及CD21+B細(xì)胞表面B7-1、B7-2和MHC-Ⅱ的表達(dá)。

2.3 ANA和抗dsDNA抗體的檢測(cè) 每月眼眶靜脈叢取血及分離血清，參照試劑盒說(shuō)明采用間接免疫熒光法測(cè)定ANA和抗dsDNA抗體表達(dá)及滴度。血清稀釋后，與HEp2細(xì)胞玻片或dsDNA抗原玻片反應(yīng)區(qū)室溫孵育30 min，并設(shè)陽(yáng)性及陰性對(duì)照，經(jīng)洗滌、與FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG避光孵育30 min后洗去未結(jié)合抗體，封片置于正置熒光顯微鏡（Leica）下觀察。

2.4 尿蛋白檢測(cè) 每月取小鼠晨尿，采用Albustix試紙測(cè)定蛋白尿程度。根據(jù)試紙反應(yīng)區(qū)顯色程度判定尿蛋白含量（g/L）：（-）：0；（±）：0.15～0.30；（+）：0.30～1.00；（++）：1.00～3.00；（+++）：3.00～20.00；（++++）：＞20.00。

2.5 腎臟免疫復(fù)合物沉積檢測(cè) 注射后8個(gè)月處死小鼠，分離腎臟以4%中性甲醛固定，5 μm石蠟切片，常規(guī)脫蠟及水化，進(jìn)行微波加熱抗原修復(fù)，5%BSA封閉，PE標(biāo)記的抗小鼠IgG抗體室溫孵育2 h，PBS洗去未結(jié)合抗體，DAPI液染色10 min，PBS沖洗，封片后于熒光顯微鏡下觀察。

2.6 腎臟組織IFN-γ和IL-4免疫組化分析 同2.5操作進(jìn)行腎臟組織固定、切片、脫蠟及抗原修復(fù)，封閉后分別用兔抗鼠IFN-γ及IL-4抗體室溫孵育2 h，洗片后予0.3%H2O2孵育15 min，加入HRP標(biāo)記羊抗兔IgG抗體室溫孵育1 h，洗滌后加入DAB孵育10 min，蒸餾水終止反應(yīng)，玻片經(jīng)烘干、二甲苯透明及封片后于光鏡下觀察。

2.7 腎臟病理學(xué)檢查 同2.5操作進(jìn)行腎臟組織固定、切片及脫蠟后，常規(guī)HE染色，制片完畢后于光鏡下觀察。

2.8 腎臟組織超微結(jié)構(gòu)透射電鏡分析 取注射8個(gè)月后處死的小鼠腎臟，切成1 mm×1 mm×1 mm小組織塊，4%戊二醛前固定24 h及1%鋨酸后固定1 h，30%及50%丙酮各脫水15 min，70%丙酮飽和醋酸鈾處理過(guò)夜，80%及90%丙酮各脫水15 min，無(wú)水丙酮脫水10 min，3次。100%丙酮與包埋劑等量混合液浸透1 h及包埋劑浸透2 h，進(jìn)行包埋后于35℃、45℃及55℃下依次聚合12 h，聚合完成后進(jìn)行超薄切片及染色，于透射電鏡下觀察。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；有序分類等級(jí)資料采用Ridit分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 小鼠的生存狀態(tài)及一般病變

從第14周起，模型組小鼠出現(xiàn)脫毛、毛色暗淡、行動(dòng)遲緩等表現(xiàn)；隨著時(shí)間推移，3只小鼠出現(xiàn)不同程度腹水，1只小鼠極度消瘦并于第7個(gè)月時(shí)死亡。8個(gè)月時(shí)小鼠腹腔內(nèi)可見(jiàn)各臟器根部、腸系膜上附有大小數(shù)量不一的白色顆粒狀或團(tuán)塊狀脂肪肉芽腫，見(jiàn)圖1A，經(jīng)檢查證實(shí)為肌肉、脂肪及炎性細(xì)胞包裹姥鮫烷增生形成的異位淋巴組織，見(jiàn)圖1B、C。模型組小鼠可見(jiàn)脾臟腫大并呈暗紅色，見(jiàn)圖1D；正常對(duì)照組小鼠的脾臟呈鮮紅色，形態(tài)正常，見(jiàn)圖1E。

Figure 1.Pathological change of pristane-induced mouse lupus nephritis model.A：lipogranulomas in abdominal cavity of model mice；B，C：HE staining of lipogranulomas；D：the appearance of spleen in model group；E：the appearance of spleen in control group.圖1 姥鮫烷誘導(dǎo)的小鼠狼瘡腎炎模型的一般病變

2 脾臟免疫細(xì)胞的活化狀況

小鼠給予姥鮫烷后第10天，脾臟中巨噬細(xì)胞（CD11b+）、DC（CD11c+）、粒細(xì)胞（Gr1+）及 B 細(xì)胞（CD21+）均出現(xiàn)不同程度活化，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＜0.05），見(jiàn)圖2A。CD21+B細(xì)胞表面的B7-1、B7-2及MHC-Ⅱ表達(dá)率也呈現(xiàn)顯著上調(diào)（P＜0.05），見(jiàn)圖2B。

Figure 2.In vitro assay of the activation degrees of mouse splenic immune cells.A：the expression rates of CD11b，CD11c，Gr1 and CD21 on the mouse splenic immune cells；B：the expression rates of B7-1，B7-2 and MHC-II on the splenic CD21+B cells.Mean±SD.n=5.*P＜0.05 vs control group.圖2 脾臟免疫細(xì)胞的活化

3 血清ANA和抗dsDNA抗體的檢測(cè)

3個(gè)月時(shí)模型組小鼠的ANA和抗dsDNA抗體陽(yáng)性率為30%和10%，滴度分別為1∶100～1∶300與1∶10～1∶30，4～7個(gè)月間二者陽(yáng)性率及滴度不斷上升，至第8個(gè)月時(shí)ANA與抗dsDNA抗體表達(dá)的陽(yáng)性率分別達(dá)到100%（+++：6只；++：2只；+：1只）和89%（+++：5只；++：3只；-：1只），見(jiàn)圖3A，同時(shí)ANA檢測(cè)亦顯示出不同的染色形態(tài)，見(jiàn)圖3B，而對(duì)照組未檢測(cè)到ANA與抗dsDNA抗體的表達(dá)。

Figure 3.Detection of ANA and anti-dsDNA antibodies in serum.A：the ANA and anti-dsDNA antibodies in serum of pristane-induced mouse lupus nephritis model（×400）；B：staining type of ANA by indirect immunofluorescence assay（×400）.圖3 血清ANA和抗dsDNA抗體的檢測(cè)

4 尿蛋白的測(cè)定

4個(gè)月時(shí)，模型組30%小鼠出現(xiàn)蛋白尿，尿蛋白含量為0.3～3 g/L，隨著時(shí)間推移，蛋白尿陽(yáng)性率和尿蛋白含量不斷增加，8個(gè)月時(shí)蛋白尿陽(yáng)性率達(dá)100%，尿蛋白含量為1～20 g/L，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 小鼠蛋白尿程度的比較Table 1.Comparison the degree of proteinuria（n=10）

5 腎臟免疫復(fù)合物沉積的檢測(cè)

8個(gè)月時(shí)，小鼠腎臟組織經(jīng)直接免疫熒光法檢測(cè)，模型組小鼠可見(jiàn)熒光呈線狀、團(tuán)塊狀沿腎小球毛細(xì)血管壁、系膜區(qū)連續(xù)性分布，襯托出腎小球輪廓，免疫復(fù)合物沉積嚴(yán)重，而對(duì)照組腎臟中熒光微弱或未見(jiàn)，與模型組呈現(xiàn)出明顯的差異，見(jiàn)圖4。

Figure 4.Immune complex deposition on mouse kidneys observed by fluorescene microscopy（×400）.圖4 腎臟免疫復(fù)合物的沉積

6 腎臟組織IFN-γ和IL-4免疫組化分析

8個(gè)月時(shí)模型組及對(duì)照組小鼠腎臟毛細(xì)血管壁及腎小管上皮細(xì)胞均可檢測(cè)到IFN-γ和IL-4的表達(dá)。模型組IFN-γ表達(dá)強(qiáng)度明顯高于對(duì)照組，而IL-4表達(dá)強(qiáng)度的差別不明顯，見(jiàn)圖5。

Figure 5.The images of immunohistochemical analysis for determining the expression of IFN-γ和IL-4 in mouse kidneys（×400）.圖5 腎臟IFN-γ和IL-4的免疫組化分析

7 腎臟HE染色及病理檢查

8個(gè)月時(shí)，模型組小鼠部分腎小球細(xì)胞數(shù)量明顯增多，系膜基質(zhì)和系膜細(xì)胞增生，腎小球內(nèi)淋巴細(xì)胞侵潤(rùn)；部分腎小球毛細(xì)血管袢萎縮以及變性壞死，腎小囊腔增大；少數(shù)腎小球呈現(xiàn)階段性壞死并伴有內(nèi)皮細(xì)胞增生。對(duì)照組小鼠腎小球未見(jiàn)明顯的淋巴細(xì)胞侵潤(rùn)及明顯體積增大或壞死現(xiàn)象，毛細(xì)血管袢薄及囊腔清晰分明，內(nèi)皮細(xì)胞和系膜細(xì)胞正常，見(jiàn)圖6。

Figure 6.HE staining analysis of mouse kidneys（×400）.圖6 腎臟HE染色分析

8 腎臟的超微結(jié)構(gòu)透射電鏡分析

模型組小鼠在第8個(gè)月時(shí)可見(jiàn)腎小球基底膜增厚、層次模糊、系膜插入、足突融合、足細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞微絨毛化壞死，系膜基質(zhì)增生等現(xiàn)象，并可見(jiàn)基膜內(nèi)、系膜區(qū)及內(nèi)皮下等部位呈不同程度電子致密物沉積；對(duì)照組小鼠腎小球僅見(jiàn)足細(xì)胞輕微融合和內(nèi)皮下少量電子致密物沉積，但基底膜厚度均勻，腎臟超微結(jié)構(gòu)基本正常，見(jiàn)圖7。

Figure 7.Ultrastructure analysis of mouse kidneys by transmission electron microscopy.圖7 腎臟超微結(jié)構(gòu)透射電鏡分析

討 論

建立狼瘡動(dòng)物模型是研究該類疾病病因、發(fā)病機(jī)制進(jìn)而尋找相應(yīng)治療手段的必要途徑，對(duì)于SLE的認(rèn)識(shí)和治療具有重要的促進(jìn)作用。目前常用的SLE動(dòng)物模型有自發(fā)性、誘發(fā)性和基因調(diào)控型3種。自發(fā)性和基因調(diào)控型模型側(cè)重研究遺傳因素對(duì)SLE發(fā)病的影響，對(duì)于全面理解由多種因素綜合作用而導(dǎo)致的SLE具有其局限性。誘發(fā)性模型是采用非自身免疫病易感小鼠運(yùn)用物質(zhì)誘導(dǎo)產(chǎn)生狼瘡癥狀，具有發(fā)病早、動(dòng)物源廣泛及經(jīng)濟(jì)實(shí)用等特點(diǎn)，尤其在當(dāng)今環(huán)境問(wèn)題突出，環(huán)境因素的致病作用和機(jī)理正日益引起重視的背景下，該類模型為研究環(huán)境因素如何誘導(dǎo)SLE發(fā)病提供了有力的手段。

姥鮫烷也稱降植烷，化學(xué)名為 2，6，10，14-四甲基十五烷（2，6，10，14-tetramethylpentadecane，TMPD），是來(lái)源于礦物油、植物、海洋生物的類異戊二烯烷烴類化合物[8]。姥鮫烷可促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌IL-6等細(xì)胞因子以及導(dǎo)致活性氧簇產(chǎn)生與炎性環(huán)境的形成，并可通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)腹腔內(nèi)細(xì)胞凋亡而產(chǎn)生自身抗原[9]，從而誘導(dǎo)機(jī)體打破免疫耐受及T、B細(xì)胞的異?；罨c應(yīng)答。本研究中發(fā)現(xiàn)姥鮫烷注射后第10天脾臟巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、抗體產(chǎn)生細(xì)胞（B細(xì)胞）較對(duì)照組均呈現(xiàn)顯著的活化。Bruns等[10]也檢測(cè)到姥鮫烷誘導(dǎo)的BALB/c小鼠模型中CD3+CD28+T細(xì)胞增加，本研究8個(gè)月時(shí)模型組小鼠大量異位淋巴組織形成及脾臟腫大的表型也印證了姥鮫烷誘導(dǎo)后小鼠免疫應(yīng)答的異常增強(qiáng)。

姥鮫烷誘導(dǎo)腹腔內(nèi)細(xì)胞凋亡以致產(chǎn)生大量細(xì)胞碎片和自身抗原，在炎性環(huán)境和免疫細(xì)胞活化的背景下，導(dǎo)致自身抗體產(chǎn)生。本研究采用間接免疫熒光法檢測(cè)了狼瘡腎炎指標(biāo)抗體ANA和抗dsDNA抗體的情況[11]，結(jié)果顯示二者于3個(gè)月時(shí)出現(xiàn)，并且其陽(yáng)性率和滴度隨著時(shí)間的推移均逐漸增加，這些結(jié)果說(shuō)明了該物質(zhì)可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生針對(duì)核抗原的自身抗體及自身免疫反應(yīng)的持續(xù)增強(qiáng)。

自身抗體識(shí)別結(jié)合沉積于腎臟組織的循環(huán)抗原、腎臟細(xì)胞凋亡形成的原位抗原及腎臟組分形成的復(fù)合物，以及循環(huán)中自身抗原、抗體形成的復(fù)合物成為腎臟組織中免疫復(fù)合沉積的主要來(lái)源[12-14]。本研究對(duì)免疫復(fù)合物在腎臟沉積狀況進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示8個(gè)月時(shí)模型組小鼠腎小球毛細(xì)血管壁、系膜區(qū)出現(xiàn)明顯的連續(xù)性分布的熒光，提示本模型免疫復(fù)合物腎臟沉積現(xiàn)象嚴(yán)重。

腎臟組織中自身抗原及免疫復(fù)合物可刺激腎臟組織細(xì)胞表達(dá)趨化因子及受體，進(jìn)而促進(jìn)炎性細(xì)胞侵潤(rùn)、炎性細(xì)胞因子分泌、補(bǔ)體激活，從而導(dǎo)致腎臟組織的慢性損傷[15-16]。本研究免疫組化分析顯示，腎臟組織中IFN-γ出現(xiàn)明顯的表達(dá)上調(diào)，提示LN疾病晚期Th1型細(xì)胞因子占優(yōu)勢(shì)作用，此結(jié)果與Richards等[17]的報(bào)道一致，但此結(jié)果可能只展現(xiàn)了疾病特定階段、特定受累組織的狀況，而細(xì)胞因子的表達(dá)譜實(shí)際受到疾病狀態(tài)及進(jìn)展的密切影響[15]。

自身抗原及免疫復(fù)合物導(dǎo)致的炎性損傷持續(xù)進(jìn)行最終可導(dǎo)致姥鮫烷誘導(dǎo)的小鼠出現(xiàn)免疫復(fù)合物型腎炎[18]，本研究中小鼠腎臟HE染色及透射電鏡病理分析結(jié)果均顯示出淋巴細(xì)胞侵潤(rùn)、組織壞死、電子致密物沉積等明顯的腎臟病理?yè)p傷，符合符合狼瘡腎炎分類標(biāo)準(zhǔn)中的Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型改變[19-20]。同時(shí)本研究中模型組8個(gè)月時(shí)出現(xiàn)的較高的尿蛋白含量表明模型鼠腎臟功能嚴(yán)重受損。

綜上所述，本研究采用姥鮫烷誘導(dǎo)的方法成功建立C57BL/6小鼠狼瘡腎炎模型，具有LN特異性抗體、蛋白尿及免疫復(fù)合物型腎炎等類似人類SLE的癥狀，證明了環(huán)境因素影響SLE發(fā)病的重要性。同時(shí)通過(guò)對(duì)免疫細(xì)胞活化、自身抗體產(chǎn)生及組織病理學(xué)改變等指標(biāo)的分析探討了環(huán)境因素誘導(dǎo)模型形成和病理?yè)p傷的機(jī)制，為研究對(duì)該模型的免疫干預(yù)效應(yīng)奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。