斑馬魚移植瘤模型在抗腫瘤藥物研發(fā)和臨床治療研究中的應用*

楊莉莉，海博寧，邵吉民

（浙江大學醫(yī)學院病理學與病理生理學系，浙江大學附屬第二醫(yī)院腫瘤研究所，浙江杭州310058）

人類腫瘤的動物異種移植模型是腫瘤研究的關鍵臨床前工具。目前最常用的動物移植瘤模型是免疫缺陷小鼠模型。近十年來，由于斑馬魚（Danio rerio）與人類基因組同源性高達70%，個體小，可大規(guī)模快速繁殖，胚體透明易于觀察，發(fā)育前一個月無適應性免疫，以及成本低等原因[1-2]，這種動物模型逐漸發(fā)展成為另一種相對快速且具有較高成本效益的人類腫瘤體內研究模型。本綜述中，我們討論了使用斑馬魚模型的優(yōu)勢及其局限性，并與小鼠模型進行了對比；整理了目前斑馬魚移植瘤模型的構建及不同的類型；總結了該模型在抗腫瘤藥物研發(fā)和臨床治療研究中的應用及其在精準醫(yī)學中的應用前景。

1 斑馬魚模型的優(yōu)勢與局限性

1.1 生物學特性 斑馬魚在二十世紀六十年代成為發(fā)育遺傳學的典范生物。由于斑馬魚體外受精、體外發(fā)育、胚體完全透明的特征，使得研究者不僅能通過記錄特定細胞在胚胎發(fā)育中的分裂歷史，跟蹤觀察每一個細胞的發(fā)育命運，同時也給遺傳操作和人工誘變提供了極為有利的條件[3]。斑馬魚胚胎發(fā)育迅速，從單細胞受精卵發(fā)育至具有可辨認的脊椎動物體節(jié)、跳動的心臟和正常的神經系統(tǒng)，只需要1周時間[4]，因此應用于藥物篩選大多在1周內即可完成。斑馬魚模型不僅使實驗周期大大縮短，實驗通量大為提高，而且斑馬魚在出生后1周內，胚胎只需置于培養(yǎng)皿中，其會消耗自身的卵黃作為營養(yǎng)物質，無需人工喂食或維護，只需偶爾更換培養(yǎng)基，極大地節(jié)約了實驗空間和飼養(yǎng)消耗。

1.2 免疫學特性 斑馬魚的先天免疫系統(tǒng)至少在受精后2 d（2 d post-fertilization，2 dpf）時才發(fā)揮其功能，而在受精后約4～6周時其適應性免疫在形態(tài)和功能上才趨于成熟[5-7]。因此如果在斑馬魚早期胚胎階段（囊胚階段至受精后48 h），即其適應性免疫應答尚未建立時，通過顯微注射建立異種移植則不需要免疫抑制劑處理。所以在斑馬魚早期胚胎中進行的研究是在其不具有完全免疫能力情況下進行的。

1.3 可視化特性 斑馬魚胚體透明可實現(xiàn)體內細胞和亞細胞成像，使其體內藥物作用效果變得可視化。而且，還可利用組織特異性表達熒光報告基因來構建轉基因斑馬魚，目前已有的如標記血管[8-9]、神經元[10]、血液[11-12]、免疫細胞[13-14]等。盡管如此，斑馬魚的成像能力僅限于較早年齡的胚胎，隨著年齡的增長，其胚胎變大且不透明，影響體內成像。目前已有光片成像技術，或稱選擇性平面照明顯微鏡技術（selective planar illumination microscope，SPIM）[15-16]，允許更深的組織穿透和更小的光毒性，但還無法穿透成年斑馬魚的組織。

1.4 局限性 斑馬魚的上述生物學特性使其與脊椎動物發(fā)育而來的哺乳動物小鼠模型相比具有明顯的優(yōu)勢，但其依然存在著一些固有的局限性。首先，雖然斑馬魚與人類基因組具有較高同源性，但其與人類蛋白質的差異不可避免地產生不同藥效[17]。其次，斑馬魚胚胎總體形態(tài)在1～5 dpf之間變化不大，但脈管系統(tǒng)和其它器官經歷了廣泛擴張和重塑[4，18]，此特點有助于發(fā)育研究，但在腫瘤研究中可能需要較穩(wěn)定的發(fā)育過程。攜帶移植瘤的斑馬魚飼養(yǎng)于34°C，低于人體生理體溫，移植瘤細胞的增殖速度不同于人類體內，而且移植瘤微環(huán)境與人類腫瘤存在差異。再者，斑馬魚主要通過直接浸泡給藥，其藥物滲透率以及口服攝取率較難預測。盡管已有研究表明斑馬魚體內的藥物分布、代謝和排泄與人類相似，但是迄今為止幾乎沒有研究深入探索這些領域。此外，斑馬魚胚胎與幼魚體積小，實驗操作較難，現(xiàn)有針對斑馬魚蛋白質的抗體數量有限。這些優(yōu)缺點的總結見表1。

表1 斑馬魚和小鼠異種移植瘤模型的優(yōu)缺點Table 1.The advantages and limitations of zebrafish and mouse xenograft models

2 斑馬魚移植瘤模型的構建和類型

2.1 移植瘤構建 對斑馬魚移植人類腫瘤細胞時，每次可以顯微注入50～300個細胞，由于斑馬魚早期免疫功能缺失因而成瘤能力明顯，還可以利用斑馬魚的成像能力進行體內的深層次觀察。研究者們嘗試了斑馬魚的幾個注射部位用以模擬不同的癌癥階段。在斑馬魚受精卵發(fā)育至囊胚階段，卵黃是唯一可能的接種部位。Lee等[19]在斑馬魚發(fā)育的囊胚階段，約受精后3.5 h，將黑色素瘤細胞首次移植到囊胚期卵黃中，提供了腫瘤細胞在注射后長達8 d的遷移行為證據。多數研究選擇2 dpf的胚胎作為異種細胞移植受體[20-21]，此時提供了更多注射部位的可能性。除了卵黃，另外兩個允許癌細胞直接釋放到血液循環(huán)中的接種部位是居維葉導管（位于卵黃囊的上部）和主靜脈（尾巴區(qū)域）[22-23]。根據移植部位的不同，可以追蹤不同的腫瘤發(fā)生發(fā)展表型，例如癌細胞的侵襲，外滲和轉移等[24]，或細胞與腫瘤微環(huán)境的相互作用等[25]。

2.2 不同移植物 構建斑馬魚移植瘤模型既可以應用體外傳代的腫瘤細胞系，又可以使用患者來源的原代腫瘤細胞（patient-derived xenograft，PDX），而采用PDX構建的移植瘤模型則能更好地模擬腫瘤細胞的真實行為。PDX通?？梢跃S持原始腫瘤的個體間遺傳異質性，模仿患者中的疾病反應，從而反映每個患者的獨特性[26]。

Marques等[27]首先研究并證實了斑馬魚可用于人類PDX移植，為檢測原發(fā)癌細胞的轉移行為提供了一種簡單而快速的方法。他使用了多種癌細胞系以及來自胰腺癌，結腸癌和胃癌的原代人類癌細胞。利用Tg（fli1a：：eGFP）斑馬魚評估了腫瘤細胞的侵襲和微轉移，并在體內進行了追蹤。Mercatali等[28]使用了來自乳腺癌患者骨轉移的PDX，并將PDX的行為與已建立的乳腺癌細胞系進行了比較，發(fā)現(xiàn)患者原代細胞可從血管中滲出并侵入斑馬魚尾部造血組織（caudal hematopoietic tissue，CHT）。作者認為斑馬魚可能是識別乳腺癌預后標志物以及預測治療反應的良好臨床前模型。另一項研究調查了人類白血病細胞的發(fā)病機理和藥物抑制作用，除細胞系外增加了從急性髓系白血病患者血液中分選出的CD34+白血病祖細胞，表明異種移植的癌細胞能夠在斑馬魚中存活，并被伊馬替尼和其他抗白血病藥物抑制[23]。

2.3 成年斑馬魚移植瘤模型 與胚胎不同，成年斑馬魚具有發(fā)育完全的免疫系統(tǒng)，因此需要防止移植排斥。輻照和藥物處理是用于免疫抑制的兩種最常用方法。低至20 Gy的單次放射劑量或25～250 mg/L的地塞米松足以形成免疫抑制[29-30]。最近，Yan等[31]建立了完全免疫缺陷的斑馬魚轉基因品系（prkdc-/-，il2rga-/-），構建了16種腫瘤細胞系及6種原代細胞的斑馬魚移植瘤模型，可飼養(yǎng)于37℃的類似人體的生理環(huán)境中。他們的結果提示這種成年斑馬魚的異種移植模型可以作為與小鼠媲美的臨床前模型，在未來的腫瘤研究中具有相當高的價值。表2總結了人類腫瘤異種移植的斑馬魚模型。

表2 斑馬魚移植瘤模型類型Table 2.Varity of zebrafish xenograft models

3 斑馬魚移植瘤模型在抗腫瘤藥物中的應用

3.1 新藥開發(fā)的藥物藥效評價 2003年，美國國家衛(wèi)生研究院將斑馬魚列為僅次于大鼠和小鼠的第三重要實驗生物（http：//www.fda.gov/forconsumers/consumerupdates/ucm343940.htm）。目前已有主要基于斑馬魚模型發(fā)現(xiàn)的新藥進入臨床試驗[39-40]。同時已有355例報道表明斑馬魚模型可作為藥物發(fā)現(xiàn)過程中的基本工具[41]。斑馬魚移植瘤模型可用于發(fā)現(xiàn)和鑒定新型小分子的作用、以及優(yōu)化和改造化合物研究，確定藥效、毒性以及作用機理。表3概述了目前已報道的應用斑馬魚移植瘤模型進行藥物藥效評價的情況。

表3 斑馬魚移植瘤模型在新藥研發(fā)中的應用Table 3.Applications of zebrafish xenograft models in drug development

目前大部分已報道的斑馬魚藥效研究通常使用轉基因斑馬魚，通過表型實驗或異種移植實驗來評估化合物的抗腫瘤活性，可同時鑒定化合物對多種腫瘤類型的抗腫瘤作用?？鼓[瘤活性評價多采用共聚焦成像觀察腫瘤熒光強度、或將斑馬魚裂解后通過計數腫瘤細胞得到。目前在藥物研發(fā)中，應用斑馬魚模型研究的常見癌癥類型有乳腺癌、白血病、肺癌和黑色素瘤等，表明斑馬魚移植瘤模型具有出色的通用性（表1）。由于血管生成和淋巴管形成是涉及腫瘤進展和擴散的關鍵過程，而斑馬魚胚胎透明性和帶有熒光脈管系統(tǒng)的轉基因斑馬魚模型使得血管和淋巴管形成可視化，因此斑馬魚移植瘤模型常用于靶向這些分子途徑的化合物的研究、發(fā)現(xiàn)抗血管和抗淋巴管形成的活性藥物等。此外，斑馬魚模型還涉及一些與胚胎發(fā)育有關的信號傳導通路研究如TGFβ、Notch或Wnt通路等，以及細胞機制如凋亡和細胞周期調控等的研究[51-52]。

3.2 新藥開發(fā)的藥物毒性及安全性評價 美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）和歐洲藥品評估局（European Agency for the Evaluation of Medicinal Products，EMEA）也已接受斑馬魚毒性和安全性評估數據用于新藥的批準。斑馬魚的胚胎毒性試驗包括急性毒性試驗和早期生命毒性試驗。急性毒性試驗的評估標準，一個是導致胚胎死亡的半數致死濃度（50%lethal concentration，LC50）；另一個是觀察到的胚胎異常表型，如胚胎凝結、未形成體節(jié)、缺乏心跳以及尾巴未從卵黃中脫出等[53]。早期毒性測試在受精后不久開始，并在自由進食階段或生命的前30 d結束，評估指標為孵化、存活以及形態(tài)、行為和大小的異常[54]。在應用斑馬魚模型進行發(fā)育毒性和致畸評估時，通常使用12個主要觀察點（心臟、大腦、下頜、眼睛、肝臟、腸、軀干/尾巴/脊柱、肌肉/體節(jié)、身體色素沉著、循環(huán)系統(tǒng)、身體浮腫和出血）和8個次要觀察點（鰭、耳、鰾、紅細胞形成、腎囊腫、胰腺、運動性和體長）來進行藥物的評估[55]。

3.3 在臨床治療研究中的應用 2017年，F(xiàn)ior等[37]應用斑馬魚移植瘤模型篩選了晚期結直腸癌國際診療指南中的幾種主要治療方案。他們首先分析了5個傳代結直腸癌細胞系的斑馬魚移植瘤模型對兩種最常見一線化療方案FOLFOX和FOLFIRI的反應，觀察到對FOLFIRI的總體敏感性高于對FOLFOX的敏感性，與之前Sadanandam等[56]報道一致。同時，他們又用HCT116KRASG13D斑馬魚移植瘤測試了二線推薦療法西妥昔單抗的敏感性，發(fā)現(xiàn)其對HCT116KRASG13D移植瘤有效，與目前的臨床報告結果一致。他們的結果還表明，用于難治性轉移結直腸癌的三線藥物雷戈非尼在斑馬魚移植瘤中誘導凋亡并伴有腫瘤縮小，具有明顯的藥效。最后他們還運用病人來源的原代腫瘤細胞構建PDX用于FOLFOX治療，并能在五分之四的患者中預測病人術后3～6個月內有無復發(fā)。

多腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]抑制劑奧拉帕尼與DNA損傷劑替莫唑胺聯(lián)用，可有效抑制人尤文氏肉瘤的生長，并已進入II期臨床試驗[57-58]。2019年，Yan等[31]在Cell報道了利用免疫缺陷的成年斑馬魚移植瘤模型，采取口服方式，發(fā)現(xiàn)奧拉帕尼與替莫唑胺聯(lián)用能顯著抑制橫紋肌肉瘤的增殖。上述研究提示，斑馬魚移植瘤模型可用于臨床抗腫瘤藥物敏感性研究。

4 展望

動物移植瘤模型對腫瘤治療尤其是精準醫(yī)學具有重要的意義和價值。迄今研究表明，斑馬魚移植瘤是一種有用的腫瘤研究模型，尤其適用于大規(guī)?？焖俸Y選，便于研究者們盡快得到實驗結果，是對現(xiàn)有其它動物模型系統(tǒng)有價值的補充。在此基礎上，可進一步應用更高等的動物模型模仿人類體內環(huán)境，進行較長期毒性、藥效以及藥代藥動分析。腫瘤是高度異質性的疾病，而且可以不斷演化。斑馬魚移植瘤模型可快速繁殖、高通量篩選以及成本低的特點，使得應用該模型構建臨床腫瘤組織來源的移植瘤、跟蹤癌癥的異質性和不斷變化成為可能，從而幫助理解體內腫瘤生物學過程和機制，并指導臨床個性化治療。