RIP1介導(dǎo)的壞死性凋亡通過NF-κB通路調(diào)節(jié)腎小管上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)*

方曉旭，杜春陽，宋 珊，史永紅，任韞卓，段惠軍

（河北醫(yī)科大學(xué)病理教研室，河北石家莊050017）

慢性腎臟疾?。╟hronic kidney disease，CKD）的發(fā)生率持續(xù)升高，并且嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，腎臟持續(xù)的炎癥反應(yīng)與CKD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1]。壞死性凋亡（necroptosis）是細(xì)胞程序性死亡的一種新形式[2]，同時(shí)具有壞死和凋亡的特征，它是由受體相互作用蛋白（receptor-interacting protein，RIP）調(diào)控的非caspase依賴性的細(xì)胞死亡模式，其中，RIP1在壞死性凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起到了關(guān)鍵作用。在疾病等機(jī)體異常狀態(tài)下，caspase-8生成顯著增多，啟動(dòng)了機(jī)體的凋亡信號(hào)通路。Z-VAD-FMK是一種泛caspase抑制劑[3]，它可以完全抑制RIP1介導(dǎo)的procaspase-8蛋白水解活化，使機(jī)體凋亡信號(hào)通路被阻斷，進(jìn)而使凋亡轉(zhuǎn)化為壞死性凋亡。不同的刺激與壞死性凋亡有關(guān)，最具特征的是腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），TNF-α聯(lián)合Z-VAD-FMK（T/Z）是誘導(dǎo)壞死性凋亡的經(jīng)典模型[4-5]。新近研究發(fā)現(xiàn)，壞死性凋亡參與了急性胰腺炎[6]、肝炎[7]及克羅恩病[8]的炎癥反應(yīng)，但在腎小管上皮細(xì)胞中，壞死性凋亡與炎癥關(guān)系如何，目前尚不清楚。我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，壞死性凋亡抑制劑necrostatin-1（Nec-1）能夠減輕單側(cè)輸尿管梗阻小鼠的腎臟炎癥反應(yīng)[9]，提示壞死性凋亡在腎小管細(xì)胞的炎癥反應(yīng)中具有關(guān)鍵調(diào)控作用，但具體的調(diào)控機(jī)制還未明確。吡咯烷二硫代氨基甲酸銨（ammonium pyrrolidinedithiocarbamate，PDTC）是一種選擇性核因子κB（nuclear factorκB，NF-κB）抑制劑和抗氧化劑[10-11]，可以抑制許多細(xì)胞類型中NF-κB的活化，進(jìn)而抑制NF-κB通路。本研究在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用T/Z刺激體外培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞，構(gòu)建壞死性凋亡的細(xì)胞模型；進(jìn)一步用Nec-1和PDTC干預(yù)細(xì)胞，深入探討壞死性凋亡對(duì)T/Z刺激的腎小管上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的調(diào)控機(jī)制。

材料和方法

1 細(xì)胞

人腎小管上皮HK-2細(xì)胞購自美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心。低糖型DMEM培養(yǎng)基和DMEM/F12培養(yǎng)基1∶1配制，常規(guī)培養(yǎng)。分別給予HK-2細(xì)胞TNF-α（50 μg/L）、Z-VAD-FMK（50 μmol/L）、Nec-1（50 μmol/L）和PDTC（20 μmol/L）處理，于24 h后收集細(xì)胞觀察，重復(fù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)5次。

2 主要藥品與試劑

TNF-α購自 PeproTech；Z-VAD-FMK和 Nec-1購自MCE；PDTC購自Abcam；RIP1過表達(dá)質(zhì)粒由Addgene公司惠贈(zèng)；鼠源抗 RIP1、NF-κB p65、p-NF-κB p65、IκB激酶（IκB kinase，IKK）、白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和單核細(xì)胞趨化蛋白 1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）多克隆抗體購自Abcam；兔源多克隆抗caspase-3抗體購自Cell Signaling Technology；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒購自Promega；Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑盒和Opti-MEM培養(yǎng)基購自Thermo Fisher；IL-1β和MCP-1 ELISA試劑盒購自武漢六合生物公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega；Real-time PCR SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒購自TaKaRa。

3 主要方法

3.1 Western blot檢測(cè)蛋白水平 細(xì)胞用冰冷的PBS洗2遍，然后加入200 μL預(yù)冷的RIPA蛋白裂解緩沖液，冰浴30 min，用細(xì)胞刮均勻刮起細(xì)胞，收集到1.5 mL的EP管內(nèi)，4℃、12 000 r/min離心25 min，BCA法測(cè)定上清液蛋白濃度。按每孔30 μg細(xì)胞裂解蛋白上樣，SDS-PAGE分離，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上；5%脫脂奶粉37℃孵育1 h封閉PVDF膜，加入抗RIP1（1∶1 000）、caspase-3（1∶800）、IKK-α（1∶5 000）、NF-κB p65（1∶900）、p-NF-κB p65（1∶1 000）、IL-1β（1∶1 000）和MCP-1（1∶1 000）抗體，4℃過夜；室溫孵育1 h，洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠或山羊抗兔II抗（1∶5 000稀釋），37℃孵育1.5 h；洗膜后加入Pro-light HRP化學(xué)發(fā)光試劑，Odyssey Fc成像系統(tǒng)顯影，用UVP LabWorks 4.5分析軟件對(duì)Western blot條帶進(jìn)行定量分析。

3.2 乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）細(xì)胞毒性檢測(cè) HK-2細(xì)胞接種于96孔板，刺激24 h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)基上清，250×g離心4 min，分別取50 μL上清液于新的96孔板中，在各孔中加入50 μL CytoTox 96室溫避光孵育30min后，再加入50 μL終止液，用酶標(biāo)儀于490 nm波長處檢測(cè)吸光度（A）值，LDH從細(xì)胞內(nèi)的釋放量用細(xì)胞壞死百分比表示。

3.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 構(gòu)建RIP1過表達(dá)質(zhì)粒，待細(xì)胞密度60%～70%進(jìn)行轉(zhuǎn)染，準(zhǔn)備A、B兩個(gè)2 mL的EP管，A管中加入125 μL Opti-MEM培養(yǎng)基和5 μL Lipofectamine 3000 Reagent，B 管 中 加 入 125 μL Opti-MEM培養(yǎng)基、5 μL P3000 Reagent及1 μg RIP1質(zhì)粒，A、B管混勻，于細(xì)胞超凈臺(tái)上放置5 min，將混合液加入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)染6 h做后續(xù)處理。

3.4 ELISA測(cè)定 收集細(xì)胞培養(yǎng)基，1 000×g離心25 min，各取50 μL上清于ELISA板中，再在每孔中加入100 μL辣根過氧化物酶標(biāo)記的檢測(cè)抗體，密封條件下，37℃孵育60 min。棄去孔內(nèi)液體，用洗滌液重復(fù)洗5次，再向每孔中加入50 μL底物A、B，37℃避光孵育15 min。在每孔中加入50 μL終止液，在450 nm波長處測(cè)定每孔的A值。

3.5 real-time PCR TRIzol法提取細(xì)胞總RNA后按試劑盒步驟反轉(zhuǎn)錄為cDNA。實(shí)時(shí)定量PCR采用20 μL反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，cDNA 2 μL，上、下游引物各0.8 μL，ddH2O 6 μL。反應(yīng)條件為：95℃ 30 s；95℃5 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。使用3個(gè)復(fù)孔的Ct值取平均值，采用公式2-ΔΔCt計(jì)算mRNA表達(dá)的相對(duì)倍數(shù)變化。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 T/Z條件下RIP1介導(dǎo)HK-2細(xì)胞壞死性凋亡

Western blot結(jié)果顯示，T組HK-2細(xì)胞壞死性凋亡相關(guān)指標(biāo)RIP1和凋亡相關(guān)指標(biāo)cleaved caspase-3的蛋白水平均增加，T/Z組RIP1的蛋白水平進(jìn)一步增加，而cleaved caspase-3的蛋白水平降低（P＜0.01），見圖1A。LDH細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與control組相比，T組HK-2細(xì)胞壞死百分比顯著增加（P＜0.05），T/Z組細(xì)胞壞死百分比進(jìn)一步增加（P＜0.01）；與T/Z組相比，再加入Nec-1干預(yù)后（T/Z+N組）細(xì)胞壞死百分比顯著下降到（P＜0.01），見圖1B。上述結(jié)果提示T/Z可以誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞發(fā)生壞死性凋亡。

Western blot結(jié)果顯示，與control組相比，轉(zhuǎn)染RIP1過表達(dá)質(zhì)粒（RIP1+）組HK-2細(xì)胞中RIP1的蛋白表達(dá)水平明顯增高，見圖1C。轉(zhuǎn)染RIP1過表達(dá)質(zhì)粒后，T/Z條件下（T/Z+RIP1+組）的HK-2細(xì)胞壞死百分比進(jìn)一步增加（P＜0.01），見圖1D。上述結(jié)果提示RIP1介導(dǎo)了T/Z條件下HK-2細(xì)胞的壞死性凋亡。

2 T/Z條件下RIP1介導(dǎo)的壞死性凋亡對(duì)HK-2細(xì)胞IL-1β和MCP-1蛋白水平的影響

Western blot及ELISA結(jié)果顯示，與control組相比，T/Z組HK-2細(xì)胞的IL-1β和MCP-1蛋白水平增高；與T/Z組相比，Nec-1干預(yù)下調(diào)IL-1β和MCP-1的蛋白水平；反之，轉(zhuǎn)染RIP1過表達(dá)質(zhì)粒明顯上調(diào)IL-1β和MCP-1的蛋白水平（P＜0.01），見圖2。

3 T/Z條件下RIP1介導(dǎo)的壞死性凋亡對(duì)HK-2細(xì)胞NF-κB通路的影響

Western blot結(jié)果顯示，與control組相比，T/Z組HK-2細(xì)胞中NF-κB通路相關(guān)蛋白IKK-α和NF-κB p65的水平增高，同時(shí)p-NF-κB p65蛋白水平也增高，再給予Nec-1干預(yù)則上述蛋白水平降低（P＜0.01）；與T/Z組相比，轉(zhuǎn)染RIP1過表達(dá)質(zhì)粒可明顯上調(diào)HK-2細(xì)胞中上述蛋白的水平（P＜0.01），見圖3A。real-time PCR結(jié)果顯示，與control組相比，T/Z組HK-2細(xì)胞中NF-κB的mRNA表達(dá)水平增高，再給予Nec-1干預(yù)則NF-κB的mRNA表達(dá)水平下降（P＜0.01）；與T/Z組相比，轉(zhuǎn)染RIP1過表達(dá)質(zhì)?？擅黠@上調(diào)HK-2細(xì)胞中NF-κB的 mRNA表達(dá)水平（P＜0.01），見圖3B。這提示在T/Z條件下，RIP1介導(dǎo)的HK-2細(xì)胞壞死性凋亡激活了NF-κB通路。

4 T/Z條件下NF-κB通路參與RIP1介導(dǎo)的HK-2細(xì)胞炎癥

Western blot結(jié)果顯示，與control組相比，T/Z組HK-2細(xì)胞中 NF-κB 通路相關(guān)蛋白 IKK-α、NF-κB p65、p-NF-κB p65及下游分子IL-1β和MCP-1的水平增高，再給予PDTC干預(yù)后（T/Z+P組），上述蛋白水平降低（P＜0.01）；PDTC和Nec-1聯(lián)合干預(yù)HK-2細(xì)胞后（T/Z+P/N組），上述蛋白水平降低更明顯（P＜0.01），見圖4。這提示在T/Z條件下，NF-κB通路可能參與RIP1介導(dǎo)的HK-2細(xì)胞炎癥。

討 論

Figure 1.RIP1 mediated necroptosis of HK-2 cells under T/Z condition.A：Western blot was used to determine the protein levels of RIP1 and caspase-3；B：the release rate of LDH under T/Z and T/Z+N conditions；C：Western blot analysis of transfection of RIP1 over-expression plasmid in the HK-2 cells；D：the release rate of LDH in T/Z-treated cells with or without RIP1 over-expression.Mean±SD.n=5.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs T group；&&P＜0.01 vs T/Z group.圖1 T/Z條件下RIP1介導(dǎo)HK-2細(xì)胞壞死性凋亡

Figure 2.The relationship between RIP1-mediated necroptosis of HK-2 cells and inflammation under T/Z condition.A：the levels of IL-1β and MCP-1 in the supernatant were measured by ELISA；B：Western blot results showed IL-1β and MCP-1 levels in cells.Mean±SD.n=5.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；&P＜0.05，&&P＜0.01 vs T/Z group.圖2 T/Z條件下RIP1介導(dǎo)的HK-2細(xì)胞壞死性凋亡和炎癥的關(guān)系

Figure 3.The relationship between RIP1-mediated necroptosis of HK-2 cells and NF-κB pathway under T/Z conditions.A：NF-κB pathway-related proteins were determined by Western blot；B：the mRNA expression of NF-κB was detected by real-time PCR.Mean±SD.n=5.**P＜0.01 vs control group；&P＜0.05，&&P＜0.01 vs T/Z group.圖3 T/Z條件下RIP1介導(dǎo)的HK-2細(xì)胞壞死性凋亡和NF-κB通路的關(guān)系

Figure 4.NF-κB pathway was involved in RIP1-mediated HK-2 cell inflammation under T/Z condition.The protein levels of NF-κB pathway-related molecules in the HK-2 cells were detected by Western blot.Mean±SD.n=5.**P＜0.01 vs control group；&&P＜0.01 vs T/Z group；++P＜0.01 vs T/Z+P group.圖4 T/Z條件下NF-κB通路參與RIP1介導(dǎo)的HK-2細(xì)胞炎癥

壞死性凋亡是一種受調(diào)節(jié)的細(xì)胞死亡類型，其與壞死具有相似的形態(tài)學(xué)特征（早期包膜完整性破壞，細(xì)胞體積及胞內(nèi)細(xì)胞器腫脹）[2]，而壞死是一種被動(dòng)的，不受管制的細(xì)胞死亡形式。在質(zhì)膜透化后，一般FasL/TNF通過激活Fas/TNFR1死亡結(jié)構(gòu)域，相繼形成RIP1的TNFR復(fù)合體Ⅰ和TNFR復(fù)合體Ⅱ，繼而活化caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)而啟動(dòng)常規(guī)的細(xì)胞凋亡。但在此途徑中TNFR復(fù)合體Ⅱ中的RIP1會(huì)與RIP3緊密結(jié)合并相互磷酸化，活化的RIP3進(jìn)一步導(dǎo)致其底物混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白磷酸化[12]，觸發(fā)細(xì)胞通透化和細(xì)胞破壞，繼而啟動(dòng)壞死性凋亡。T/Z是經(jīng)典的壞死性凋亡模型[4-5]。Z-VAD-FMK是一個(gè)泛caspase抑制劑，TNF-α誘導(dǎo)的procaspase-8蛋白水解活化被Z-VAD-FMK完全抑制，使得RIP1的裂解減少，進(jìn)而使細(xì)胞發(fā)生壞死性凋亡。LDH是一種極為穩(wěn)定的細(xì)胞質(zhì)酶，存在于正常細(xì)胞的胞質(zhì)中，正常時(shí)不能通過細(xì)胞膜，當(dāng)細(xì)胞受損或死亡時(shí)可釋放到細(xì)胞外，所以細(xì)胞死亡數(shù)目與細(xì)胞培養(yǎng)上清中的LDH活性成正比。本研究發(fā)現(xiàn)單獨(dú)給予HK-2細(xì)胞TNF-α刺激，可以同時(shí)發(fā)生壞死性凋亡和凋亡，TNF-α和Z-VAD-FMK聯(lián)合刺激HK-2細(xì)胞，凋亡途徑受到抑制，壞死性凋亡途徑被激活；進(jìn)一步轉(zhuǎn)染RIP1過表達(dá)質(zhì)粒，T/Z+RIP1+組與T/Z組相比HK-2細(xì)胞壞死百分比顯著升高，提示T/Z條件下RIP1介導(dǎo)了HK-2細(xì)胞壞死性凋亡。

壞死性凋亡參與多種疾病炎癥的發(fā)生，如心力衰竭[13]、克羅恩病[8]、肝炎[7]、急性胰腺炎[6]、急性腎損傷[14]、順鉑治療小鼠的腎功能障礙[15]及糖尿病心肌病[16]等。本研究發(fā)現(xiàn)TNF-α和Z-VAD-FMK聯(lián)合刺激HK-2細(xì)胞后IL-1β和MCP-1的表達(dá)水平均有明顯提高，提示在T/Z條件下，RIP1介導(dǎo)的HK-2細(xì)胞壞死性凋亡的發(fā)生與炎癥有關(guān)，但壞死性凋亡調(diào)節(jié)炎癥的機(jī)制報(bào)道尚少。

Nec-1是一種有效的RIP1抑制劑[17-18]，能夠抑制RIP1的活化，并隨后阻斷壞死體的形成，最終阻斷壞死性凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)給予T/Z組HK-2細(xì)胞Nec-1干預(yù)后細(xì)胞壞死百分比顯著減少，NF-κB的mRNA表達(dá)水平下降，NF-κB通路相關(guān)蛋白IKK-α、NF-κB p65和p-NF-κB p65的蛋白水平也明顯降低，提示在T/Z條件下，RIP1介導(dǎo)的HK-2細(xì)胞壞死性凋亡激活了NF-κB通路。

PDTC是NF-κB的特異性抑制劑[10-11]，可通過抑制NF-κB p65亞單位或IκB的降解來抑制NF-κB的激活。我們進(jìn)一步給予T/Z組HK-2細(xì)胞PDTC干預(yù)，NF-κB 通路相關(guān)蛋白 IKK-α、NF-κB p65、p-NF-κB p65、IL-1β和 MCP-1的蛋白水平降低，Nec-1和PDTC聯(lián)合干預(yù)HK-2細(xì)胞，對(duì)上述指標(biāo)的抑制程度更顯著。這提示在T/Z條件下，NF-κB通路可能參與RIP1介導(dǎo)的HK-2細(xì)胞炎癥。

綜上所述，RIP1介導(dǎo)的壞死性凋亡可以誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)；NF-κB通路可能參與這一過程，抑制NF-κB通路可以減輕RIP1介導(dǎo)的壞死性凋亡引發(fā)的腎小管炎癥反應(yīng)。這些結(jié)果可為慢性腎臟疾病的治療提供新的思路。