TL1A通過調(diào)控IL-17和IFN-γ促進慢性實驗性結(jié)腸炎相關(guān)腸纖維化的發(fā)生*

尹鳳榮， 戰(zhàn)蓉蓉， 王 冬，宋 佳，李 輝，張 紅，張曉嵐

（河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院消化內(nèi)科，河北省消化病重點實驗室，河北省消化病研究所，河北石家莊050035）

腸纖維化是炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）的嚴(yán)重并發(fā)癥，持續(xù)的炎癥反應(yīng)可引起腸道黏膜反復(fù)損傷、修復(fù)，最終導(dǎo)致瘢痕形成及腸壁纖維化，腸腔狹窄或梗阻以及膿腫等并發(fā)癥，嚴(yán)重影響著患者生活質(zhì)量。而炎癥性腸病導(dǎo)致腸纖維化的機制尚未完全明確，并且目前的主要治療藥物仍然缺乏能夠有效抑制或逆轉(zhuǎn)腸纖維化的方法。腸纖維化的發(fā)生是一個復(fù)雜、動態(tài)的過程，目前認為是在易感基因基礎(chǔ)上出現(xiàn)了腸黏膜免疫失衡，釋放多種炎癥因子和生長因子激活腸道間質(zhì)細胞進而產(chǎn)生膠原等細胞外間質(zhì)（extracellular matrix，ECM）成分過度沉積，最終導(dǎo)致腸纖維化[1]。

作為腸道炎癥反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)，CD4+T細胞在調(diào)控體內(nèi)免疫應(yīng)答和維持免疫平衡穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用，其中，輔助性T細胞（T helper cells，Th）又包含Th1、Th2及Th17等3種細胞亞群。Th1細胞主要分泌干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ），而Th17細胞主要分泌白細胞介素17（interleukin-17，IL-17）。腫瘤壞死因子樣配體1A（tumor necrosis factor ligand-related molecule 1A，TL1A）可通過影響腸黏膜T細胞的活化、增殖，促進Th1細胞的極化及效應(yīng)功能，上調(diào)IFN-γ的表達，從而促進腸黏膜的炎癥反應(yīng)和纖維化的發(fā)生[2，4]。同時，TL1A還可作用于 Th17細胞使其分泌IL-17增加，導(dǎo)致腸黏膜免疫失調(diào)引發(fā)腸道炎癥反應(yīng)，而慢性炎癥反應(yīng)是腸纖維化發(fā)生的首發(fā)因素，炎癥反應(yīng)可進一步激活腸成纖維細胞的活化，產(chǎn)生大量ECM，以致腸纖維化的形成。因此，TL1A可能通過調(diào)控IL-17和IFN-γ促進慢性實驗性結(jié)腸炎相關(guān)腸纖維化的發(fā)生。

材料和方法

1 實驗動物

野生型C57BL/6小鼠，體重20～22 g，8～10周齡，清潔級，由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供（合格證編號為911102）。TL1A過表達的轉(zhuǎn)基因（LCK-CD2-TL1A-transgenic）小鼠，體重20～22 g，8～10周齡，清潔級，種鼠由美國Cedars-Sinai醫(yī)學(xué)中心IBD與免疫生物學(xué)研究中心贈予，后期由我方在層流動物實驗室飼養(yǎng)繁殖并進行鑒定。

2 主要試劑及儀器

髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）試劑盒購自南京建成生物工程研究所；ELISA試劑盒購于聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；抗CD4、IL-17和IFN-γ抗體及同型對照抗體購自BD。FACSAriaⅡ流式細胞分選儀購自碧迪醫(yī)療器械（上海）有限公司；FV12-IXCOV激光共聚焦顯微鏡購自O(shè)LYMPUS。

3 方法

3.1 動物模型的建立與實驗分組 將轉(zhuǎn)基因（transgene，Tg）小鼠與 C57BL/6野生型（wild type，WT）小鼠隨機分為DSS/WT組、DSS/Tg組、control/WT組和control/Tg組，每組6只。Control組給予飲用蒸餾水，DSS組給予間斷飲用2%DSS，分別為第1～5天、第8～12天、第15～19天、第22～26天、第27和28天，其余時間均飲用蒸餾水，第29天先應(yīng)用乙醚麻醉小鼠，然后斷頸處死小鼠。

3.2 疾病活動指數(shù)（disease activity index，DAI） 每天觀察小鼠的進食情況、體重變化、大便的性狀、精神狀態(tài)、毛發(fā)光澤程度和活動情況等。以DAI評分的標(biāo)準(zhǔn)，見表1，評估小鼠的糞便性狀，每日的體重及大便潛血情況，并記錄評分。

表1 DAI評分的標(biāo)準(zhǔn)Table 1.The DAI scoring criteria

3.3 結(jié)腸炎癥程度評估 采用HE染色觀察結(jié)腸組織學(xué)損傷，并參照Cooper等[5]評分標(biāo)準(zhǔn)，見表2進行。MPO檢測試劑盒檢測結(jié)腸組織MPO活性。

3.4 分離并提取腸黏膜固有層單個核細胞（lamina propria mononuclear cells，LPMC）及脾臟和腸系膜淋巴結(jié)（mesenteric lymph nodes，MLN）單個核細胞

3.4.1 分離提取脾臟單個核細胞 無菌環(huán)境中鈍性分離脾臟，迅速放入裝有RPMI-1640完全培養(yǎng)基（2 mL）的培養(yǎng)皿，用1 mL注射器內(nèi)芯底部研磨脾臟。用70 μm尼龍細胞濾網(wǎng)濾過細胞，應(yīng)用28 mLRPMI-1640完全培養(yǎng)基于研磨過程中沖洗細胞濾網(wǎng)和培養(yǎng)皿，最終慮至50 mL離心管。20℃、3 000 r/min離心細胞懸液10 min。棄去上清，加入2 mL紅細胞裂解液，重懸細胞，常溫靜置2 min，加入10 mL RPMI-1640完全培養(yǎng)基，20℃、3 000 r/min離心細胞懸液10 min。棄去上清，加入2 mL RPMI-1640完全培養(yǎng)基重懸細胞，計數(shù)細胞并調(diào)整濃度為2×109/L。

表2 結(jié)腸組織病理學(xué)的Cooper評分標(biāo)準(zhǔn)Table 2.Colon histopathology scoring criteria by Cooper

3.4.2 分離提取MLN單個核細胞 無菌環(huán)境中鈍性分離MLN，迅速放入裝有RPMI-1640完全培養(yǎng)基（2 mL）的培養(yǎng)皿，用1 mL注射器內(nèi)芯底部研磨MLN。用70 μm尼龍細胞濾網(wǎng)濾過細胞，用8 mL RPMI-1640完全培養(yǎng)基于研磨過程中沖洗細胞濾網(wǎng)和培養(yǎng)皿，最終慮至50 mL離心管，20℃、3 000 r/min離心細胞懸液10 min。棄去上清，加入2 mL RPMI-1640完全培養(yǎng)基重懸細胞，并計數(shù)細胞，并調(diào)整濃度為2×109/L。

3.4.3 分離提取LPMC 無菌環(huán)境取出結(jié)腸，置于放有冰冷1×PBS的培養(yǎng)皿中；應(yīng)用20 mL注射器反復(fù)沖洗腸腔糞便，移入新的放有冰冷1×PBS的培養(yǎng)皿中，進一步清除殘余脂肪組織和腸系膜。在無菌通風(fēng)操作臺中，移入新的放有冰冷1×PBS的培養(yǎng)皿中，縱向剪開腸管，轉(zhuǎn)入放有有1×HBSS的培養(yǎng)皿中，把腸管切成長3～4 cm的小段。組織移入放有20 mL預(yù)消化液的50 mL試管，放入37℃恒溫箱，低轉(zhuǎn)速（40×g）孵育20 min，孵育過程中需劇烈旋轉(zhuǎn)3次，孵育完畢棄去預(yù)消化液，應(yīng)用1×HBSS沖洗2次。組織移入放有1～2mL消化液的培養(yǎng)皿上，用刀片快速切剁成大小約1 mm×1 mm×1 mm的碎塊組織。組織移入新的50 mL離心管中，加入10 mL消化液，放入37℃恒溫箱，低轉(zhuǎn)速（40×g）孵育20 min，孵育過程中需劇烈旋轉(zhuǎn)3次。用70μm細胞濾網(wǎng)濾過細胞懸液至新的50 mL試管中，加入20 mL RPMI-1640完全培養(yǎng)基，此時細胞懸液總量30 mL。2 000 r/min離心細胞懸液5 min，小心棄去上清，1 mL 42%Percoll溶液重懸沉淀，混勻后再加入4 mL 42%Percoll溶液。用5 mL注射器輕輕把3 mL 75%Percoll溶液于細胞液底部輕輕加入，形成分界液面。2 000 r/min，離心42%/75%Percoll梯度液20 min，離心后，兩種不同Percoll液交界面上可形成LPMCs白環(huán)。界面下為破碎紅細胞形成的紅環(huán)，底層為死細胞和小片狀顆粒，最上面一層為上皮細胞。用1 mL移液槍于交界面LPMCs白環(huán)處小心收集單個核細胞2 mL，移入14 mL試管，加入RPMI-1640完全培養(yǎng)基至總體積10 mL，2 000 r/min 離心，5 min，小心棄去上清，用 500 μL RPMI-1640完全培養(yǎng)基重懸細胞，計數(shù)調(diào)整細胞濃度為2×109/L。

3.4.4 ELISA 將96孔板用濃度為0.5 mg/L的anti-CD3e包被2 h，再以2 mg/L的anti-CD28包被，各組取125 μL的2×109/L LPMC加入每孔中。將接種好的細胞在5%CO2、37℃條件下在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，然后取上清，采用ELISA法檢測，操作按試劑盒說明書進行。

3.5 流式細胞術(shù) 分離并提取脾臟和MLN單個核細胞，調(diào)整濃度為1×109/L。將單核淋巴細胞數(shù)調(diào)整濃度為1×109/L；各取1 mL，加入Cell Activation Cocktail 2 μL，37℃避光培養(yǎng) 4 h；CD16/32 1 μL 封閉，4℃、5 min；加CD4抗體室溫孵育30 min，PBS清洗后加Perm/Wash，4℃、500×g離心5 min，棄上清，重復(fù)1次；最后應(yīng)用100 μL Perm/Wash重懸細胞后加入抗IL-17和INF-γ抗體，渦旋混勻，4℃避光孵育40～50 min；加入Perm/Wash清洗，樣本流式管中分別加入500 μL的PBS重懸細胞，上機檢測。

3.6 Masson染色 包埋的結(jié)腸組織以4 μm的厚度連續(xù)切片，按以下步驟進行染色：二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫蠟至水，自來水沖洗1 min，蘇木精4 min，充分水洗，酸性麗春紅品紅10 min，充分水洗，1%磷鉬酸3 min，2%苯胺藍1 min，0.2%冰醋酸片刻，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。在光鏡下觀察腸組織的纖維化程度，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件，對結(jié)果進行定量分析，結(jié)果以平均吸光度表示。

3.7 天狼星紅染色 石蠟包埋的結(jié)腸組織以4 μm的厚度連續(xù)切片，按以下步驟進行染色：二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫蠟至水，自來水沖洗1 min，天青石藍15 min，蒸餾水充分沖洗，天狼星紅飽和苦昧酸染液10 min，蒸餾水充分沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。在光鏡下觀察腸組織的纖維化程度，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件對結(jié)果進行定量分析，結(jié)果以平均吸光度表示。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

統(tǒng)計分析采用SPSS 18.0軟件，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示計量資料數(shù)據(jù)，多組間采用單因素方差分析（one-way ANOVA）比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 TL1A促進小鼠慢性實驗性結(jié)腸炎相關(guān)腸纖維化的發(fā)生

與WT+DSS組相比，Tg+DSS組小鼠的DAI評分升高更加顯著（P＜0.05），見圖1A。TL1A加重病理學(xué)炎癥程，通過光鏡下觀察小鼠結(jié)腸組織HE染色，可見正常組小鼠的結(jié)腸黏膜上皮保持完整，且上皮、固有層、黏膜肌層構(gòu)成的腺體均排列整齊；野生型小鼠中，與control組相比，DSS組小鼠的結(jié)腸可見黏膜缺失，淺潰瘍形成，腺體被破壞或消失，杯狀細胞可見減少，黏膜及黏膜下層可見水腫，并可見中性粒細胞及淋巴細胞浸潤，病理評分進一步升高P＜0.05），見圖1C、D；MPO活性更高（P＜0.05），見圖1B。

馬松染色和天狼星紅染色觀察結(jié)腸膠原沉積的結(jié)果顯示，與DSS/WT組相比，DSS/Tg組的腸道纖維化程度更重（P＜0.05），見圖1E、F。

2 TL1A上調(diào)CD4+IFN-γ+和CD4+IL-17+T細胞的比例

免疫熒光染色法測定顯示，與DSS/WT組小鼠相比，DSS/Tg組小鼠的結(jié)腸組織中CD4+IFN-γ+和CD4+IL-17+T細胞的平均吸光度升高[IFN-γ：（115.428±13.933）U/gvs（94.562±17.030）U/g，P＜0.05；IL-17：（126.426±15.939）U/gvs（84.528±11.967）U/g，P＜0.05]，見圖2。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，MLN單個核淋巴細胞中CD4+IFN-γ+、CD4+IL-17+T細胞數(shù)的百分比明顯升高（CD4+IFN-γ+：8.04%±0.44%vs6.71%±0.26%，P＜0.05；CD4+IL-17+：5.61%±0.19%vs2.47%±0.28%，P＜0.05）；脾臟中單個核細胞中CD4+IFN-γ+和CD4+IL-17+T細胞數(shù)的百分比明顯升高（CD4+IFN-γ+：10.45%±0.66%vs7.29%±0.58%，P＜0.05；CD4+IL-17+：3.33%±0.33%vs2.10%±0.36%，P＜0.05），見圖3。

3 TL1A促進IFN-γ和IL-17的分泌

ELISA法檢測脾臟、MLN和LPMC單個核細胞分泌IFN-γ分泌水平，結(jié)果顯示，與DSS/WT組小鼠相比，DSS/Tg組小鼠的IFN-γ和分泌水平明顯升高（P＜0.05），見圖4。

討 論

目前認為，IBD相關(guān)腸纖維化的發(fā)生機制是在易感基因基礎(chǔ)上，大量炎癥細胞釋放促炎因子，引起腸道的慢性炎癥，使腸道持續(xù)處于損傷和修復(fù)并存的狀態(tài)[6]，導(dǎo)致腸壁以膠原為主的細胞外間質(zhì)（extracellular matrix，ECM）在腸組織的過度合成和異常沉積，最終形成腸纖維化，表現(xiàn)為腸狹窄或腸梗阻等嚴(yán)重的并發(fā)癥[7-8]。

TL1A是新近發(fā)現(xiàn)的一種腫瘤壞死因子家族成員，是IBD的易感基因。TL1A通過與受體DR3相結(jié)合，刺激T淋巴細胞的激活，促進Th1和Th17等細胞的活化與效應(yīng)功能，參與腸道炎癥反應(yīng)[9-10]。在對IBD患者研究中發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸LPMC的TL1A表達升高，且與炎癥的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[11]。有學(xué)者通過用抗TL1A抗體干預(yù)后，發(fā)現(xiàn)其在緩解腸道炎癥的同時減輕了纖維化程度，提示TL1A在結(jié)腸炎癥反應(yīng)中發(fā)揮了促炎促纖維化作用，且可能與抑制IFBs增殖與活化，減少膠原合成的同時增加膠原分解有關(guān)[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn)，飲用DSS后，與野生型小鼠相比，轉(zhuǎn)基因小鼠DAI和病理評分進一步升高，證明TL1A過表達促進了慢性實驗性結(jié)腸炎小鼠的腸道炎癥反應(yīng)。通過天狼星紅染色觀察DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎中腸道膠原纖維的改變，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠飲用DSS水后，與control組相比，結(jié)腸不僅僅出現(xiàn)了炎癥的改變，在黏膜及黏膜下層出現(xiàn)膠原蛋白的沉積，馬松染色、天狼星紅染色提示膠原染色的面積明顯增多，而且，轉(zhuǎn)基因小鼠病變程度更重。這表明TL1A在促進結(jié)腸發(fā)生炎癥的同時，也會促進膠原的合成與過度沉積，進而在腸纖維化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

Figure 1.Establishment of DSS-induced chronic experimental colitis-associated intestinal fibrosis model.A：DAI，consisting of weight loss，stool consistency and OB，was measured daily；B：MPO activity were expressed；C：HE staining（×100）；D：Histological score；E：Masson-staining（×200）；F：Sirius red staining（×200）.Mean±SD.n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group in WT mice.圖1 成功建立DSS誘導(dǎo)的慢性實驗性結(jié)腸炎模型

Figure 2.Immunofluorescence detection of IFN-γ and IL-17 expression in mouse intestinal tissues（×200）.A：IFN-γ expression and the position in the intestinal tissue of the mice；B：IL-17 expression and position in the intestinal tissue of the mice.圖2 免疫熒光法檢測IFN-γ和IL-17在小鼠腸組織中的定位表達

目前，研究表明，TL1A作為調(diào)控Th細胞的關(guān)鍵因子，可促進CD4+T細胞分化為Th1細胞和Th17細胞，分泌大量的促炎因子IFN-γ和IL-17，參與IBD的發(fā)生。在T細胞轉(zhuǎn)移及DSS誘導(dǎo)的慢性結(jié)腸炎小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，TL1A可通過上調(diào)腸相關(guān)淋巴樣組織中CD4+T細胞的IFN-γ和IL-17表達，增強Th1和Th17細胞的效應(yīng)功能，促進腸黏膜炎癥和纖維化發(fā)生[14-15]，研究證實，TL1A能誘導(dǎo)CD患者的腸黏膜固有層CD4+T細胞分化成為Th17細胞，IL-17分泌增加加重腸道炎癥反應(yīng)的發(fā)生；同時也可促進IFN-γ產(chǎn)生，使Th1介導(dǎo)的免疫反應(yīng)增強[16]。研究發(fā)現(xiàn)纖維性CD患者的腸活檢標(biāo)本IL-17的表達升高，并且在狹窄性CD患者中IL-17能刺激肌成纖維細胞產(chǎn)生更多的膠原[17]。因此，我們推測TL1A通過調(diào)控IL-17和IFN-γ促進慢性實驗性結(jié)腸炎相關(guān)腸纖維化的發(fā)生，參與腸纖維化的發(fā)生。

本研究通過檢測Th1和Th17細胞的百分比發(fā)現(xiàn)，與DSS/WT組小鼠相比，DSS/Tg組脾臟、MLN中CD4+IFN-γ+細胞和CD4+IL-17+細胞的百分比均明顯升高，同時IFN-γ和IL-17的分泌水平也明顯升高，表明TL1A通過促進Th1和Th17細胞的分化，進而分泌IFN-γ和IL-17增加，參與慢性實驗性結(jié)腸炎相關(guān)腸纖維化的發(fā)生。與此同時，我們通過免疫熒光法、流式細胞術(shù)及ELSIA，亦證實了在DSS組中轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠相比，TL1A促進了IFN-γ和IL-17的分泌。這表明TL1A通過上調(diào)IL-17和IFN-γ的表達，促進了慢性實驗性結(jié)腸炎相關(guān)腸纖維化的發(fā)生發(fā)展。

Figure 4.The levels of IFN-γ（A～C）and IL-17（D～E）in the supernatants of mononuclear cells from spleen（A，D）and MLN（B，E）and lamina propria（LPMC；C，F(xiàn)）were measured by ELISA.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs DSS/WT group.圖4 ELSIA法檢測IFN-γ和IL-17在小鼠脾臟、腸系膜淋巴結(jié)和腸黏膜固有層單個核細胞上清培養(yǎng)液中的表達水平

綜上所述，TL1A通過調(diào)控IL-17和IFN-γ促進慢性實驗性結(jié)腸炎相關(guān)腸纖維化的發(fā)生。