連翹酯苷A對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠免疫功能的影響*

余 亮，江惠麗，劉豪杰

（湖北省鄂州市中心醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北鄂州436000）

潰瘍性結(jié)腸炎是一種病因不明的結(jié)腸和直腸慢性非特異性炎癥性疾病，病變主要累及大腸黏膜及黏膜下層，其病程漫長(zhǎng)，常反復(fù)發(fā)作，臨床治療較為困難[1-2]。目前多認(rèn)為免疫因素在潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，免疫干預(yù)治療有顯著的臨床效果[3-4]。

連翹酯苷A（forsythiaside A，F(xiàn)A）是從木犀科植物連翹的干燥果實(shí)中提取的中藥單體，具有抗氧化、抗病毒、抗炎及免疫調(diào)節(jié)等多種生物功能[5]。研究表明[6-7]，連翹酯苷A用于治療內(nèi)毒素血癥小鼠具有顯著的免疫調(diào)節(jié)能力，并對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)起到抑制作用，表現(xiàn)出顯著的抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用。然而，連翹酯苷A在潰瘍性結(jié)腸炎中的治療效果尚未見(jiàn)報(bào)道。T淋巴細(xì)胞是機(jī)體免疫反應(yīng)的核心環(huán)節(jié)，其中CD3+、CD4+和CD8+各亞群細(xì)胞間比例失調(diào)可導(dǎo)致免疫反應(yīng)紊亂，進(jìn)而造成炎癥活動(dòng)或組織損傷，這是潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病及進(jìn)展的重要機(jī)制之一[8]。此外免疫球蛋白和補(bǔ)體水平可反應(yīng)機(jī)體免疫應(yīng)答能力。本研究通過(guò)建立潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠，從T淋巴細(xì)胞亞群、免疫球蛋白、補(bǔ)體等不同方面的免疫功能變化探討連翹酯苷A對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠免疫功能的影響及其相關(guān)機(jī)制。

材料和方法

1 動(dòng)物

60只健康清潔級(jí)SD大鼠，雌雄不限，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)為SCXK（京）2012-0001。飼養(yǎng)環(huán)境為溫度（21±2）℃，相對(duì)濕度30%～70%，光照周期12 h/12 h。

2 主要試劑

連翹酯苷A（上海士鋒生物生物科技有限公司，批號(hào)L28-120624）；2，4-二硝基氯苯（北京興福精細(xì)化學(xué)研究所，批號(hào)20070717）；戊巴比妥鈉（上海生化試劑三廠，批號(hào)84-06-12）；丙二醛（malondialdehyde，MDA）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測(cè)試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）；腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素2（interleukin-2，IL-2）和IL-4 ELISA檢測(cè)試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）；抗CD3、CD4和CD8單克隆抗體（北京同立海源生物科技有限公司）；免疫球蛋白（IgA和IgG）檢測(cè)試劑盒（中山標(biāo)佳生物科技有限公司）。

3 方法

3.1 潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型的建立 60只SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為對(duì)照組（control）和模型組（model）。模型組48只大鼠頸背部剃毛后，經(jīng)頸背部滴注2%的2，4-二硝基氯苯丙酮溶液，每天1次，1次5滴，連續(xù)滴注14 d；然后向肛內(nèi)約6 cm處結(jié)腸腔內(nèi)灌注1%的2，4-二硝基氯苯乙醇溶液，每次0.35 mL，每天1次，連續(xù)灌注4 d。對(duì)照組12只大鼠給予相應(yīng)藥物溶劑處理，飲食且與模型組相同。模型組大鼠造模后1 d出現(xiàn)不同程度飲食減少、體質(zhì)量減輕、精神萎靡、有膿血黑便、肛周及會(huì)陰部潮濕等潰瘍性結(jié)腸炎的表現(xiàn)。隨機(jī)處死對(duì)照組和模型組各2只，取結(jié)腸標(biāo)本進(jìn)行病理檢查，以確認(rèn)造模成功。

3.2 實(shí)驗(yàn)分組和給藥 于造模結(jié)束后第2天，將模型組大鼠隨機(jī)分為4組，即模型組及連翹酯苷A低劑量（low dose of FA，F(xiàn)A-L）、中劑量（middle dose of FA，F(xiàn)A-M）和高劑量（high dose of FA，F(xiàn)A-H）組，每組12只。采用灌胃給藥方式，連翹酯苷A低、中、高劑量組分別給予5 mg/kg、20 mg/kg和80 mg/kg連翹酯苷A，連續(xù)7 d。對(duì)照組和模型組給予等體積生理鹽水。

3.3 樣本采集 連翹酯苷A給藥結(jié)束后第2天，各組大鼠稱重后，給予3%戊巴比妥鈉麻醉，股靜脈取血3 mL加入EDTA-K2抗凝管中，分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）；另取3 mL于EDTA-K2抗凝管中，3 000 r/min離心20 min收集上層血清，保存于-20℃中。采血后，脫頸椎法處死大鼠，取病變結(jié)腸組織，用0.85%氯化鈉沖洗后進(jìn)行組織勻漿，保存于-80℃。另取大鼠脾臟和胸腺，除盡脂肪等組織后，稱取濕重，計(jì)算脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)。脾臟（或胸腺）指數(shù)=脾臟（或胸腺）濕重/大鼠體重×100。

3.4 指標(biāo)檢測(cè) （1）取大鼠結(jié)腸組織勻漿，采用硫代巴比妥酸反應(yīng)產(chǎn)物比色法檢測(cè)組織中MDA含量，采用氮藍(lán)四唑顯色法檢測(cè)組織中SOD活性。（2）取大鼠PBMC懸液，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD3+、CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞占總T淋巴細(xì)胞百分比，并計(jì)算CD4+/CD8+比值；采用全自動(dòng)特定蛋白分析儀（Beckman Coulter IMMAGE 800，免疫比濁法）檢測(cè)血清中的IgA和IgG水平；采用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)（Beckman Coulter UniCel Dxl 800）及其配套試劑檢測(cè)血清補(bǔ)體C3和C4水平。（3）取大鼠血清，ELISA檢測(cè)血清中TNF-α、IL-2和IL-4的含量。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 19.0分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD），兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 連翹酯苷A對(duì)各組大鼠結(jié)腸病理?yè)p傷的影響

對(duì)照組大鼠結(jié)腸黏膜固有層無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，隱窩無(wú)壞死，上皮結(jié)構(gòu)完整；與對(duì)照組比較，模型組大鼠結(jié)腸黏膜固有層伴淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，多數(shù)黏膜層出現(xiàn)隱窩膿腫、隱窩炎，表面無(wú)上皮覆蓋，結(jié)構(gòu)紊亂，形成潰瘍、萎縮等，提示造模成功；與模型組比較，連翹酯苷A各劑量組大鼠結(jié)腸組織上述病變明顯減輕，黏膜可見(jiàn)再生的黏膜上皮及腺體覆蓋，其中高劑量組效果最好，可見(jiàn)黏膜潰瘍基本痊愈，見(jiàn)圖1。

Figure 1.The effect of FA on the pathological changs of the colon tissues in each group（HE staining，×200）.圖1 連翹酯苷A對(duì)各組大鼠結(jié)腸病理?yè)p傷的影響

2 連翹酯苷A對(duì)各組大鼠免疫器官指數(shù)及結(jié)腸組織中MDA含量和SOD活性的影響

與對(duì)照組比較，模型組大鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)降低，結(jié)腸組織中MDA含量升高，SOD活性降低（P＜0.05）；與模型組比較，連翹酯苷A各劑量組大鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)呈劑量依賴性升高，結(jié)腸組織中MDA含量降低，SOD活性增強(qiáng)（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 連翹酯苷A對(duì)各組大鼠免疫器官指數(shù)及結(jié)腸組織中MDA含量和SOD活性的影響Table 1.The effect of FA on immune organ indexes and MDA content and SOD activity in the colon tissues of each group（Mean±SD.n=12）

3 連翹酯苷A對(duì)各組大鼠PBMC中CD3+、CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞水平的影響

與對(duì)照組比較，模型組大鼠PBMC中CD3+、CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞水平均降低（P＜0.05），CD4+/CD8+比值降低（P＜0.05）；與模型組比較，連翹酯苷A各劑量組大鼠PBMC中CD3+、CD4+和CD8+細(xì)胞的水平及CD4+/CD8+比值呈劑量依賴性升高（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 連翹酯苷A對(duì)各組大鼠PBMC中CD3+、CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞水平的影響Table 2.The effect of FA on the levels of CD3+，CD4+and CD8+T-lymphocytes in PBMC of rats in each group（Mean±SD.n=12）

4 連翹酯苷A對(duì)各組大鼠血清中IgA、IgG、C3和C4水平的影響

與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中IgA和IgG水平升高，C3和C4水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，連翹酯苷A各劑量組大鼠血清中IgA和IgG水平呈劑量依賴性降低（P＜0.05），C3和C4水平升高。見(jiàn)表3。

表3 連翹酯苷A對(duì)各組大鼠血清中IgA、IgG、C3和C4水平的影響Table 3.The effect of FA on serum levels of IgA，IgG，C3 and C4 in the rats（U/L.Mean±SD.n=12）

5 連翹酯苷A對(duì)各組大鼠血清中TNF-α、IL-2和IL-4含量的影響

與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中TNF-α和IL-2含量升高（P＜0.05），IL-4含量降低（P＜0.05）；與模型組比較，連翹酯苷A各劑量組大鼠血清中TNF-α和IL-2含量呈劑量依賴性降低（P＜0.05），IL-4含量呈劑量依賴性升高（P＜0.05），見(jiàn)表4。

表4 連翹酯苷A對(duì)各組大鼠血清中TNF-α、IL-2和IL-4含量的影響Table 4.The effect of FA on the serum levels of TNF-α，IL-2 and IL-4 in the rats（ng/L.Mean±SD.n=12）

討 論

潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，目前認(rèn)為在遺傳基因基礎(chǔ)上，外源性物質(zhì)感染腸道引起的異常免疫反應(yīng)是導(dǎo)致結(jié)腸炎性病變的重要原因[9]。本研究采用2，4-二硝基氯苯丙酮和 2，4-二硝基氯苯乙醇溶液建立潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型，發(fā)現(xiàn)連翹酯苷A能有效減輕結(jié)腸病變程度。脾臟和胸腺是機(jī)體重要的免疫器官。已有研究表明，潰瘍性結(jié)腸炎大鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)明顯降低，器官免疫能力降低[10]。本研究中模型組大鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)降低，與文獻(xiàn)報(bào)道一致；而經(jīng)連翹酯苷A處理后大鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)明顯升高，提示連翹酯苷A能夠促進(jìn)潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠的脾臟和胸腺發(fā)育，具有免疫調(diào)節(jié)作用，且以高劑量效果最好。

機(jī)體氧自由基過(guò)多作用于脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)，產(chǎn)生的過(guò)氧化產(chǎn)物MDA使蛋白質(zhì)變性、交聯(lián)，而損傷DNA，使酶、激素失活進(jìn)而損傷細(xì)胞及細(xì)胞膜，是潰瘍性結(jié)腸炎病情進(jìn)展的重要因素之一[11-12]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠結(jié)腸組織中MDA含量增加，SOD活性減弱，經(jīng)連翹酯苷A處理后大鼠結(jié)腸組織中MDA含量減少，SOD活性增強(qiáng)，提示連翹酯苷A能有效增強(qiáng)大鼠抗氧化能力從而抑制結(jié)腸組織中脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，減輕結(jié)腸黏膜損傷。此外。氧化應(yīng)激產(chǎn)生過(guò)量氧自由基可刺激免疫細(xì)胞，使免疫細(xì)胞功能降低，進(jìn)而影響機(jī)體免疫系統(tǒng)功能[13]。T淋巴細(xì)胞是細(xì)胞免疫反應(yīng)的重要組成部分，外周血T細(xì)胞亞群中CD4+細(xì)胞具有協(xié)助B細(xì)胞分泌抗體和調(diào)節(jié)其他T細(xì)胞免疫應(yīng)答的作用，而CD8+細(xì)胞則是主要的細(xì)胞毒效應(yīng)細(xì)胞[14]。本研究結(jié)果顯示，潰瘍性結(jié)腸炎大鼠PBMC中CD3+、CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞百分比及CD4+/CD8+比值降低，說(shuō)明潰瘍性結(jié)腸炎大鼠機(jī)體識(shí)別和殺傷毒性細(xì)胞的能力下降，細(xì)胞免疫功能處于免疫抑制狀態(tài)造成機(jī)體免疫能力下降；而經(jīng)連翹酯苷A處理后，CD3+、CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞百分比及CD4+/CD8+比值明顯升高，大鼠免疫能力逐漸恢復(fù)，提示連翹酯苷A能夠調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞亞群比例而調(diào)節(jié)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠免疫功能，其作用可能與增強(qiáng)大鼠抗氧化能力有關(guān)。

免疫球蛋白是機(jī)體免疫防御機(jī)制的另一重要組成部分。王艷等[15]報(bào)道，潰瘍性結(jié)腸炎患者血清免疫球蛋白異常變化與患者疾病活動(dòng)度和體液免疫紊亂顯著相關(guān)。但目前對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎血清免疫球蛋白變化的研究結(jié)論尚不統(tǒng)一。有報(bào)道指出，潰瘍性結(jié)腸炎患者血清IgG、IgA和IgM及補(bǔ)體C3和C4水平無(wú)明顯變化[16]；也有報(bào)道表明，潰瘍性結(jié)腸炎血清IgM水平無(wú)明顯變化，而IgG和IgA水平明顯升高[17-18]。本研究結(jié)果顯示，潰瘍性結(jié)腸炎大鼠血清中IgA和IgG水平升高，補(bǔ)體C3和C4水平降低。免疫球蛋白屬于體液免疫，IgA和IgG水平升高提示潰瘍性結(jié)腸炎大鼠體液免疫亢進(jìn)，可能是對(duì)細(xì)胞免疫功能降低的代償作用。C3和C4是補(bǔ)體系統(tǒng)的重要分子，在補(bǔ)體活化產(chǎn)生膜攻擊復(fù)合物中起重要作用，其水平降低導(dǎo)致機(jī)體吞噬作用受限制、血管通透性下降、細(xì)胞溶解作用下降等，使機(jī)體免疫力降低[19]。在本研究中，經(jīng)連翹酯苷A處理后，大鼠血清IgA和IgG水平降低，補(bǔ)體C3和C4水平升高，提示連翹酯苷A對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠免疫功能具有改善作用。

研究表明，抗炎和促炎因子分泌失衡是潰瘍性結(jié)腸炎患者腸道炎性病變的重要環(huán)節(jié)，促炎因子TNF-α和IL-2水平升高參與細(xì)胞免疫和促進(jìn)腸道炎性反應(yīng)，可造成腸道組織進(jìn)一步損傷[20-21]。此外機(jī)體清除氧自由基能力降低也是促進(jìn)炎癥發(fā)生的重要因素。IL-4是重要的抗炎因子，可以通過(guò)抑制TNF-α和IL-2及其它炎性因子產(chǎn)生、抑制巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞產(chǎn)生和移動(dòng)、增強(qiáng)SOD活性等來(lái)維持腸道免疫功能[22]。本研究結(jié)果顯示，潰瘍性結(jié)腸炎大鼠血清中TNF-α和IL-2含量升高，IL-4含量降低，而經(jīng)連翹酯苷A處理后血清TNF-α和IL-2含量明顯降低，IL-4含量明顯升高，提示連翹酯苷A可能通過(guò)促進(jìn)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠IL-4分泌，抑制促炎因子，維持腸道免疫穩(wěn)態(tài)，從而減緩病情發(fā)展。

綜上所述，連翹酯苷A能夠增強(qiáng)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠機(jī)體氧自由基清除能力，抑制炎癥反應(yīng)，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，有效減輕結(jié)腸病變。本研究為連翹酯苷A在潰瘍性結(jié)腸炎臨床治療中的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。