氯胺酮對MPTP誘導(dǎo)的帕金森病小鼠α-synuclein及星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響*

孫習(xí)文，宋俊杰，陳程哲，毛珊珊，劉 琨，王丹丹，李會芳，王 瑩，洪道先

（河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科，河南開封475000）

帕金森?。≒arkinson disease，PD）是世界上第2大神經(jīng)退行性疾病，在60歲以上的人群中發(fā)病率約為2%，其癥狀包括靜止性震顫、運(yùn)動遲緩、姿勢不穩(wěn)、抑郁等[1]。PD的特征為多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性丟失，其病理學(xué)標(biāo)志物是錯誤折疊的α-突觸核蛋白（α-synuclein）[2-3]。PD小鼠腦內(nèi)的α-synuclein不僅能通過自身神經(jīng)毒性直接損害神經(jīng)元，而且能激活星形膠質(zhì)細(xì)胞connexin 43半通道和pannexin-1通道，從而引起一氧化氮的釋放以及線粒體形態(tài)與功能的改變，造成神經(jīng)元損傷[4]。星形膠質(zhì)細(xì)胞增生是PD的另一個神經(jīng)病理學(xué)特征。PD病人的尸檢病理報告顯示，黑質(zhì)內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞的密度增加30%左右[5]；另外，在MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠腦內(nèi)也存在明顯的星形膠質(zhì)細(xì)胞增生[6]。事實上，神經(jīng)退行性疾病，如帕金森病、阿爾茨海默病及亨廷頓病都與谷氨酸能N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受體的功能障礙有關(guān)[7]；過度激活的NMDA受體產(chǎn)生興奮性毒性，導(dǎo)致相關(guān)神經(jīng)元的損傷與丟失[8]。在嚙齒類動物的研究中顯示，顱腦損傷及缺血性腦損傷時應(yīng)用NMDA受體抑制劑，能夠降低腦的損傷程度[7]；另有研究表明，抑制NMDA受體的NR2A亞單位可以緩解PD大鼠的運(yùn)動障礙[9]。地佐環(huán)平（MK-801）能夠抑制海馬神經(jīng)元突觸外NMDA受體介導(dǎo)的動作電位，從而降低興奮性毒性，減少神經(jīng)元的損傷[10]。氯胺酮（ketamine）作為一種非競爭性NMDA受體抑制劑，在亞麻醉劑量（7 mg/kg）下可抑制脂多糖誘導(dǎo)的IL-1α、IL-1β、TNF-α等炎癥介質(zhì)的釋放[11]；還有研究表明，對小鼠腹腔注射亞麻醉劑量（10～30 mg/kg）的氯胺酮，可以產(chǎn)生快速、持久、劑量依賴性的抗抑郁作用[12]。故本研究用20 mg/kg的氯胺酮干預(yù)1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP）誘導(dǎo)的小鼠，旨在探究亞麻醉劑量氯胺酮對PD小鼠α-synuclein表達(dá)及星形膠質(zhì)細(xì)胞增生的影響。

材料和方法

1 實驗動物及分組

SPF級健康雄性C57BL/6小鼠36只，鼠齡8～12周，體重22～32 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號為SCXK（京）2016-0006。飼養(yǎng)溫度（23±2）℃，自由飲食，自然光照，適應(yīng)性飼養(yǎng)2周。實驗小鼠隨機(jī)分為NaCl組（相同時間腹腔注射與MPTP組同等體積的生理鹽水）、MPTP組（腹腔注射25 mg/kg MPTP，30 min后腹腔注射與氯胺酮同等體積的生理鹽水）和ketamine組（腹腔注射25 mg/kg MPTP，30 min后腹腔注射20 mg/kg氯胺酮），每組12只。以上各組小鼠均于同一時間注射，連續(xù)注射7 d。在開始藥物注射后第15天進(jìn)行行為學(xué)測試，在第16天處死小鼠、收集樣品。

2 主要試劑

鹽酸氯胺酮注射劑購自福建古田藥業(yè)有限公司；MPTP購自Sigma；兔抗α-synuclein單克隆抗體、兔抗膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）單克隆抗體及羊抗鼠Ⅱ抗均購自Proteintech；鼠抗β-actin單克隆抗體購自康為世紀(jì)公司；HRP標(biāo)記的羊抗鼠Ⅱ抗購自Boster。

3 實驗方法

3.1 懸尾實驗（tail suspension test） 在實驗小鼠尾部后1/3處用橡皮筋固定，懸掛于儀器框內(nèi)，使其頭部向下垂，距離臺面10 cm；小鼠在企圖擺脫困境的過程中會出現(xiàn)間斷性不動，用攝像機(jī)對此過程進(jìn)行錄制，時長為5 min；然后將錄制的視頻分類并用動物行為學(xué)分析軟件SMART加以分析，統(tǒng)計小鼠的不動時間和活動度。

3.2 步態(tài)分析實驗（gait analysis test） 將前爪涂有黑色墨水、后爪涂有紅色墨水的小鼠放入墊有長8.9 cm、寬2.1 cm白色紙片的跑道中，讓其從跑道頭端向尾端自由單向爬行。爬行結(jié)束后對小鼠留下的腳印進(jìn)行記錄，連續(xù)兩個腳印點之間的距離即小鼠步距，每只小鼠測量連續(xù)3個以上步距，最后對小鼠的步距進(jìn)行統(tǒng)計分析。

3.3 小鼠腦切片的制備及免疫熒光染色 隨機(jī)從3組小鼠中各取5只小鼠，對實驗小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（10 mg/kg）進(jìn)行麻醉，接著用手術(shù)刀切開小鼠前胸，暴露心臟，在心尖處插入輸液針頭，剪開右心房，先用生理鹽水灌注15 min，再用多聚甲醛灌注2 h，待肝臟變硬后，在冰上迅速斷頭，將大腦完整取出并浸泡于4%的多聚甲醛溶液中固定24 h。調(diào)整萊卡震蕩切片機(jī)參數(shù)，將小鼠大腦切至50 μm的厚度，最后將小鼠腦切片放入防凍液中，于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆?。選取小鼠腦區(qū)切片，用0.2%Triton進(jìn)行通透，10%山羊血清室溫進(jìn)行封閉，加入兔Ⅰ抗[抗α-synuclein抗體（1∶500）和抗GFAP抗體（1∶800）]，4℃過夜，PBS漂洗，加入熒光Ⅱ抗（1∶1 500）于室溫避光孵育1 h，DAPI（1∶1 000）復(fù)染15 min。在熒光顯微鏡下（紅色標(biāo)記α-synuclein和GFAP，藍(lán)色標(biāo)記細(xì)胞核）觀察黑質(zhì)（substantia nigra，SN）、紋狀體尾殼核（caudate putamen，CP）及視皮層（visual cortex，CX）內(nèi)αsynuclein和GFAP的表達(dá)情況。

3.4 小鼠腦組織蛋白提取及Western blot實驗 隨機(jī)從3組小鼠中各取5只小鼠，腹腔注射戊巴比妥鈉（10 mg/kg）進(jìn)行麻醉，接著用手術(shù)刀切開前胸，暴露心臟，在心尖處插入輸液針頭，剪開右心房，用生理鹽水灌注30 min，待肝臟變白后，在冰上迅速斷頭并完整取出腦組織，接著進(jìn)行分區(qū)，分離出SN、CP和CX，然后在冰上勻漿裂解、離心、取上清液，于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩⑻崛〉哪X組織蛋白進(jìn)行定量后，進(jìn)行SDS-PAGE，然后電轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉液封閉1 h；加入兔Ⅰ抗[抗α-synuclein抗體（1∶1 000）、抗GFAP抗體（1∶1 500）及抗β-actin抗體（1∶2 000）]，4℃過夜，TBST漂洗，兔Ⅱ抗（1∶3 000）室溫孵育1 h，TBST再次漂洗；加ECL化學(xué)發(fā)光液，全自動多色熒光化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)對PVDF膜進(jìn)行掃描；用ImageJ軟件分析條帶吸光度。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用GraphPad Prism 8.0對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）表示。多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 氯胺酮增大PD小鼠的步距并縮短懸尾不動時間

懸尾實驗結(jié)果顯示，與NaCl組相比，MPTP組小鼠不動時間延長（P＜0.05）；而與MPTP組相比，ketamine組小鼠不動時間縮短（P＜0.01），見圖1A。步態(tài)分析實驗結(jié)果顯示，與NaCl組相比，MPTP組小鼠步距減?。≒＜0.05）；而與MPTP組相比，ketamine組小鼠步距增大（P＜0.05），見圖1B。此外，MPTP組小鼠懸尾實驗中的活動度較NaCl組低，而ketamine組小鼠的活動度較MPTP組高，見圖1C。

Figure 1.Ketamine increased the step length and shortened the duration of immobility in PD mice.A：duration of immobility in tail suspension test；B：step length in gait analysis test；C：activity level in tail suspension test.Mean±SEM.n=6.*P＜0.05 vs NaCl group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs MPTP group.圖1 氯胺酮增大PD小鼠的步距并縮短懸尾不動時間

2 氯胺酮抑制PD小鼠黑質(zhì)、紋狀體尾殼核及視皮層內(nèi)α-synuclein的表達(dá)

免疫熒光染色結(jié)果顯示，與NaCl組相比，MPTP組小鼠在SN、CP及CX內(nèi)表達(dá)α-synuclein的細(xì)胞數(shù)目顯著增多（P＜0.01）；與MPTP組相比，ketamine組小鼠表達(dá)α-synuclein的細(xì)胞數(shù)目顯著減少（P＜0.05），見圖2A。Western blot結(jié)果顯示，與NaCl組相比，MPTP組小鼠α-synuclein的表達(dá)量顯著增加（P＜0.05）；與MPTP組相比，ketamine組小鼠α-synuclein的表達(dá)量顯著減少（P＜0.05），見圖2B。

Figure 2.Ketamine inhibited the expression of α-synuclein in SN，CP and CX in PD mice.A：the expression of α-synuclein in SN，CP and CX was observed by immunofluorescence staining（scale bar=100 μm）；B：the protein expression of α-synuclein in SN，CP and CX was detected by Western blot.Mean±SEM.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01vs NaCl group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs MPTP group.圖2 氯胺酮抑制PD小鼠黑質(zhì)、紋狀體尾殼核及視皮層內(nèi)α-synuclein的表達(dá)

3 氯胺酮抑制PD小鼠黑質(zhì)、紋狀體尾殼核及視皮層內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞的增生

免疫熒光染色結(jié)果顯示，與NaCl組相比，MPTP組小鼠SN、CP及CX內(nèi)表達(dá)GFAP的細(xì)胞數(shù)目顯著增多（P＜0.05）；與MPTP組相比，ketamine組小鼠表達(dá)GFAP的細(xì)胞數(shù)目顯著減少（P＜0.05），見圖3A。Western blot結(jié)果顯示，與NaCl組相比，MPTP組小鼠SN、CP及CX內(nèi)GFAP的表達(dá)量顯著增加（P＜0.05）；與MPTP組相比，ketamine組小鼠GFAP的表達(dá)量顯著減少（P＜0.05），見圖3B。

Figure 3.Ketamine inhibited the proliferation of astrocytes in SN，CP and CX in PD mice.A：the expression of GFAP in SN，CP and CX was observed by immunofluorescence staining（scale bar=100 μm）；B：the protein expression of GFAP in SN，CP and CX was detected by Western blot.Mean±SEM.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs NaCl group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs MPTP group.圖3 氯胺酮抑制PD小鼠黑質(zhì)、紋狀體尾殼核及視皮層內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞的增生

討 論

α-synuclein具有神經(jīng)毒性，它可以在不同腦區(qū)異常聚集，從而驅(qū)動神經(jīng)元的損傷[13]；α-synuclein被認(rèn)為是PD發(fā)病機(jī)制中的主要因素[14]，因此腦內(nèi)αsynuclein的表達(dá)量是檢測PD小鼠模型的一項重要指標(biāo)。Zhu等[15]用 30 mg/kg的MPTP對小鼠腹腔注射5 d，檢測到小鼠α-synuclein的表達(dá)明顯增加。本實驗采用25 mg/kg的MPTP連續(xù)注射7 d，免疫熒光染色及Western blot結(jié)果顯示，MPTP組小鼠在SN、CP及CX內(nèi)表達(dá)α-synuclein的細(xì)胞數(shù)目及蛋白表達(dá)量均顯著增加，這表明MPTP能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生PD病理性標(biāo)志物。MPTP不僅能誘導(dǎo)產(chǎn)生α-synuclein，還會上調(diào)動物的NMDA受體結(jié)合水平[16]；并且α-synuclein損傷海馬區(qū)的學(xué)習(xí)和記憶功能也與NMDA受體的激活有關(guān)[17]。NMDA受體抑制劑可以阻斷興奮性毒性，如MK-801可以對抗MPTP的毒性，提供長達(dá)4 h的神經(jīng)保護(hù)作用[18]。本實驗免疫熒光染色結(jié)果顯示，與MPTP組相比，經(jīng)ketamine干預(yù)后的小鼠在SN、CP及CX內(nèi)表達(dá)α-synuclein的細(xì)胞數(shù)目顯著減少；Western blot結(jié)果也顯示，ketamine干預(yù)后的小鼠腦內(nèi)具有較少的α-synuclein表達(dá)量；這與王丹丹等[19]的實驗結(jié)果是一致的。這些數(shù)據(jù)說明亞麻醉劑量ketamine能夠減弱MPTP的毒性，對MPTP誘導(dǎo)的α-synuclein表達(dá)具有抑制作用。

PD小鼠的運(yùn)動功能障礙與α-synuclein的表達(dá)相一致[20]。MPTP不僅誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生α-synuclein，還誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)步距減小、懸尾不動時間延長等癥狀[21-22]。在本實驗中，注射MPTP的小鼠在步態(tài)分析實驗和懸尾實驗中步距減小、活動度降低、不動時間延長；這是因為α-synuclein及MPTP的毒性作用導(dǎo)致小鼠腦區(qū)相關(guān)神經(jīng)元的損傷，從而引起一系列的運(yùn)動癥狀[23]。懸尾實驗可以快速評估動物的抑郁情況以及抗抑郁藥物的效果[22]；在本實驗中，MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠不僅出現(xiàn)運(yùn)動障礙還出現(xiàn)了抑郁癥狀。有研究顯示，經(jīng)ketamine干預(yù)的MPTP小鼠在轉(zhuǎn)棒實驗中運(yùn)動時間延長，掉落次數(shù)減少[19]；在ketamine抗抑郁的研究中也發(fā)現(xiàn)，ketamine不僅延長小鼠在轉(zhuǎn)棒儀上的運(yùn)動時間，而且縮短小鼠的游泳不動時間，表現(xiàn)出高效、持久的抗抑郁作用[12]。本實驗顯示，與MPTP組相比，經(jīng)ketamine干預(yù)后的小鼠在步態(tài)分析實驗中步距顯著增大，這可能與ketamine抑制PD小鼠腦區(qū)α-synuclein的表達(dá)并減弱MPTP的毒性作用有關(guān)；然而在懸尾實驗中，經(jīng)ketamine干預(yù)后的小鼠活動度增加，不動時間縮短，則與ketamine的抗抑郁作用有關(guān)。

越來越多的實驗證據(jù)表明炎癥反應(yīng)、膠質(zhì)細(xì)胞激活、線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激及蛋白酶體損傷也是引發(fā)和驅(qū)動PD的關(guān)鍵機(jī)制[24-25]。PD的另一個神經(jīng)病理學(xué)特征是星形膠質(zhì)細(xì)胞增生[26]；有研究表明，在小鼠暴露MPTP第5天，星形膠質(zhì)細(xì)胞開始劇烈反應(yīng)并且比小膠質(zhì)細(xì)胞的瞬時反應(yīng)時間更短[5]。本實驗對小鼠腦區(qū)的星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行了檢測，免疫熒光染色及Western blot結(jié)果顯示，注射MPTP的小鼠SN、CP及CX內(nèi)GFAP的表達(dá)顯著增加。王鍔等[27]的細(xì)胞實驗顯示ketamine具有一定的抗炎作用，能夠抑制脂多糖誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放TNF-α。在本實驗中，與MPTP組相比，經(jīng)ketamine干預(yù)后的小鼠在SN、CP及CX內(nèi)GFAP的表達(dá)減少，說明ketamine對MPTP誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞增生有一定的抑制作用。ketamine不僅能抑制IL-1、TNF-α等炎癥介質(zhì)的釋放，還能降低內(nèi)毒素休克小鼠的死亡率[28-29]?？拱d癇和缺血性脊髓損傷的研究也表明，ketamine通過下調(diào)炎癥介質(zhì)、細(xì)胞色素C和caspase-3的表達(dá)而減少神經(jīng)元的死亡，發(fā)揮一定的神經(jīng)保護(hù)作用[30-31]。

綜上所述，本研究顯示亞麻醉劑量的氯胺酮可以抑制MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠α-synuclein表達(dá)及星形膠質(zhì)細(xì)胞增生，并緩解小鼠的運(yùn)動障礙及抑郁癥狀。這驗證了NMDA受體抑制劑氯胺酮在PD動物模型中的功效，揭示了氯胺酮具有抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞增生的作用，同時也為PD的治療提供了新的實驗依據(jù)。