富血小板血漿對(duì)兔腰背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡的影響

董晤訊，馬勇，郭楊，朱愛洪，朱亞亮，黃浩，于輝，于暉曜

作者單位：1南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院骨傷研究所，江蘇 南京210023；2常州市金壇區(qū)中醫(yī)醫(yī)院骨傷科，江蘇 常州213200

腰椎間盤突出癥是臨床上極為常見的疾病，其發(fā)病率較高[1]。近幾年，富血小板血漿（Platelet Rich Plasma，PRP）用于組織再生與修復(fù)已經(jīng)被臨床醫(yī)生和科研人員廣泛采用，主要包括組織再生和組織修復(fù)[2]。PRP是從全血中提取出來的血小板濃縮液，含有高濃度的血小板。而每個(gè)成型血小板中含有超過30種生物活性蛋白，其中大多數(shù)在組織修復(fù)中起基礎(chǔ)作用[3]。研究表明，機(jī)械性壓迫與炎癥化學(xué)性刺激是腰椎間盤突出后引起腰脊神經(jīng)根病理生理變化的重要原因[4]。本研究將兔自體髓核組織移植于腰背根神經(jīng)并結(jié)扎神經(jīng)根，制作兔腰背根神經(jīng)機(jī)械性壓迫、炎性損傷動(dòng)物模型，該模型除了能產(chǎn)生機(jī)械壓迫及脊神經(jīng)根缺血的病理改變外，還能通過自體髓核移植產(chǎn)生大量炎性因子，刺激神經(jīng)根，能較穩(wěn)定、長(zhǎng)久地產(chǎn)生神經(jīng)痛樣的改變，能較好地模擬人類腰椎間盤突出癥的發(fā)病機(jī)制。建模后觀察自體PRP干預(yù)后腰背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglion，DRG）組織學(xué)形態(tài)及細(xì)胞凋亡情況。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 研究時(shí)間為2017年10月至2018年2月，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為健康新西蘭兔48只，雌雄各半，體質(zhì)量范圍為1.5～2.0 kg，由南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供并飼養(yǎng)（動(dòng)物合格證號(hào)：201720320）。所有兔均分籠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，每日供應(yīng)足量食物和水，定期更換托盤墊料、消毒和通風(fēng)。飼養(yǎng)室溫度維持在20～25℃，濕度50%～80%，模擬晝夜照明。所有實(shí)驗(yàn)操作步驟均輕柔，避免過度刺激實(shí)驗(yàn)兔引起緊張。將實(shí)驗(yàn)兔按隨機(jī)數(shù)字表法分為治療組、對(duì)照組、假手術(shù)組，每組16只。其中造模術(shù)后由于失血過多死亡6只，依次補(bǔ)齊后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本研究符合一般動(dòng)物試驗(yàn)倫理學(xué)要求。

HE染色試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（顯色法）（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；凝血酶（Sigma公司，美國(guó)）；抗凝劑枸櫞酸鈉（南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心）。高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf）；Image Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)（Media Cybernetics公司，美國(guó)）。

1.2 PRP制備 使用10 mL無菌注射器，吸取20%枸櫞酸鈉潤(rùn)管，抽取治療組耳中動(dòng)脈血約8 mL，其中2 mL用于血小板計(jì)數(shù)，剩余6 mL置入含有枸櫞酸鈉抗凝劑的離心管內(nèi)用于制備PRP。根據(jù)Aghaloo二次離心法，首先以215 g離心10 min，吸取白膜層以上血漿置入另一離心管內(nèi)進(jìn)行二次離心，以863 g離心10 min，去除上清，留取下層約0.8 mL液體搖勻，即為PRP。取0.2 mL PRP用于血小板計(jì)數(shù)，剩余0.6 mL PRP中加入0.06 mL凝血酶（濃度1 000 U/mL，溶劑為10%氯化鈣），激活PRP以凝集成膠狀。

1.3 模型制備及實(shí)驗(yàn)方法［5］實(shí)驗(yàn)新西蘭兔采用耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉，按1 mL/kg麻醉，麻醉成功后，將兔俯臥位固定，常規(guī)碘伏消毒，鋪無菌洞巾。以腰4棘突旁開1 mm為中點(diǎn)，順棘突方向切開，切口約長(zhǎng)4 cm，沿棘突右側(cè)剝離髂棘肌并向一側(cè)分開。咬除L4、L5右側(cè)椎板、關(guān)節(jié)突和部分椎弓根。顯露右側(cè)硬脊膜及L4的右側(cè)神經(jīng)根。假手術(shù)組不作干預(yù)，治療組與對(duì)照組采用4-0鉻制腸線環(huán)扎L4背根神經(jīng)，松緊度以背根神經(jīng)略受壓變形為度。截?cái)嗤梦?，取一個(gè)椎間盤的髓核，將其移植到右側(cè)L4神經(jīng)節(jié)周圍。行相應(yīng)治療后縫合切口。

1.4 治療及觀察方法 治療組兔模型將凝膠狀PRP置于DRG周圍后縫合切口，對(duì)照組兔模型則置入等體積自體脂肪后縫合切口，假手術(shù)組不作干預(yù)縫合切口。術(shù)后3組兔均肌內(nèi)注射青霉素40萬U抗炎治療。術(shù)后分別于24、48、72、96 h 取DRG，HE 染色觀察組織學(xué)形態(tài)，TUNEL法染色，鏡下觀察并計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 DRG組織形態(tài)學(xué)觀察 測(cè)定機(jī)械刺激痛閾值后，將3組兔取出的右L4 DRG以生理鹽水沖洗后，投入4%多聚甲醛溶液中固定24 h，以備制作光鏡標(biāo)本。病理組織切片按常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片后，HE染色、脫水、透明、封片，光學(xué)顯微鏡下觀察各組織形態(tài)學(xué)變化。

1.5.2 TUNEL染色觀察DRG細(xì)胞凋亡 ①將3組DRG石蠟切片常規(guī)脫蠟、復(fù)水。②滴加3%過氧化氫1 mL，阻斷內(nèi)源性辣根過氧化物酶。③滴加0.1%TritonX-100使細(xì)胞膜的通透性增加。④PBS、雙蒸餾水沖洗。⑤標(biāo)記：滴加TUNEL反應(yīng)混合液50微升/片。⑥信號(hào)轉(zhuǎn)化和分析：加入轉(zhuǎn)化劑-POD（酶標(biāo)記抗熒光素抗體）、DAB、蘇木精復(fù)染、脫水、透明、封片。光學(xué)顯微鏡下觀察3組兔DRG細(xì)胞凋亡率，分析結(jié)果，陽(yáng)性細(xì)胞細(xì)胞核為棕黃色。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件包處理數(shù)據(jù)結(jié)果。計(jì)量資料用表示，多組多時(shí)點(diǎn)比較采用兩因素重復(fù)測(cè)量方差分析，組間精細(xì)比較為L(zhǎng)SD-t檢驗(yàn)，時(shí)間精細(xì)比較為差值t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血小板計(jì)數(shù) 兔耳中動(dòng)脈血中血小板計(jì)數(shù)為（191.93±12.50）×109/L。 PRP 中 血 小 板 計(jì) 數(shù) 為（879.06±24.70）×109/L，約為外周血的4.59倍，達(dá)有效治療濃度標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 組織形態(tài)學(xué)觀察 各組兔于術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)麻醉后，暴露結(jié)扎的DRG。術(shù)后24 h、48 h肉眼見DRG輕度水腫，與周圍組織無粘連。術(shù)后72 h、96 h肉眼觀察對(duì)照組可見DRG水腫，與周圍組織粘連；治療組DRG水腫程度較低，與周圍組織無粘連，可輕易游離DRG；假手術(shù)組未見DRG水腫。術(shù)后96 h HE染色：可見對(duì)照組、治療組細(xì)胞排列規(guī)則，細(xì)胞間隙無明顯增寬；對(duì)照組神經(jīng)元皺縮，排列欠規(guī)則，細(xì)胞間隙寬，尼氏小體變少，細(xì)胞核縮??；假手術(shù)組無明顯病理變化。

2.3 TUNEL染色觀察DRG細(xì)胞凋亡 治療組四個(gè)時(shí)間點(diǎn)，TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均低于對(duì)照組（P＜0.05）；對(duì)照組術(shù)后隨時(shí)間延長(zhǎng)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)逐漸增加（P＜0.05）；治療組與假手術(shù)組相比，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。假手術(shù)組與對(duì)照組相比，各時(shí)間點(diǎn)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 三組兔富血小板血漿對(duì)腰背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡的影響/（個(gè)，）

表1 三組兔富血小板血漿對(duì)腰背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡的影響/（個(gè)，）

注：與假手術(shù)組同時(shí)點(diǎn)比較，aP＜0.05，與對(duì)照組同時(shí)點(diǎn)比較，bP＜0.05；與組內(nèi)24 h比較，cP＜0.05

images/BZ_111_238_1663_1192_1725.png對(duì)照組治療組假手術(shù)組整體分析（HF系數(shù)）組間F值，P值時(shí)間F值，P值交互F值，P值16 16 16 21.93±2.44a 9.09±1.39ab 5.36±1.05 24.34±3.82ac 12.32±0.85abc 5.27±1.22 23.83±3.30ac 14.55±0.79abc 4.20±0.46c 27.45±1.44ac 15.29±0.98abc 4.98±0.72 0.8894 3，401.938，0.000 29.011，0.000 12.385，0.000

3 討論

細(xì)胞凋亡是由基因控制的一種程序性死亡過程，這一過程涉及有多個(gè)基因及神經(jīng)生長(zhǎng)因子的參與[6-10]。有研究發(fā)現(xiàn)脊神經(jīng)根受損后，可出現(xiàn)長(zhǎng)達(dá)數(shù)月的神經(jīng)元凋亡[11-12]。腰椎間盤突出壓迫造成神經(jīng)根損傷，可引起DRG內(nèi)細(xì)胞凋亡。本研究通過對(duì)兔背根神經(jīng)結(jié)扎加自體髓核移植，對(duì)神經(jīng)根產(chǎn)生機(jī)械性壓迫。同時(shí)破裂的髓核釋放的化學(xué)性物質(zhì)作用于神經(jīng)根產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[13]，造成神經(jīng)根損傷。在本研究各時(shí)間點(diǎn)中，對(duì)照組DRG中細(xì)胞凋亡率明顯高于假手術(shù)組（P＜0.05），表明該模型可以誘導(dǎo)DRG的神經(jīng)元凋亡。

PRP療法已經(jīng)成為增強(qiáng)組織修復(fù)和再生的潛在方法，其臨床應(yīng)用已經(jīng)擴(kuò)展到口腔科、皮膚科、眼科、骨科和運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)等專業(yè)領(lǐng)域。一項(xiàng)PRP聯(lián)合同種異體骨移植治療骨缺損的隨機(jī)臨床對(duì)照試驗(yàn)展現(xiàn)了PRP在組織修復(fù)方面的能力[14]。PRP中富含高濃度血小板，通過氯化鈣及凝血酶激活后可釋放多種生長(zhǎng)因子，其活性可持續(xù)5～8 d[15]。有研究表明，PRP中肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Hepatocyte Growth Factor，HGF）參與抗炎癥過程[16]，HGF可特異性抑制E-選擇素，進(jìn)而誘導(dǎo)抗炎細(xì)胞因子[17]；此外，HGF可通過抑制NF-κB通路的活化，來降低促炎細(xì)胞因子TNF-α基因的轉(zhuǎn)錄[18]。在小鼠皮瓣缺血再灌注損傷實(shí)驗(yàn)中，PRP可以抑制NF-κB通路及TNF-α的表達(dá)[19]。在對(duì)坐骨神經(jīng)損傷的研究中，發(fā)現(xiàn)PRP可增強(qiáng)周圍神經(jīng)修復(fù)能力，可能與PRP中的生長(zhǎng)因子參與了神經(jīng)再生過程有關(guān)[20]。在另一項(xiàng)研究中，發(fā)現(xiàn)PRP可降低Bax基因表達(dá)，進(jìn)而抑制凋亡[21]。有研究表明PRP可促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)因子（Nerve Growth Factor，NGF）表達(dá)，這對(duì)背根神經(jīng)節(jié)修復(fù)具有重要意義[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯高于治療組與假手術(shù)組（P＜0.05），提示自體PRP可以明顯抑制DRG神經(jīng)元凋亡。

據(jù)上所述，本研究結(jié)果表明，在兔神經(jīng)根壓迫及炎癥模型中，使用自體PRP治療后，可顯著降低術(shù)后96 h DRG細(xì)胞凋亡率，抑制細(xì)胞凋亡，對(duì)神經(jīng)元具有保護(hù)作用，未來通過進(jìn)一步研究，可能為椎間盤突出癥病人的治療提供新的選擇。