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    基于固相微萃取箭型-氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定銅綠微囊藻中揮發(fā)性代謝物

    2020-07-04 02:10虞銳鵬王利平趙晨凱吳勝芳宋啟軍
    分析化學(xué) 2020年6期
    關(guān)鍵詞:質(zhì)譜聯(lián)用氣相色譜

    虞銳鵬 王利平 趙晨凱 吳勝芳 宋啟軍

    摘?要?建立了頂空-固相微萃取箭型-氣相色譜-質(zhì)譜(HS-SPME Arrow-GC-MS)聯(lián)用技術(shù),結(jié)合多變量統(tǒng)計(jì)分析銅綠微囊藻在模擬自然環(huán)境條件下,其揮發(fā)性代謝物組成及變化規(guī)律。通過選取合適萃取頭,對(duì)不同時(shí)期銅綠微囊藻樣品中揮發(fā)性代謝物進(jìn)行定性分析,鑒定了210種揮發(fā)性代謝物。采用多變量統(tǒng)計(jì)分析方法,進(jìn)一步研究銅綠微囊藻生長(zhǎng)過程中揮發(fā)性代謝物的消長(zhǎng)變化規(guī)律,篩選出10種統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異代謝物:環(huán)己醇、二甲基三硫、苯甲醇、樟腦、2-甲氧基苯酚、3-己烯-1-醇、2,4-癸二烯醛、吲哚、檸檬醛和正壬醇。優(yōu)化了萃取溫度、萃取時(shí)間、體系鹽度等SPME Arrow萃取條件,篩選差異性代謝物的特征離子峰,并進(jìn)行定量分析和方法學(xué)驗(yàn)證。結(jié)果表明,10種統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異代謝物在0.050~1000 ng/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)>0.998,檢出限范圍為0.010~0.030 ng/L,回收率在76.3%~93.0%之間,RSD≤12.7%(n=6)。本方法操作簡(jiǎn)便、快速,靈敏度高,穩(wěn)定性好,可用于藍(lán)藻水華爆發(fā)初期天然水體中揮發(fā)性代謝標(biāo)志物測(cè)定。

    關(guān)鍵詞?頂空-固相微萃取箭型;氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用;多變量統(tǒng)計(jì)分析;銅綠微囊藻;揮發(fā)性代謝物

    1?引 言

    隨著湖泊流域人類活動(dòng)的加劇,大量的營(yíng)養(yǎng)鹽通過各種途徑進(jìn)入水體,造成藻過度繁殖,并于水體表面大量聚集,形成藻類水華[1]。藻類大量死亡時(shí),將細(xì)胞內(nèi)藻毒素及大量代謝物釋放到水中,嚴(yán)重惡化水質(zhì),散發(fā)異味。另一方面,藻類正常生長(zhǎng)時(shí)也會(huì)產(chǎn)生大量的揮發(fā)性有機(jī)化合物(VOCs),其作為信號(hào)物質(zhì)在水域生態(tài)系統(tǒng)中進(jìn)行信息傳遞,或有利于釋放者在激烈的競(jìng)爭(zhēng)環(huán)境中生存與繁衍[2,3]。藻類VOCs主要為醇類、醛類、酯類、萜類、硫化合物和脂肪族烴[4]。因?yàn)闃O低的氣味閾值和令人討厭的泥土味/霉味,水體中的2-甲基異莰醇和土臭素被廣泛檢測(cè)[5];萜類VOCs因同時(shí)具有提高藻細(xì)胞抵抗逆境脅迫的能力和化感抑制作用,有利于藻細(xì)胞在逆境脅迫中生存和繁殖,并能有效抑制其它水生生物生長(zhǎng)[6];烷基硫化物與藻體死亡的關(guān)系[7]等一系列揮發(fā)性代謝物對(duì)環(huán)境影響的研究備受關(guān)注。如何將水華預(yù)警指標(biāo)細(xì)化,將藻類生長(zhǎng)繁殖過程中產(chǎn)生的代謝物同傳統(tǒng)水體表征指標(biāo)相結(jié)合,建立合理評(píng)價(jià)指標(biāo)及水華預(yù)測(cè)模型,是需要研究者深入探索的方向。

    固相微萃取(SPME)技術(shù),作為水蒸汽蒸餾的替代和補(bǔ)充工具,用于富集揮發(fā)性有機(jī)化合物,已成為環(huán)境、食品和臨床分析中廣泛使用的萃取技術(shù)之一[8,9]。SPME具有省時(shí)、高效、不需要使用溶劑和具有一定特異性吸附等特性,但也存在機(jī)械穩(wěn)定性差、萃取頭吸附相體積小等缺點(diǎn)。固相微萃取箭型(SPME Arrow)作為固相微萃取領(lǐng)域的一項(xiàng)新技術(shù),其頂部采用更好的保護(hù)吸附材料,易于穿刺,具有富集效率高、再現(xiàn)性好、自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)。Helin等[10]采用頂空SPME Arrow測(cè)定環(huán)境空氣和廢水中揮發(fā)性低分子量烷基胺。Kremser等[11]將SPME Arrow直接浸泡在實(shí)驗(yàn)室水和地下水中提取多環(huán)芳烴,方法檢出限可達(dá)50 ng/L;與傳統(tǒng)的SPME纖維頭和攪拌棒吸附萃?。⊿BSE)相比,萃取率更高。Castro等[12]將SPME Arrow應(yīng)用于魚類樣品中人工合成麝香的檢測(cè),在這種復(fù)雜基質(zhì)中檢出限達(dá)到0.5 ng/g。

    針對(duì)我國有害藍(lán)藻水華優(yōu)勢(shì)藻種中揮發(fā)性有機(jī)化合物復(fù)雜和低含量的特點(diǎn),本研究采用HS-SPME Arrow GC-MS聯(lián)用技術(shù),對(duì)不同生長(zhǎng)時(shí)期的銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa,M. aeruginosa)樣進(jìn)行分析,采用多變量統(tǒng)計(jì)分析方法,研究其揮發(fā)性代謝物的消長(zhǎng)變化規(guī)律,篩選出10種統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異代謝物,建立了主要代謝物的高靈敏度定量分析方法,為評(píng)價(jià)水環(huán)境質(zhì)量和藻水華預(yù)警預(yù)報(bào)提供了一種可靠的監(jiān)測(cè)手段。

    2?實(shí)驗(yàn)部分

    2.1?儀器與試劑

    LECO Pegasus BT氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀系統(tǒng)(美國LECO公司);PAL RTC 自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)及孵化爐和加熱攪拌模塊(瑞士CTC Analytics AG公司);固相微萃取頭: 120 μm divinylbenzene/carboxen/polydimethyl-?siloxane (DVB/CAR/PDMS)、120 μm DVB/PDMS、120 μm CAR/PDMS、100 μm PDMS、100 μm Polyacrylate(PAL SPME Arrow,瑞士CTC Analytics AG公司);50/30 μm DVB/CAR/PDMS (SPME,美國Supelco公司);Milli-Q Direct 8純水儀(美國Millipore公司);20 mL頂空瓶(德國Gerstel公司) 。

    內(nèi)標(biāo): 氘代吡啶(99.5%,德國Dr公司);NaCl(優(yōu)級(jí)純,在450℃烘干6 h 后使用);甲醇(色譜純,美國天地公司);其它化學(xué)品 (純度≥98%)購于安譜公司。

    混合標(biāo)準(zhǔn)溶液: 配制濃度為10 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)物(環(huán)己醇、 二甲基三硫、 苯甲醇、 樟腦、 2-甲氧基苯酚、 3-己烯-1-醇、 檸檬醛、 2,4-癸二烯醛、 吲哚、 正壬醇)儲(chǔ)備液,用甲醇逐級(jí)稀釋成10 μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液。頂空標(biāo)準(zhǔn)混合溶液: 向純水中添加適量標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)物,配制成濃度分別為1、 10、 100和1000 ng/L含有10 ng/L內(nèi)標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液。

    2.2?樣品前處理方法

    藻樣采集: 2018年 5月在太湖梅梁灣采集銅綠微囊藻,并經(jīng)顯微鏡觀察、鑒定。將藻水樣放入光照培養(yǎng)箱培養(yǎng): 溫度25℃,光照強(qiáng)度6000 Linux,光暗比12 h∶12 h,擴(kuò)大培養(yǎng)7 d,到達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的純?cè)褰臃N。顯微鏡每日觀察藻類生長(zhǎng)狀況。樣品每隔一日采集: 分別為A、B、C、D、E、F、G 7個(gè)實(shí)驗(yàn)組(后同)。每組各取6個(gè)平行樣,迅速液氮冷凍,80℃保存。進(jìn)樣前,在25℃恒溫水浴中單獨(dú)解凍10 min,恢復(fù)到室溫[13]。質(zhì)量控制(QC) 樣品制備: 將所有樣品取等體積混勻后,按照上述方法進(jìn)行相同處理,得到QC樣品。

    水樣采集及處理: 于水體表面0.5 m下采集,藻密度: 1.0×106~8.0×106/L,過0.45 μm 濾膜后,于20℃保存。

    2.3?固相微萃取方法

    在頂空瓶?jī)?nèi)加入8 mL藻水樣。進(jìn)樣模式: SPME Arrow;萃取溫度30℃;萃取時(shí)間30 min;解析時(shí)間3 min;解析溫度250℃;老化時(shí)間3 min。

    2.4?GC-MS分析條件

    安捷倫7890B氣相色譜條件:DB-5 MS色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。程序升溫:初始溫度40℃,保持2 min;以10℃/min升至250℃,保持6 min。傳輸線溫度: 280℃;離子源溫度: 210℃;質(zhì)量掃描范圍: 33~400 amu;載氣He(99.999%),恒流模式,流速: 1.0 mL/min;不分流進(jìn)樣。隨機(jī)安排樣本進(jìn)行順序,每隔8個(gè)樣品加入1個(gè)QC樣品檢測(cè)。

    2.5?數(shù)據(jù)處理

    化合物定性分析: 經(jīng)LECO軟件自動(dòng)解卷積處理總離子流圖。經(jīng)NIST2014和Wiley9譜庫相匹配,要求正反匹配度均大于800(最大值為1000)。在相同色譜條件下,利用正構(gòu)烷烴(C6~C26) 計(jì)算保留指數(shù),同譜庫標(biāo)準(zhǔn)值檢索對(duì)比。采用峰面積歸一化法計(jì)算化合物的相對(duì)含量。

    差異性代謝物定量分析: 利用內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法對(duì)篩選得到的差異代謝物進(jìn)行定量分析。

    2.6?多元統(tǒng)計(jì)分析

    采用 SIMCA-P 15.0、Metabo Analyst 4.0對(duì)數(shù)據(jù)集進(jìn)行主成分分析(Principal component analysis,PCA)、偏最小二乘判別分析(Partial least squares-discriminant analysis,PLS-DA)、層次聚類和變量排序等多元分析,并使用置換策略進(jìn)行了模型評(píng)估。

    3?結(jié)果與討論

    3.1?差異代謝物的篩選

    3.1.1纖維涂層選擇?選用不同萃取纖維涂層分別萃取銅綠微囊藻樣品(不同時(shí)期藻樣等量混勻)3次??疾炝?種SPME Arrow萃取頭對(duì)銅綠微囊藻揮發(fā)性有機(jī)物的影響(圖1中A~E),以出峰個(gè)數(shù)和總峰面積作為萃取能力的主要考察指標(biāo)。結(jié)果表明,選擇DVB/CAR/PDMS萃取頭時(shí)目標(biāo)物萃取效率最高,出峰數(shù)量最大,總峰面積是其它4種萃取頭的1.62~8.50倍。DVB/CAR/PDMS外層是PDMS/DVB,內(nèi)層是CAR/PDMS,具有分子篩選能力。小分子先通過DVB涂層,吸附于內(nèi)層CAR上,而大分子則被吸附于外層DVB表面[14],能兼顧各類化合物,對(duì)復(fù)雜天然揮發(fā)性有機(jī)化合物有更大的優(yōu)勢(shì)。其它4種涂層對(duì)分子的大小、極性強(qiáng)弱各有偏重,不適于本研究中種類復(fù)雜、變化差異大的藻類代謝物。后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用DVB/CAR/PDMS。

    萃取相同銅綠微囊藻樣品,SPME Arrow是普通SPME(兩者均為DVB/CAR/PDMS) 的1.32和1.80倍(圖中1A和F)。SPME Arrow吸附相具有更大的表面積和體積,靈敏度更高,適合痕量有機(jī)物的富集。

    3.1.2?穩(wěn)定性評(píng)估?為了考察分析方法的穩(wěn)定性,待色譜條件穩(wěn)定后,在GC-MS分析序列中每隔8個(gè)樣本加入1個(gè)QC樣品。對(duì)QC樣品進(jìn)行PCA分析(圖2),所有QC樣品均在2倍標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)范圍內(nèi),說明本方法重復(fù)性好,能夠滿足代謝組學(xué)的分析要求。

    實(shí)驗(yàn)過程中確保實(shí)驗(yàn)條件一致,包括藻的培養(yǎng)、留取樣品、低溫保存、快速解凍、SPME Arrow吸附濃縮、GC/MS進(jìn)樣及分離檢測(cè)。結(jié)果表明,GC-MS總離子流圖中95%以上的共有峰峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于15%,說明本分析方法可靠、穩(wěn)定,能確保不同樣本之間的差別不是由分析方法的誤差產(chǎn)生,而是主要來自樣本本身的差異。

    化合物定性處理后,共鑒定出210種代謝物,用于進(jìn)一步的多元統(tǒng)計(jì)分析,其中包括醇類28種、醛類23種、酮類27種、酯類24種、萜烯類19種、脂肪族烴36種、硫化物11種、芳香族化合物16種。在生長(zhǎng)中期檢測(cè)到己醛和己醇,通常認(rèn)為此類C6綠色揮發(fā)物(C6 green leaf volatiles)僅在高等植物受損傷時(shí)釋放[15]。

    3.1.3?PCA模型和PLS-DA模型?PCA作為非監(jiān)督統(tǒng)計(jì)方法,用于查看樣本之間的分布趨勢(shì)。對(duì)HS-SPME Arrow-GC-MS 采集得到的不同生長(zhǎng)時(shí)期銅綠微囊藻數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA,圖 3為PCA模型的可視化得分圖。由PCA結(jié)果可知,A、B與C組離得更近,D、E、F和G組離得更近,代謝輪廓存在重疊,后4組明顯偏離前3組,表明銅綠微囊藻在第四生長(zhǎng)時(shí)期時(shí)生長(zhǎng)代謝出現(xiàn)明顯變化。然而,第一和第二主成分只貢獻(xiàn)了總變異的 32.3%,主要是所選擇的7個(gè)不同生長(zhǎng)周期的銅綠微囊藻產(chǎn)生的揮發(fā)性化合物種類變異復(fù)雜。因此,不能僅用簡(jiǎn)單降維處理的樣品代替整個(gè)樣品,需更多的分析以佐證銅綠微囊藻揮發(fā)性成分的變化規(guī)律。

    PLS-DA作為有監(jiān)督的方法,用于多類分類判別分析時(shí)性能穩(wěn)健,可以減少變量間多重共線性產(chǎn)生的影響。圖4顯示PLS-DA模型變量投影重要度(Variable importance projection,VIP)值大于1.5,并結(jié)合t檢驗(yàn)的p值(閾值≤0.05)獲得差異性化合物30種,R2=0.983,Q2=0.936,用R2和Q2交叉驗(yàn)證評(píng)價(jià),說明此擬合質(zhì)量佳,可用于輔助標(biāo)志代謝物的篩選。

    3.1.4?熱圖分析?使用熱圖對(duì)7個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間的相關(guān)性進(jìn)行了分析。圖 5展示的是前30個(gè)皮爾遜分層聚類 p<0.05的代謝物,p值的計(jì)算使用單因素方差分析(One-way ANOVA)。紅色表示較高的強(qiáng)度,黑色表示中等強(qiáng)度,綠色表示較低強(qiáng)度。在不同生長(zhǎng)階段,各類揮發(fā)性成分的釋放規(guī)律不同;2,4-癸二烯醛、檸檬醛和2-甲氧基苯酚在初期達(dá)到最大值,隨著生長(zhǎng)呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì);3-己烯-1-醇和2,4-二噻戊烷濃度由低到高,又逐漸降低;而二甲基三硫、丙酮、苯甲醇、3-甲基吲哚和辛醛的濃度則持續(xù)穩(wěn)步升高。聚類熱圖分析顯示,實(shí)驗(yàn)組A、B、C接近,而實(shí)驗(yàn)組D、E、F、G更為接近,同PCA結(jié)論一致。

    對(duì)于多組分析,于Anova前50種化合物 (f>10,p<0.01),結(jié)合PLS-DA統(tǒng)計(jì)結(jié)果,從其中篩選出10種統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異代謝物: 環(huán)己醇、二甲基三硫、苯甲醇、樟腦、2-甲氧基苯酚、3-己烯-1-醇、2,4-癸二烯醛、吲哚、檸檬醛和正壬醇,加以關(guān)注。

    3.2?差異代謝物的定量分析

    SPME Arrow相比以往的SPME具有更大的表面積和靈敏度,樣品通量提高2倍以上,萃取速度更快。 為使其快速、高效富集目標(biāo)物,并確保萃取穩(wěn)定性,需對(duì)萃取條件進(jìn)行優(yōu)化[16]。

    3.2.1?空白實(shí)驗(yàn)

    針對(duì)銅綠微囊藻揮發(fā)性代謝物分析中樣品前處理、測(cè)定等環(huán)節(jié)可能受到的污染,干凈頂空瓶需保持在120℃烘干1 h。SPME Arrow進(jìn)樣后,保持250℃下解析3 min使樣品完全進(jìn)入儀器。為盡量減少殘留,可適當(dāng)提高溫度,繼續(xù)老化3 min。以純水作為空白,進(jìn)行HS-SPME Arrow-GC-MS進(jìn)樣分析。結(jié)果表明,10種差異代謝物均未檢出,滿足分析要求。

    3.2.2?萃取溫度?提高萃取溫度可以減少達(dá)到平衡所需的時(shí)間。然而溫度對(duì)萃取具有動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)雙重影響: 溫度升高,分析物擴(kuò)散速度加快,有利于縮短衡時(shí)間[17];另一方面,升溫使分析物在涂層和樣品中的分配系數(shù)減小,靈敏度降低??疾炝?種溫度(25℃、30℃和35℃)的影響。由圖6可見,隨著溫度從25℃增加到30℃,萃取效率明顯增加,而繼續(xù)增加到35℃,萃取效率升高幅度不大,樟腦和2,4-癸二烯醛略有降低。 特別是濃度最高的二甲基三硫,隨溫度升高,萃取效率持續(xù)降低。這主要是因其極易揮發(fā),溫度升高會(huì)導(dǎo)致其在涂層的分配系數(shù)降低。另一方面,為了避免溫度高于35℃時(shí)分析物發(fā)生分解和相互轉(zhuǎn)化的可能性,選擇萃取溫度為30℃(注: 二甲基三硫、2-甲氧基苯酚、2,4-癸二烯醛和吲哚實(shí)際量為圖中所示10倍,下同)。

    3.2.3?萃取時(shí)間和鹽分的影響?SPME Arrow基于待測(cè)物在涂層和樣品基質(zhì)間分配平衡。理想情況下,應(yīng)在選擇提取時(shí)間內(nèi)使所有分析物達(dá)到平衡。

    然而,沸點(diǎn)較高、非極性和弱極性的分析物,平衡時(shí)間較長(zhǎng),而且樣品中共存組分存在競(jìng)爭(zhēng)吸附,故可選取在非平衡態(tài)下較短的時(shí)間內(nèi)萃取。萃取時(shí)間對(duì)萃取效率影響如圖7所示,30 min后,萃取效率不再明顯提高。本研究選擇萃取時(shí)間為30 min,以期達(dá)到萃取效率和萃取時(shí)間的最佳結(jié)合。

    除萃取時(shí)間、溫度必須嚴(yán)格控制,確保良好的精密度外,體系鹽度也是影響SPME Arrow萃取效率的因素。鹽析作用可降低疏水物質(zhì)在水中的溶解度,增加其在頂空中的含量,提高靈敏度。但鹽度過大,可能會(huì)增加溶液的粘稠度,延長(zhǎng)達(dá)到平衡的時(shí)間[18]??疾炝他}度對(duì)SPME Arrow 萃取效率的影響。平行量取 8 mL 水樣,分別加入0、0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 g NaCl,發(fā)現(xiàn)在加入2.0 g NaCl時(shí)萃取量最大,但總萃取量?jī)H增長(zhǎng)小于15%,說明鹽析效應(yīng)對(duì)這10種化合物萃取效率不顯著。本實(shí)驗(yàn)選擇不添加NaCl。

    3.3?線性范圍、檢出限和精密度

    配制濃度分別為1、10、100、1000 ng/L的系列頂空標(biāo)準(zhǔn)混合溶液,在上述優(yōu)化條件下進(jìn)行測(cè)定,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。各目標(biāo)化合物在0.050~1000 ng/L 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。檢出限(LOD)以3倍信噪比(S/N) 計(jì)算,采用本方法對(duì)濃度為 100 ng/L 的混標(biāo)樣品進(jìn)行 6次平行測(cè)試,日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于7.1%,日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于12.7%。本方法的線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限見表1。

    3.4?實(shí)際樣品分析

    采用本方法對(duì)太湖梅梁灣表層水源水進(jìn)行測(cè)定。2019年4月水樣中銅綠微囊藻密度為1.0×106/L,各化合物濃度如表2所示,加標(biāo)回收率在 76.3%~93.0%之間,表明基質(zhì)對(duì)本方法的影響較小,本方法可用于實(shí)際水樣的測(cè)定。6周后,在同一水域采樣,藻密度為8.0×106/L,3-己烯-1-醇、環(huán)己醇、正壬醇、二甲基三硫、吲哚濃度明顯增高,提高了15~230倍。此時(shí)水體尚未達(dá)到輕度水華。后續(xù)研究中,可以采用本方法監(jiān)測(cè)藻類代謝物的組成及濃度變化,為建立藻類水華預(yù)測(cè)模型提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

    4?結(jié) 論

    建立了頂空-固相微萃取箭型-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),測(cè)定不同時(shí)期銅綠微囊藻中揮發(fā)性代謝物。結(jié)合多變量統(tǒng)計(jì)分析方法,篩選出10種統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異代謝物并定量分析,此方法簡(jiǎn)便、快捷、可自動(dòng)化運(yùn)行,結(jié)果準(zhǔn)確,為研究藻類代謝物的變化規(guī)律和藻類水華預(yù)警預(yù)報(bào)提供了可靠的監(jiān)測(cè)手段。

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