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    石墨相氮化碳光誘導活化辣根過氧化物酶及其比色免疫分析應用

    2020-07-04 02:10:27張嵐李小琴王光麗
    分析化學 2020年6期
    關鍵詞:活化

    張嵐 李小琴 王光麗

    摘?要?基于石墨相氮化碳(g-C3N4)在可見光(≥ 400 nm)照射下可激活辣根過氧化物酶(HRP),使HRP能夠催化氧化特征底物3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB),設計了一種新型夾心型免疫傳感器,用于高靈敏檢測甲胎蛋白(AFP)。此夾心型免疫傳感器利用附著于微孔板上的一抗(Ab1)捕獲目標物AFP,然后與HRP和二抗(Ab2)共同標記的金納米顆粒(Ab2-AuNPs-HRP)反應,并結(jié)合酰胺放大技術(TSA),增大表面固定的HRP的量,實現(xiàn)信號放大。加入g-C3N4后,在可見光照射下,HRP的活性被激發(fā),TMB被氧化后的信號(即652 nm處的吸光度)與AFP的濃度在0.5 pg/mL~0.1 μg/mL范圍內(nèi)呈線性關系,檢出限(LOD,S/N=3)為0.17 pg/mL。 本研究構(gòu)建的新型免疫傳感器具有靈敏度高、選擇性好、使用方便等優(yōu)點,在實際樣品測定中具有潛在的應用價值。

    關鍵詞?石墨相氮化碳;辣根過氧化物酶;活化;免疫分析

    1?引 言

    天然酶具有活性高、選擇性和特異性好等優(yōu)勢,在生物分析中應用廣泛。辣根過氧化物酶(HRP)是一種含亞鐵血紅素的蛋白質(zhì),具有性質(zhì)穩(wěn)定、比活性高、分子量小、容易制備等優(yōu)點,在催化和分析檢測等領域具有重要應用。通常利用H2O2以及濃H2SO4進行HRP活性的調(diào)控,由于使用了腐蝕性的化學試劑,因此操作不便,且對環(huán)境有污染。最近,利用納米材料調(diào)控天然酶活性的研究備受關注。Fruk等[1]發(fā)現(xiàn)紫外光照射的CdS量子點可引發(fā)HRP的催化活性,氧化其熒光底物(中性紅);Kamda等[2,3]發(fā)現(xiàn)在紫外光或可見光激發(fā)下,鐵摻雜的鈦酸鹽及鉑摻雜的赤鐵礦固體薄膜可激發(fā)并調(diào)控HRP的活性。最近,本研究組[4,5]發(fā)現(xiàn)鄰苯二酚類化合物(如鄰苯二酚、多巴)與二氧化鈦納米粒子結(jié)合后,在可見光激發(fā)下,也可活化HRP,氧化其特征底物3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)。研究發(fā)現(xiàn),在光照下,納米材料可產(chǎn)生多種活性成分,如超氧陰離子(O·2)、空穴(h+)和羥基自由基(·OH)等,進而活化天然酶HRP,使其在無H2O2存在條件下也表現(xiàn)出較高的催化活性。利用光照后的納米材料調(diào)控HRP催化活性的體系,可方便地通過調(diào)控光照的有無實時調(diào)控酶活性。光激發(fā)納米材料為調(diào)控天然酶活性提供了一種簡單方便、無需加入破壞性化學試劑的新途徑。但是,已報道的可調(diào)控HRP活性的納米材料仍十分有限,部分納米材料本身有毒性,而且有的材料需在紫外光下激發(fā),但紫外光本身會導致HRP失活。因此,能夠較好調(diào)控HRP活性的納米材料,尤其是對納米材料活化HRP體系的生物傳感應用研究仍需進一步探索。

    石墨相氮化碳(g-C3N4)是一種生物相容性好、毒性低的無金屬半導體材料,具有優(yōu)異的熒光、光電轉(zhuǎn)換、光催化等性質(zhì)[6~8]。AFP是一種重要的臨床腫瘤標志物,廣泛應用于肝細胞肝癌和卵黃囊腫瘤的診斷,在胎兒缺陷和腫瘤(尤其是肝臟腫瘤)的臨床診斷中具有重要作用[9]。 本研究發(fā)現(xiàn),在可見光照射下,所合成的g-C3N4納米片可活化HRP催化氧化底物TMB,產(chǎn)生較強的特征吸收信號。以甲胎蛋白(AFP)為模型物,在光照條件下,將g-C3N4納米片活化HRP與酰胺放大技術(TSA)結(jié)合,建立了一種比色檢測AFP的方法。研究結(jié)果表明,本方法具有簡單方便、檢測線性范圍寬、靈敏度高等優(yōu)點。

    2?實驗部分

    2.1?儀器與試劑

    Hitachi S-4800掃描電子顯微鏡(日本Hitachi公司);D8型X射線衍射儀(德國布魯克公司);FT-IR 6700光譜儀(美國Thermo Fisher公司);拉曼光譜儀(英國Renishaw公司);TU-1901分光光度計(北京普析通用儀器有限公司);熒光分光光度計(美國Varian公司);CELS5001350氙燈光源(北京中教金源科技有限公司);酶標儀(美國SpectraMax M5公司);CHI 800C型電化學工作站(上海辰華儀器有限公司)。

    癌胚抗原(CEA)、前列腺抗原(PSA)和甲胎蛋白(AFP)購自北京久峰潤達生物技術公司;超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和HRP購自美國Sigma-Aldrich公司;叔丁醇(TBA)、異丙醇(IPA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、碘化鉀(KI)、3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、鼠來源AFP抗體對(一抗Ab1、二抗Ab2)、N-羥基丁二酰亞胺(NHS)、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺(EDC)、牛血清白蛋白(BSA)、N-2-羥乙基哌嗪-N'-(2-乙磺酸)、酪胺、吐溫-20、色氨酸(Trp)、丙氨酸(Ala)和人血清白蛋白(HSA)均購自國藥集團化學試劑有限公司。血清樣本來源于江南大學校醫(yī)院。

    2.2?g-C3N4納米片的合成

    參照文獻[10]的方法,稱取10.0 g三聚氰胺(C3N6H6)置于陶瓷坩堝中,在馬弗爐中,以3℃/min加熱至550℃,保持2 h,得到黃色的固體產(chǎn)物。研磨后,稱取40 mg粉末于40 mL水中,超聲10 h,懸浮液以5000 r/min離心15 min,得到g-C3N4納米片。

    2.3?g-C3N4光誘導活化HRP性質(zhì)的探究

    2.3.1?g-C3N4光誘導活化HRP?取50 μL 200 μg/mL g-C3N4和一定濃度的HRP于200 μL HAc-NaAc緩沖溶液(0.4 mol/L,pH 3.0)中,超聲10 min,使g-C3N4分散。加入500 μmol/L TMB,用水稀釋至1.0 mL,溶液混合均勻后,放置于氙燈(≥ 400 nm)下照射15 min,測定652 nm處的吸光度。

    2.3.2?g-C3N4光誘導活化HRP體系的催化動力學研究?在30℃下,將50 μL 200 μg/mL g-C3N4和100 μg/mL HRP加入200 μL HAc-NaAc緩沖溶液(0.4 mol/L,pH 3.0)中,再加入不同濃度的TMB溶液,用水稀釋至1.0 mL,混合均勻,以TMB為底物,基于米氏方程計算反應動力學參數(shù)。在可見光照射下,每隔1 min測量652 nm處的吸光度,研究反應的動力學性質(zhì)。

    2.4?基于光誘導g-C3N4活化HRP免疫檢測AFP

    2.4.1?HRP/AuNPs/Ab2復合物的合成?參照文獻[11]的方法,采用檸檬酸三鈉還原HAuCl4合成金納米粒子(AuNPs)。將AFP二抗(Ab2)和HRP共同固定在AuNPs上,獲得HRP/AuNPs/Ab2復合物,合成步驟參照文獻[12]: (1)用0.1 mol/L Na2CO3調(diào)節(jié)AuNPs溶液至pH 8~9;(2)取40 μL 100 μg/mL Ab2和160 μL 100 μg/mL HRP加入到1.0 mL AuNPs(Ab2和HRP的濃度為最佳比例)中,混合溶液在4℃下孵育12 h;(3)將混合溶液以12000 r/min離心20 min,移除過量的Ab2和HRP,HRP/AuNPs/Ab2復合物超聲后,重新分散在1.0 mL PBS緩沖溶液(pH=7.4,含1.0%(w/w)BSA)中,于4℃避光儲存。

    2.4.2?HRP/酪胺復合物的合成?參照文獻[12]的方法合成HRP/酪胺復合物: 將600 μL 1.0 mg/mL HRP加入1.5 mL HEPES緩沖溶液(50 mmol/L,pH 9.3)中,室溫超聲5 min;將混合物用3.0 mol/L HCl調(diào)節(jié)至pH 7.3,將15 mg NHS和20 mg EDC加入到上述溶液中,室溫攪拌45 min;將600 μL 5.0 mg/mL 酪胺溶液逐滴滴加到上述溶液,得到的混合溶液在室溫下攪拌12 h;將混合溶液離心10 min,用蒸餾水洗滌兩次,得到HRP/酪胺復合物;將其超聲分散到500 μL PBS緩沖溶液(0.1 mol/L,pH 7.4)中,于4℃避光儲存。

    2.4.3?比色法檢測AFP?具體步驟如下: (1)20 μL 0.1 mg/mL AFP一抗(Ab1)加入到96微孔板中,在4℃條件下過夜,用洗滌液洗滌未吸附在微孔板上的Ab1,室溫下加入20 μL 封閉液,靜置2 h,封閉非特異性吸附位點,再用洗滌液洗滌;(2)20 μL不同濃度的AFP抗原加入微孔板中,室溫下孵育1 h后洗滌;(3)20 μL HRP/AuNPs/Ab2復合物加入到上述溶液中,室溫下孵育1 h后,洗滌;(4)室溫下,依次將H2O2(5 μL,2 mmol/L)和酪胺/HRP復合物(10 μL)加入微孔板中,放置1 h后,洗滌;(5)將20 μL 10 μg/mL g-C3N4、100 μL醋酸緩沖溶液(0.4 mol/L,pH 3.0)和20 μL 500 μmol/L TMB加入微孔板中,置于氙燈(≥ 400 nm)下照射15 min,測定652 nm處的吸光度數(shù)值。

    3?結(jié)果與討論

    3.1?g-C3N4的表征

    由圖1A可知,g-C3N4具有石墨烯類似結(jié)構(gòu)和不規(guī)則折疊狀片層結(jié)構(gòu),尺寸約為1.5~2.5 μm。所合成的g-C3N4有兩個明顯的吸收峰,在(002)方向上,27.7°處的強峰為g-C3N4結(jié)構(gòu)中石墨層間堆積吸收峰;在(100)方向上,13.02°處的弱衍射峰為周期性的平面結(jié)構(gòu)衍射峰[13]。與大塊g-C3N4相比[10],27.5°處的衍射峰強移動到27.7°,表明納米層狀結(jié)構(gòu)合成成功;13.02°處的峰變?nèi)?,表明石墨層的平面尺寸變小(圖1B)。如紅外光譜(FT-IR)(圖1C)所示,在3000和3600 cm1處的寬吸收峰為NH和OH的伸縮振動峰,1000和1800 cm1處的吸收峰為CN雜環(huán)的伸縮振動峰,811 cm1處的吸收峰為三嗪環(huán)振動峰。由于g-C3N4表面富含OH、NH等親水基團,使其具有良好的水溶性。圖1D為g-C3N4的紫外-可見吸收光譜,在測試條件下,由于濃度較小,可見光區(qū)吸收不明顯。在785 nm激發(fā)光下,g-C3N4在702和1231 cm1有典型的拉曼峰(圖1E)。量子局限效應使得導帶和價帶向相反的方向移動[14],導致熒光發(fā)射峰由大塊g-C3N4的449 nm[15]藍移至440 nm(圖1F)。所制備的g-C3N4具有熒光性質(zhì),說明其具有光誘導電子激發(fā)/轉(zhuǎn)移特性,具有光活性。

    3.2?可見光照射g-C3N4活化HRP及其機理

    在沒有H2O2的條件下,g-C3N4經(jīng)可見光照射可活化HRP。如圖2所示,通過對比實驗發(fā)現(xiàn),不光照的g-C3N4或光照條件下的HRP,均不能明顯地氧化TMB;而光照下的g-C3N4對TMB的氧化效果也較弱;只有光照條件下g-C3N4和HRP的混合物才能催化氧化TMB,使溶液變成藍色。研究發(fā)現(xiàn),納米材料可產(chǎn)生多種活性中間體[4,5](如·OH、H2O2、O·2和h+等)活化HRP。據(jù)此推斷,在可見光照射下,g-C3N4通過產(chǎn)生某些活性中間體活化HRP,使其表現(xiàn)出催化氧化TMB的效果。

    為進一步闡明光照條件下g-C3N4活化HRP的機制,本研究引入了活性中間體的捕獲劑,探究各種活性物質(zhì)對體系催化氧化活性的影響。例如,叔丁醇(TBA)和異丙醇(IPA)可捕獲·OH[16],乙二胺四乙酸(EDTA)和KI可捕獲h+ [17],超氧化物歧化酶(SOD)可捕獲O·2[18],過氧化氫酶(CAT)可催化分解H2O2生成水和氧氣。如圖3A所示,與不含捕獲劑相比,加入KI和SOD清除劑后,催化反應被抑制,可知h+和O·2是主要的活性成分。由光電化學實驗結(jié)果可知,g-C3N4具有光誘導電子轉(zhuǎn)移特性,在可見光開/關循環(huán)照射下,可產(chǎn)生光電流(圖3B)。通過線性掃描測得g-C3N4的導帶電位為1.13 V(相對于飽和Ag/AgCl,圖3C),此電位比氧氣的還原電位(0.046 V vs NHE[19])更負。因此,可見光照射g-C3N4半導體,使得光生電子由價帶躍遷至導帶,導帶上的電子還原溶解氧,產(chǎn)生O·2,進而活化HRP;而價帶產(chǎn)生的h+可直接氧化HRP,將其轉(zhuǎn)化為活化狀態(tài),進而氧化底物TMB[2]。

    通過光照的有無可調(diào)控g-C3N4/HRP的催化活性。如圖3D所示,在光照條件下,oxTMB的吸光度明顯增加;在無光照時,吸光度變化較小。停止光照射后,酶催化反應在很大程度上被抑制,這可能是活性中間體(O·2 和 h+)在酸性環(huán)境中壽命短[2]所致。相對于常規(guī)HRP體系通過加入濃H2SO4引起酶的變性以終止酶催化反應,本研究體系通過打開或關閉可見光源即可方便地調(diào)控HRP的活性。

    考察了g-C3N4活化HRP的實驗中,光照時間和HRP的濃度對催化效果的影響。如圖4A所示,g-C3N4/HRP起始反應速率較快,隨著光照時間延長,反應趨于平衡;如圖4B所示,固定g-C3N4的量,g-C3N4/HRP催化氧化TMB的效果隨著HRP量的增加而增強,表明體系的氧化能力與HRP的量有直接關系。

    反應體系的pH值和反應溫度都會影響g-C3N4/HRP的催化活性。由圖5可知,g-C3N4/HRP催化體系的最適pH值和溫度分別為pH 3.0和30℃。而常規(guī)HRP催化體系(以H2O2為活性激發(fā)物質(zhì))的最優(yōu)pH值和溫度分別為pH 3.0和40℃。

    進一步探究了g -C3N4/HRP體系的催化動力學特征。動力學參數(shù)由米氏方程的雙倒數(shù)曲線υ= Vmax[S]/Km+[S]獲得(其中,υ代表催化反應的初始速率,υmax代表最大反應速率,[S]和Km分別代表底物濃度和米氏常數(shù))。如圖6所示,計算得g-C3N4/HRP體系的Km=100 μmol/L,比HRP的Km(434.0 μmol/L[20])小,表明g-C3N4/HRP對底物TMB的親和力比HRP(以H2O2為活性激發(fā)物質(zhì))高。

    3.3?基于g-C3N4活化HRP的免疫分析方法檢測AFP

    基于光照條件下g-C3N4可活化HRP,并利用TSA 技術[21]增大表面所固定的信號分子HRP的量,實現(xiàn)了AFP的檢測,原理如圖7所示,此夾心型免疫傳感器利用附著于96孔板的一抗(Ab1)捕獲目標物AFP,然后添加表面固定了二抗(Ab2)與HRP的金納米粒子(即Ab2-AuNPs-HRP復合物),并通過酪胺和HRP的結(jié)合作用繼續(xù)捕獲合成的HRP-酪胺重復單元[21],實現(xiàn)信號放大。在可見光照射下,加入的g-C3N4激發(fā)HRP活性,催化氧化特征底物TMB產(chǎn)生檢測信號。通過實驗可驗證由TSA技術形成的HRP-酪胺重復單元可放大檢測信號。如圖8所示,無TSA時,檢測信號低;有TSA時,檢測信號增強。兩者存在明顯差別,說明形成的HRP-酪胺重復單元可放大檢測信號。

    在最佳實驗條件下,對所建立的新型免疫傳感器檢測AFP的性能進行了研究。由圖9可知,體系的吸光度值與目標物AFP濃度的對數(shù)之間存在線性關系,線性范圍為0.5 pg/mL~0.1 μg/mL,線性方程為y=0.071x(ng/mL)+0.277,R2=0.995,檢出限為0.17 pg/mL (S/N=3)。與報道的AFP檢測方法(表1)對比可知,本方法的檢出限較低,具有較高的靈敏度。

    選擇了一些陽離子(如K+、Na+、Zn2+、Mg2+、Ca2+)及與AFP性質(zhì)相似的干擾物質(zhì)(如人血清白蛋白(HSA)、色氨酸(Trp)、丙氨酸(Ala)、免疫球蛋白(人IgG、鼠IgG)、癌胚抗原(CEA)、前列腺抗原(PSA)),考察了本方法的選擇性。 如圖10所示,在相同的測定條件下,干擾物只產(chǎn)生較小的吸光度變化,表明本方法具有較好的選擇性。

    3.4?人血清中AFP的檢測

    將本方法應用于人血清樣品中AFP的檢測,結(jié)果如表2所示。測得人血清樣品中AFP的含量為1.58 ng/mL,不同水平AFP的加標回收率為94.3%~101.3%,表明本方法可用于實際血清樣品中AFP的檢測。

    4?結(jié) 論

    在可見光照射下,g-C3N4納米片可活化HRP,使HRP在沒有H2O2存在時催化氧化TMB。基于此原理,結(jié)合TSA技術,本研究建立了比色法檢測AFP的新型免疫分析方法,實現(xiàn)了AFP的超靈敏檢測。

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