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    多層紙芯片培養(yǎng)體系研究外泌體介導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞-肺成纖維細(xì)胞相互作用

    2020-07-04 02:10林諄陳曉林冬果劉大漁
    分析化學(xué) 2020年6期
    關(guān)鍵詞:乳腺癌

    林諄 陳曉 林冬果 劉大漁

    摘?要?采用多層紙芯片共培養(yǎng)體系研究了外泌體介導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞-肺成纖維細(xì)胞相互作用。多層紙芯片體系包含接種乳腺癌細(xì)胞成份的腫瘤層,接種肺成纖維細(xì)胞的招募層,以及上述兩層之間的侵襲層。疊加多層紙芯片形成包含乳腺癌細(xì)胞和肺成纖維細(xì)胞的三維共培養(yǎng)體系,而拆解多層紙芯片則逐層檢測細(xì)胞,因而可以從時間和空間角度解析細(xì)胞間相互作用。研究了在腫瘤層接種乳腺癌細(xì)胞或固定乳腺癌細(xì)胞來源的外泌體,發(fā)現(xiàn)二者同樣可以誘導(dǎo)招募層的肺成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞。之后,在招募層種植外泌體誘導(dǎo)的腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞,其顯示出較原生細(xì)胞更強的乳腺癌細(xì)胞招募作用。研究結(jié)果表明,轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的形成主要在于腫瘤外泌體介導(dǎo)的宿主器官成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化,而宿主器官微環(huán)境的改變反之招募腫瘤細(xì)胞定向遷移。

    關(guān)鍵詞?紙芯片;乳腺癌;成纖維細(xì)胞;外泌體;共培養(yǎng);轉(zhuǎn)移前微環(huán)境

    1?引 言

    腫瘤轉(zhuǎn)移具有明顯的器官選擇性[1,2],其中一個重要原因在于腫瘤細(xì)胞與宿主器官之間存在信息交流,從而引發(fā)宿主器官形成轉(zhuǎn)移前微環(huán)境,后者促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移性種植[3,4]。近期的大量研究顯示,外泌體是腫瘤細(xì)胞與外界進(jìn)行信息交流的重要媒介[5]。外泌體來源于細(xì)胞內(nèi)溶酶體微粒內(nèi)陷形成的多囊泡體,經(jīng)多囊泡體外膜與細(xì)胞膜融合后釋放到胞外基質(zhì)中,其成分包含復(fù)雜RNA和蛋白質(zhì)。外泌體在腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用,尤其是可以改造遠(yuǎn)端臟器細(xì)胞,進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞遷移和定植[6]。因而,研究外泌體介導(dǎo)的腫瘤定向遷移對于腫瘤轉(zhuǎn)移機制和轉(zhuǎn)移干預(yù)研究具有重要價值。鑒于播散的腫瘤細(xì)胞中只有少部分能夠在轉(zhuǎn)移前微環(huán)境中存活并形成腫瘤[7,8],通過宏觀水平解析外泌體介導(dǎo)的腫瘤遷移具有極大的難度。因此,迫切需要發(fā)展能夠以簡單的手段研究外泌體介導(dǎo)的腫瘤-遠(yuǎn)端臟器的動態(tài)相互作用的腫瘤轉(zhuǎn)移模型。

    目前,用于研究腫瘤轉(zhuǎn)移的模型主要包括動物水平和細(xì)胞水平兩類。相較于動物模型,細(xì)胞水平腫瘤轉(zhuǎn)移模型能夠更直接和清晰地反映細(xì)胞遷移行為[9~13]。例如,經(jīng)典的Transwell實驗是利用包含多孔薄膜的裝置檢測腫瘤細(xì)胞的跨膜遷移行為。然而,Transwell實驗有一些限制,包括使用二維培養(yǎng)細(xì)胞,不能仿真腫瘤細(xì)胞的體內(nèi)結(jié)構(gòu)形式;由于擴散效應(yīng),跨膜化學(xué)環(huán)境差別難以長期維持;無法研究腫瘤細(xì)胞在遷移過程中的動態(tài)變化。鑒于外泌體介導(dǎo)的腫瘤-遠(yuǎn)端臟器動態(tài)相互作用是一個長期過程,因而,相關(guān)研究需要一種既可長時間保持微環(huán)境穩(wěn)定性,又能夠動態(tài)解析細(xì)胞-微環(huán)境相互作用的研究工具。

    紙基微流控芯片是構(gòu)建細(xì)胞仿生環(huán)境的有利工具。紙是一種具有多孔結(jié)構(gòu)的生物兼容性材料,可作為支架實現(xiàn)三維細(xì)胞長期培養(yǎng)[14,15]。此外,借助于圖形化加工獲得的紙芯片可以實現(xiàn)多區(qū)域細(xì)胞培養(yǎng),能夠?qū)崿F(xiàn)高通量細(xì)胞分析[16~18]。紙芯片可以進(jìn)一步疊加,構(gòu)建更為復(fù)雜的細(xì)胞培養(yǎng)體系。這類多層紙芯片被嘗試用于腫瘤細(xì)胞-微環(huán)境相互作用研究,并顯示出獨特的優(yōu)勢:可以將含有不同微環(huán)境組分的紙張堆疊起來,充分再現(xiàn)微環(huán)境的復(fù)雜性[14,16];多層疊紙結(jié)構(gòu)允許信號分子的交流,并能長期保持化學(xué)濃度梯度[19,20]。這種非血管結(jié)構(gòu)可以簡便地形成復(fù)雜的化學(xué)濃度梯度,為細(xì)胞相互作用研究提供有利條件;拆分多層疊紙結(jié)構(gòu)可以將從特定層回收的細(xì)胞對應(yīng)遷移過程中的特定階段,有助于從時間和空間角度解析細(xì)胞-微環(huán)境相互作用。基于以上優(yōu)點,多層紙芯片培養(yǎng)體系是研究外泌體介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞-微環(huán)境相互作用的有力工具。

    本研究設(shè)計了一種多層紙芯片培養(yǎng)體系,用于研究外泌體介導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞-肺成纖維細(xì)胞相互作用。多層紙芯片由腫瘤層、侵襲層和招募層組成,其中,腫瘤層接種乳腺癌細(xì)胞或固定乳腺癌細(xì)胞來源外泌體,招募層接種肺成纖維細(xì)胞,侵襲層將這兩層分隔。疊加多層紙芯片形成包含乳腺癌細(xì)胞和肺成纖維細(xì)胞的三維共培養(yǎng)體系,而拆解多層紙芯片則可以逐層檢測細(xì)胞。利用此多層紙芯片工具,分析共培養(yǎng)體系內(nèi)不同層面上細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能,從時間和空間角度解析外泌體介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞-宿主器官相互作用。

    2?實驗部分

    2.1?儀器與試劑

    Optima XPN-80 超速離心機(美國Beckman公司);SZ-100Z納米顆粒分析儀 (法國HORIBA公司);JEM-1400plus掃描電鏡(日本JEOL公司);IX71倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司);Ti-E A1共聚焦顯微鏡(日本Nikon公司)。

    PBS、DMEM 培養(yǎng)基、0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液、細(xì)胞核染料DAPI、鈣黃綠素/AM(Calcein/AM)、鬼筆環(huán)肽(Phalloidin)(美國Thermo Fisher公司);α-SMA一抗、Vimentin一抗(美國Abcam公司);FITC熒光標(biāo)記二抗(武漢博士德公司);胎牛血清(美國Sigma公司);多聚甲醛、海藻酸鈉(上海生工公司);CaCl2(羅恩公司);BCA試劑盒(江蘇碧云天公司);人肺成纖維細(xì)胞株HLFs來自中山大學(xué);乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231和MDA-MB-453來自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所。

    2.2?紙芯片的加工

    紙芯片使用Whatman 105擦鏡紙以蠟染方法加工[21]。單張紙芯片尺寸為8 cm×3 cm,包含10個蠟染疏水屏障封閉的圓形親水區(qū),親水區(qū)直徑8 mm,間隔8 mm。圖形化紙片在150℃下烘烤10~15 s,將蠟融化并滲透到紙全層。之后,紙片在乙醇浴中消毒30 min,在層流罩中經(jīng)紫外線照射后,風(fēng)干。

    2.3?細(xì)胞培養(yǎng)

    人乳腺癌MDA-MB-231和MDA-MB-453細(xì)胞、HLFs用DMEM完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清),在37℃、5% CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)?;厥盏募?xì)胞重懸于含2%海藻酸鈉的DMEM培養(yǎng)基中,備用。

    2.4?外泌體的提取與鑒定

    培養(yǎng)至第三天,收集乳腺癌細(xì)胞培養(yǎng)液,500 r/min離心10 min,取上清液,12000 r/min離心20 min,去除凋亡小體和細(xì)胞碎片,上清液以120000 r/min離心70 min,獲得外泌體。將外泌體用20 mL PBS清洗后,再次超速離心,收集的外泌體用PBS重懸,進(jìn)行掃描電鏡檢測,并用納米粒子分析儀進(jìn)行粒徑分析。使用BCA試劑盒測定外泌體濃度。

    2.5?外泌體處理肺成纖維細(xì)胞

    HLFs以50000細(xì)胞/孔的密度接種于六孔板中,每孔添加10 μg/mL 乳腺癌細(xì)胞來源外泌體。每3天補充1次培養(yǎng)基。

    2.6?多層紙芯片共培養(yǎng)體系的構(gòu)建

    紙芯片上的細(xì)胞培養(yǎng)步驟:(1)將細(xì)胞重懸于2%海藻酸鹽-DMEM溶液,以106細(xì)胞/mL密度接種于紙芯片親水區(qū),每個區(qū)域約5000個細(xì)胞;(2)向接種區(qū)加入40 mmol/L CaCl2溶液,靜置2 min,形成海藻酸鈣凝膠;(3)接種細(xì)胞的紙芯片置于含DMEM的培養(yǎng)皿中,于5% CO2培養(yǎng)箱中37°C孵育過夜;(4)將各層紙芯片按照順序組裝。如圖1所示,多層紙芯片培養(yǎng)體系包含腫瘤層、侵襲層和招募層。腫瘤層接種MDA-MB-231和MDA-MB-453乳腺癌細(xì)胞或上述細(xì)胞來源的外泌體,招募層接種HLFs,兩層之間由侵襲層隔開,親水區(qū)域為不含細(xì)胞的海藻酸鈣凝膠。此外,招募層和鄰近的侵襲層之間插入一層PC膜,防止腫瘤細(xì)胞進(jìn)入招募層。多層紙芯片由定制的聚四氟乙烯夾板固定。組裝完成后,多層紙芯片頂層夾板的開孔處加入DMEM溶液,裝置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng),每天換液。

    2.7?芯片上的細(xì)胞檢測

    培養(yǎng)3天后,拆卸紙芯片裝置,將每層紙芯片各置于單獨的培養(yǎng)皿中,以PBS清洗2遍,37℃下Calcein-AM 染色孵育10 min。紙芯片置于倒置顯微鏡下拍攝,熒光圖像用Image J軟件分析。細(xì)胞分布計算公式為Fi/Ft×100%,其中,F(xiàn)i為某層某親水區(qū)的熒光強度,F(xiàn)t為各層同一位置親水區(qū)熒光強度之和。

    2.8?細(xì)胞免疫熒光分析

    拆解的單層紙芯片置于培養(yǎng)皿中,以4%多聚甲醛固定,室溫孵育20 min,以PBS沖洗3次后,用4% BSA封閉。招募層紙芯片細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)用抗α-SMA 一抗(1:500稀釋) 和抗 Vimentin一抗 (1∶500 稀釋)于4℃孵育12 h,再用FITC二抗標(biāo)記,37℃孵育1 h。細(xì)胞核用1 μg/mL DAPI染色。紙芯片用PBS沖洗3次后,置于共聚焦顯微鏡下拍攝,熒光圖片用Image J軟件分析。

    3?結(jié)果與討論

    3.1?多層紙芯片培養(yǎng)體系的構(gòu)建

    為研究外泌體介導(dǎo)的腫瘤-遠(yuǎn)端臟器動態(tài)相互作用,構(gòu)建了一種多層紙芯片培養(yǎng)體系。多層紙芯片培養(yǎng)體系的優(yōu)勢在于既可通過組裝獲得包含復(fù)雜微環(huán)境的培養(yǎng)體系,又可通過拆解獲得每個層面上的細(xì)胞信息。本研究設(shè)計的多層紙芯片的每層含有10個親水區(qū)域,因而允許進(jìn)行平行的細(xì)胞-微環(huán)境相互作用研究。多層紙芯片培養(yǎng)體系包含腫瘤層、侵襲層和招募層(圖2),并在招募層和鄰近侵襲層之間插入一層多孔PC膜,以防止侵襲層和招募層之間的細(xì)胞串?dāng)_。

    將這種多層紙芯片共培養(yǎng)體系用于外泌體介導(dǎo)的乳腺癌-肺相互作用研究。多層紙芯片體系中,接種乳腺癌細(xì)胞的腫瘤層模擬原發(fā)乳腺癌,接種HLFs的招募層模擬肺,兩層之間的數(shù)層侵襲層模擬腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移途徑。完成培養(yǎng)后,將多層紙芯片拆解,不同層面紙芯片對應(yīng)細(xì)胞遷移的不同階段。逐一分析不同層面上細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能,可以從時間和空間角度解析外泌體介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞-宿主器官相互作用。侵襲層中出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞是腫瘤遷移的證據(jù),由培養(yǎng)條件對腫瘤遷移的影響可以獲知微環(huán)境因素在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮的作用。

    這種多層紙芯片培養(yǎng)體系為研究外泌體介導(dǎo)的研究乳腺癌細(xì)胞-HLFs相互作用提供了有利的工具:一方面,將乳腺癌細(xì)胞來源外泌體固定于腫瘤層,觀察其對HLFs的轉(zhuǎn)化作用;另一方面,在招募層種植外泌體誘導(dǎo)的腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞,觀察其對乳腺癌細(xì)胞招募作用。借助于多層紙芯片培養(yǎng)體系,從時間和空間角度解析外泌體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的形成及其對腫瘤轉(zhuǎn)移的影響。

    3.2?紙芯片上的乳腺癌細(xì)胞與肺成纖維細(xì)胞的共培養(yǎng)

    將乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-231和MDA-MB-453)置于腫瘤層,將HLFs置于招募層,將芯片組裝后培養(yǎng)。為了更好地模擬體內(nèi)條件,將腫瘤層置于底層缺氧環(huán)境,將招募層置于頂層富氧環(huán)境。共培養(yǎng)結(jié)束后,拆解多層紙芯片,用死/活細(xì)胞熒光染色標(biāo)記各層紙上的細(xì)胞。結(jié)果表明,不同紙層上的細(xì)胞活性良好(圖3A)。

    與單獨培養(yǎng)相比,乳腺癌細(xì)胞-HLFs共培養(yǎng)條件下HLFs細(xì)胞活性無明顯變化(圖3B),而乳腺癌細(xì)胞的活性則有所提高(圖3C)。此結(jié)果表明,多層紙芯片不僅能夠提供充足的氧氣和養(yǎng)分,還可通過細(xì)胞間相互作用提高腫瘤細(xì)胞的活性。

    3.3?乳腺癌細(xì)胞來源的外泌體激活肺成纖維細(xì)胞

    研究了多層紙芯片共培養(yǎng)體系中腫瘤層和招募層細(xì)胞之間的相互作用。與文獻(xiàn)[22]報道相似,本研究同樣觀察到腫瘤細(xì)胞通過旁分泌效應(yīng)促進(jìn)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變成腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞。在紙芯片共培養(yǎng)體系中,將腫瘤層置于中間層(L3),招募層位于頂層(L6),在共培養(yǎng)不同時間后,檢測HLFs的波形蛋白(Vimentin)的表達(dá)情況。與不同乳腺癌細(xì)胞共培養(yǎng)的兩組實驗中,HLFs中波形蛋白表達(dá)隨培養(yǎng)時間延長而增加(圖4)。此結(jié)果表明,原發(fā)癌灶的腫瘤細(xì)胞參與宿主器官轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的形成,而此過程具有時間依賴性。

    鑒于外泌體是腫瘤細(xì)胞與其它細(xì)胞信息交流的一個重要途徑[23],進(jìn)一步研究了外泌體在肺成纖維細(xì)胞向腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮的作用。制備并確認(rèn)了乳腺癌細(xì)胞來源外泌體(圖5A),并將純化得到的外泌體固定在多層紙芯片的腫瘤層,與HLFs共培養(yǎng)。免疫熒光檢測結(jié)果表明,培養(yǎng)后的HLFs中,波形蛋白和α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)表達(dá)均增高(圖5B),說明外泌體誘導(dǎo)了HLFs轉(zhuǎn)變成CAFs。因此,可以認(rèn)為外泌體的傳輸是形成腫瘤轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的一個重要途徑,其主要作用在于誘導(dǎo)腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的形成。

    3.4?腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞定向遷移

    為了研究來自宿主器官的招募效應(yīng)對乳腺癌細(xì)胞的影響,檢測了向招募層轉(zhuǎn)移的乳腺癌細(xì)胞數(shù)量。將腫瘤層置于底層(L2),招募層置于頂層(L6)。利用Calcein-AM染色檢測各層的細(xì)胞密度,進(jìn)而表征細(xì)胞在共培養(yǎng)體系中的分布情況。MDA-MB-231和MDA-MB-453細(xì)胞都向招募層遷移,侵襲層的細(xì)胞密度顯示招募作用的強弱。實驗發(fā)現(xiàn),大部分乳腺癌細(xì)胞都轉(zhuǎn)移至第4層和第5層。與HLFs共培養(yǎng)時,有40.97%±6.56% 的MDA-MB-453 細(xì)胞和19.86%±2.57% MDA-MB-231細(xì)胞遷移到侵襲層;與CAFs共培養(yǎng)時,MDA-MB-453細(xì)胞的遷移比例增長到62.97%±4.95%,而 MDA-MB-231細(xì)胞提高到44.97%±2.74%(圖6)。細(xì)胞遷移結(jié)果表明,CAFs在促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移過程中起著重要的作用,而CAFs又是由外泌體誘導(dǎo)HLFs形成。由此得出,在腫瘤的轉(zhuǎn)移過程中,腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體誘導(dǎo)HLFs轉(zhuǎn)變成CAFs,形成轉(zhuǎn)移前微環(huán)境;CAFs招募腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移至宿主器官。因此,多層紙芯片的共培養(yǎng)體系是研究腫瘤細(xì)胞和宿主器官細(xì)胞相互作用的有力工具。骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肝細(xì)胞等其它細(xì)胞也可置于招募層,利用多層紙芯片模型可研究腫瘤不同器官定向遷移的機制。

    4?結(jié) 論

    設(shè)計的多層紙芯片共培養(yǎng)體系具有以下特性: 便于加入不同類型的細(xì)胞用于研究腫瘤與宿主遷移的相互作用;基于紙層堆疊形成的共培養(yǎng)方法能夠模擬體內(nèi)微環(huán)境;拆解多層紙芯片允許從時間和空間上研究細(xì)胞間相互作用。基于以上優(yōu)勢,這種多層紙芯片共培養(yǎng)體系是腫瘤器官傾向性轉(zhuǎn)移機制研究的有利工具。利用此多層紙芯片共培養(yǎng)體系研究了外泌體介導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞-HLFs相互作用。一方面,乳腺癌細(xì)胞分泌外泌體誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞;另一方面,外泌體誘導(dǎo)產(chǎn)生的腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞反過來招募乳腺癌細(xì)胞?;诙鄬蛹埿酒才囵B(yǎng)體系的細(xì)胞相互作用,研究證實了原位腫瘤細(xì)胞可通過外泌體誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的形成,從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的定向遷移。

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